הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60255

⸱

20 בספטמבר 2019

 ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

תקציר

לחיות הדמיה בזמן התמונה התמונה הוא כלי חשוב בביולוגיה התא המספק תובנה תהליכים סלולריים שעלולים להתעלם אחרת, לא מובנת, או שלא כהלכה על ידי ניתוח תא קבוע. בעוד הדמיה תא קבוע ניתוח הוא חזק ומספיק כדי להתבונן הסלולר המצב הנייד, זה יכול להיות מוגבל בהגדרת סדר הזמן של אירועים ברמה התאית והוא חולה להעריך את האופי הארעי של תהליכים דינמיים כולל התקדמות mitotic. לעומת זאת, הדמיה של תא חי היא כלי רהוט שניתן להשתמש בו כדי להתבונן בתהליכים סלולריים ברמה של תא בודד לאורך זמן ויש לו את היכולת ללכוד את הדינמיקה של תהליכים שאחרת היו מיוצגים בצורה גרועה בהדמיית תא קבוע. כאן אנו מתארים גישה כדי ליצור תאים הנושאים מסמנים התווית של כרומטין ו microtubules ואת השימוש שלהם בגישות הדמיה של תא חי כדי לפקח על יישור כרומוזום מטאפיפאסיים ויציאה mitotic. אנו מתארים טכניקות מבוססות הדמיה כדי להעריך את הדינמיקה של היווצרות ציר והתקדמות mitotic, כולל זיהוי של תאים בשלבים שונים מיטוזיס, זיהוי ומעקב של פגמים mitotic, ניתוח הדינמיקה ציר ו mitotic הגורל התא בעקבות הטיפול עם מעכבי mitotic.

מבוא

ניתוח מבוסס תמונה של תאים קבועים משמש בדרך כלל להערכת השינויים ברמת האוכלוסייה התאית בתגובה לרטבאליות שונות. בשילוב עם סנכרון תאים, ואחריו אוסף והדמיה של נקודות זמן טוריות, ניתן להשתמש בגישות כאלה כדי להציע רצף אירועים תאי. עם זאת, הדמיה סלולרית קבועה מוגבלת ביחסים הזמני משתמעת לאוכלוסיה ולא הפגינו ברמה של תאים בודדים. בדרך זו, בעוד הדמיה תא קבוע ניתוח מספיק כדי לבחון פנוטיפים חזקים ושינויים במצב יציב, היכולת לזהות שינויים זמניים לאורך זמן ושינויים המשפיעים רק על אוכלוסיית התאים הוא לא מושלם. לעומת זאת, הדמיה של תאים חיים היא כלי רהוט שניתן להשתמש בו כדי להתבונן בתהליכים סלולריים ומשניים בתוך תא אחד, או באוכלוסיית הסלולר, לאורך זמן וללא סיוע של גישות סנכרון העלולות להשפיע על עצמם על התנהגות תאית מיכל בן , מיכל השני , מיכל שלוש , ד , מיכל 5 , . שישה מטרים

היווצרות של ציר דו קוטבית mitotic הוא חיוני עבור ההפרדה כרומוזום הנכון במהלך חלוקת התא, וכתוצאה מכך שתי תאים מבחינה גנטית ביתי. פגמים במבנה mitotic ציר כי מושחתים mitotic התקדמות ולהתפשר על נאמנות של הפרדה כרומוזום יכול לגרום לדיוויזיות תאים קטסטרופלי ויכולת הכדאיות של תאים מופחתת. מסיבה זו, mitotic רעלים שמשנים את היווצרות הצירים מבטיחים therapeutics להגביל את ההתפשטות המהירה של תאים סרטניים7,8,9. עם זאת, ניתוח תאים קבוע של מבנה הצירים בעקבות הוספת רעלים mitotic מוגבל ביכולתה להעריך את התהליך הדינמי של היווצרות צירים ואינו יכול לציין אם שינויים שנצפו במבנה הצירים הם קבועים או מ במקום ארעי וניתן להתגבר על מנת לאפשר חלוקת תאים מוצלחת.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה כדי להעריך את הדינמיקה של מיטוזיס רטבאליות בעקבות הדמיה של תאים חיים. שימוש בשורה hTERT מונצח-1 קו התא ההונדסים לבטא RPE-מתויג Histone 2B כדי להמחיש כרומטין, יחד עם EGFP-מתויג α-טובולין כדי להמחיש microtubules, את העיתוי של יישור כרומוזום מטאפיאט, אנאפיום התחלתה, ובסופו של דבר mitotic הגורל התאים מוערך באמצעות רמזים חזותיים של תנועת כרומוזום, compaction, מורפולוגיה גרעינית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הדור של hTERT-RPE-1 תאים באופן בלתי נשכח RPE-Histone 2B (RPE-H2B) ו-α-טובולין-EGFP (אמבטיה-EGFP)

הערה: כל השלבים לעקוב אחר טכניקות אספטי ולהתקיים ברמת בטיחות II + (BSL2 +) בטיחות ארון.

  1. ליצור רטרו וירוס נושאת את הגנים של עניין (α-טובולין-EGFP ו-RFP-H2B) על ידי העברת הקשר של תאים 293T עם הפלסטיק המתאים הפלגידים על פי הוראות היצרן של המערכת המבוססת על מערכת העברת שומנים.
    1. יום 1: השימוש זכוכית חד פעמית פסטר הצינורות כדי לטפי את המדיום תרבות התא מלוח של תת-confluent 293T תאים ולשטוף את המדיום שיורית עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) על ידי הוספת 5 מ ל של PBS. מערבולת כדי לפזר את ה-PBS בתחתית הצלחת, ולאחר מכן לבשל את ה-PBS עם משקה מזכוכית סטרילי חד פעמית של פסטר.
    2. להוסיף 2 מ ל 0.05% טריפסין שכבר מחומם מראש ל 37 ° c ולהחזיר את הצלחת לתוך החממה מחולל לחות ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 2 כדי 5 דקות כדי לאפשר לתאים חסיד להשתחרר ממשטח הכלים של התרבות התא.
    3. הוסף 8 מ ל של מדיום הנשר החדש של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום בפרה העובר (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין לצלחת המכילה טריפסין.
    4. השהה את התאים מחדש על ידי ליטוף בעדינות והעבר את ההשעיה לצינורית חרועה בעלת 15 מ"ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.
    5. משלחים את התמיסה המדיום/טריפסין מתאי הפלטד ומשהה מחדש את התאים ב-10 מ ל בתוספת של 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. השתמש הומוציטוטומטר כדי לספור את ההשעיה של התא 293T ואת צלחת 2 x 106 293t תאים לכל באר של 6 צלחת הבאר.
    6. תאים התרבות בנפח כולל של 2 מ ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ולתחזק החממה לחות בתוך 37 ° c עם 5% CO2.
    7. יום 2: פיפטה 7 μL של משלוח השומנים המבוסס על מסירה מגיב ו-100 μL של בינוני סרום מופחת לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולאפשר את זה כדי דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות (צינור #1).
    8. במבחנה נפרדת 1.5 mL, פיפטה 1 μg של RFP-H2B ביטוי וקטור (או 1 μg של α-טובולין-EGFP ביטוי וקטור), יחד עם 5 משפר μL מגיב (כנדרש לכל יצרן של הנחיות), 0.5 μg pMD2. G, ו 1 μg psPAX2 ו 100 μL של מופחת סרום בינוני (צינור #2).
    9. לשלב את התוכן של צעד 1.1.7 ו1.1.8 צעד על ידי שפופרת ליטוף בזהירות #2 לתוך צינור ה#1 ו-דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן לשנות את התגובה בהתאם לצורך העברה של תאים בבארות נוספות.
    10. פיפטה התגובה הטרנספופית לתוך הטוב הרצוי המכיל תאים 293T 2 מ ל של בינוני ולהחזיר את הצלחת לתוך החממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.
      הערה: כדי ליצור תאים המבטאים הן RFP-H2B ו-α-טובולין-EGFP, ליצור וירוס נפרד עבור כל ביטוי לבנות (שלבים 1.1.7-1.1.9).
    11. יום 3: מנושף ומחליף את המדיום עם 2 מ ל של Dמאמ טרי שיושלם עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. להחזיר את הצלחת לתוך החממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.
  2. יום 4: לאסוף את המדיום המכיל חלקיקי וירוס ביטא, להיות זהירים לא לשבש או להסיר תאים 293T. סנן את המדיום המכיל חלקיקי וירוס על-ידי העברתו דרך מסנן μM 0.45 מוצמד למזרק של 5 מ"ל. וירוס הורדה לאחסון לטווח קצר ב 4 ° c, או אחסון לטווח ארוך ב-80 ° c.
    הערה: חלקיקים ויראליים המתקבלים באופן זה יהיו נוכחים בטווח של ~ 1 x 107 כדי 1 x 108 התמרה יחידות/mL. כמו התאים המייצרים ויראלי תאים להיות נגועים הן מתרבות באותו בינוני, ריכוז נגיפי להחליף את המדיום הוא לא נדרש חלקיקים ויראלי מסוננים ניתן להשתמש ישירות כדי להדביק תאים.
  3. הזרע 2 x 105 htert-rpe-1 תאים לכל טוב של מאכל 6-טוב לקראת הזיהום ויראלי. התאים התרבותיים ב 2 מ ל של DMEM שיושלם עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ולתחזק בחממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.
  4. יום 5: הוספת הקסאדימראן ברומיד (לדוגמה, polybrene) אל hTERT-RPE-1 תאים לריכוז הסופי של 8 μg/mL. להדביק תאים עם תערובת של 500 μL של וירוס מדולל ב 500 μL של תרבות התא בינונית.
    הערה: מניות הקסאדיהמרין מוכנות לפתרון מלאי סטרילי במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן מסוננים באמצעות פילטר 0.45 יקרומטר.
  5. יום 6: באמצעות משקה זכוכית חד פעמית פסטר, מרוב המדיום מבארות המכילות את התאים הנגועים בווירוס. החלף את מדיום תרבות התא עם 2 מ ל של DMEM המכיל 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, וריכוזים המתאים של אנטיביוטיקה כדי לבחור עבור שילוב וביטוי פלסמיד.
    הערה: הביטוי α-טובולין-EGFP משמש בניסויים המתוארים נושאת גן ההתנגדות הpuromycin וביטוי RFP-H2B באמצעות פלסמיד נושאת גן התנגדות בלאסיניפין. לכן, 10 μg/mL של puromycin ו 2 μg/mL של בלטות משמשים עבור הבחירה של α-טובולין-EGFP, RFP-H2B ביטוי hTERT RFP-1 תאים. ריכוזי אנטיביוטיקה המשמשים לבחירה עשויות להיות שונות עבור קווי תאים שונים המשמשים.
  6. לשמור על תאים תחת בחירה אנטיביוטי עבור 5-7 ימים, החלפת המדיום כל 3 ימים עם בינוני טרי המכיל ריאגנטים בחירה מתאים.
    הערה: יש לשמור על התאים במפגש המשנה במהלך הבחירה ויש להרחיב אותם לפי הצורך, כפי שמתואר בשלבים 1.1.1 to 1.1.4.
  7. השתמש בדימות immunofluorescence כדי לאשר את הביטוי של מבנים מתויגים.
    הערה: אם רצונך בכך, ניתן לגזור שיבוטים של תא בודד כדי לקבל רמות ביטוי אחיד בתוך אוכלוסיית התא. לאחר שיבוטים יציבים מאושרות, התאים יכולים להישמר תחת תנאי התרבות הסטנדרטיים בהעדר בחירה אנטיביוטי.

2. הכנת תאים לדימות תאים חיים בעקבות mitotic ציר רטבאליות

הערה: השתמש בטכניקות אספטי ולבצע את השלבים בארון בטיחות BSL2.

  1. באמצעות מכשיר זכוכית סטרילי חד פעמי, מתכלה את המדיום מלוחית התרבות המכילה את קו התא הנושא את בניית הביטויים (משלב 1.7). שוטפים בקצרה את התאים עם 10 מ ל של הערוץ הסטרילי. , מערבולת כדי לפזר את הערוץ התחתון. ולאחר מכן לבשל את הערוץ החדש
  2. הוסף 2 מ ל של 0.05% טריפסין לצלחת 10 ס מ. מודדת את הצלחת ב 37 ° c עבור 2-5 דקות או עד תאים מנותקים ממשטח הצלחת.
  3. הוסיפו 8 מ ל של בינוני טרי לצלחת המכילה טריפסין. השהה את התאים מחדש על ידי ליטוף בעדינות והעבר את ההשעיה לצינורית חרועה בעלת 15 מ"ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.
  4. שימו לב בזהירות על הסופרנטנט והשעיה מחדש ב-10 מ ל של PBS על ידי ליטוף בעדינות עם פיפטה בגוון של 10 מ ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.
  5. שימו לב בזהירות על הסופרנטאנט והשעיה מחדש ב-10 מ ל של המדיום הטרי על ידי ליטוף בעדינות עם פיפטה בגודל 10 מ ל.
  6. ספירת תאים, לאחר מכן לחשב את מספר התא באמצעות hemacytometer ולדלל לריכוז של 1-2 x 105 תאים/mL במדיום תרבות התא. Seed 500 μL של התא הבולם כל טוב של לוחית סטרילי 12-היטב הדמיה התמונה. מניחים את הצלחת בחממה תרבות התא ולאפשר לתאים לדבוק משטח הצלחת.
    הערה: הדמיה של תאים בשידור חי מחייבת הדבקה של תאים כך שיישארו משויכים למישור ההדמיה במהלך רכישת תמונה. משך הזמן הדרוש עבור תאים לדבוק בציפוי הבאה יכול להיות שונה מקו תא אחד למשנהו וצריך להיות ממוטב עבור קו התא תחת לימוד.
  7. עד 30 דקות לפני התחלת הדמיה זמן לפקיעה, להוסיף ריכוז רלוונטי של תרופה mitotic לאחת או יותר של הבארות הנזרע עם תאים. כדי להסביר את ההשפעה הפוטנציאלית של הממס האורגני על התנהגות תאית, להוסיף נפח שווה של דילול של מעכב את התאים כפקדים. לדוגמה, ודא כי התוספת של 100 ננומטר של המעכב הספציפי של mitotic קינאז אורורה A (למשל, דליארטיב) הוא וקרב עם נפח שווה של DMSO, הדילול עבור הסם הזה, בשליטה היטב של תאים.
    הערה: ניתוח השוואתי של שינויים דינאמיים בהתקדמות mitotic דורשים בארות של תאים להיות מוכנים בהעדר רטבאליות כדי לאפשר הדמיה של מיטוסים נורמליים במקביל לתנאים ניסיוניים.

3. מיקרוסקופ להגדיר לפקיעה זמן הדמיה של RFP-H2B, α-טובולין-GFP לבטא תאים (איור 1, איור 2)

  1. מקום צלחת תרבות התא המכיל rfp-H2B, α-טובולין-gfp המבטא htert rfp-1 תאים להיות מצולם לתוך שלב מתאים להוסיף על מיקרוסקופ אפידלנטית הפוכה המצויד עם מצלמה ברזולוציה גבוהה (גודל פיקסל של 0.67 יקרומטר ב 20x), מ חדר הסביבה מחומם עד 37 ° c, ומערכת משלוח עבור מחולל לחות 5% CO2.
    הערה: תאי הסביבה הסגורים או מוסיף טמפרטורה מבוקרת הבמה עשוי להיות מתאים סיפק מחולל שיתוף 5% CO2 ניתן להעביר ויציבה בקרת טמפרטורה שהתקבלו.
  2. השתמש במטרה האוויר 20x עם מפתח מספרי של 0.5 ומצויד בחדות גבוהה לעומת קרינה וניגודיות פאזה או הדמיה ברייטפילד. הצגת תאים עם הניגודיות פאזה או ברייטפילד וכוונן את הקורס ואת המיקוד העדין על המיקרוסקופ כדי להביא תאים לפוקוס.
  3. לזהות ולהגדיר את זמני החשיפה האופטימלי עבור ברייטפילד, GFP, ו RFP רכישת תמונה על ידי בחירת קוביית מסנן בהתאמה עם עירור המתאים ופליטה עבור fluorophores כי יהיה לדימות. לחילופין, לחץ על לחצן החשיפה האוטומטית כדי להזין זמן חשיפה שנקבע מראש. אם האות אינו אינטנסיבי במידה מספקת, בחר באפשרות פיקסלים לאפשר זמני חשיפה קצרים יותר על-ידי לחיצה על הכרטיסייה binning ובחירה באפשרות 2 x 2 פיקסלים מהתפריט הנפתח.
    הערה: הפוטורעילות יכול לפגוע mitotic התקדמות והכדאיות של התא. כישלון של תאים mitotic באוכלוסיות בקרה כדי להשלים mitoses נורמלי עשוי להיות אינדיקציה כי פעמים חשיפה ו/או משך הדמיה צריך להיות אופטימיזציה נוספת.
  4. השתמש בתוכנת רכישה וניתוח המאפשרת ריבוי קואורדינטות, הדמיה מרובת-היטב לרכישה בו ולהגדרת הפרמטרים עבור רכישת התמונה.
    1. בחרו וכיילו את שלב המיקרוסקופ לצלחת הרב, בהתאם להוראות היצרן. השתמש בתוכנה לרכישת תמונות כדי להדגיש או לבחור בצורה אחרת את הבארות כי יהיה לצלם על ידי לחיצה על הבארות הרלוונטיות בדיאגרמה של תבנית הלוח הנמצא בשימוש.
    2. בלוח הבקרה של נקודות הסימון (איור 2), הגדר את נקודות הציון בתוך כל באר שיוצבע על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מיקום נקודה ובחירת מיקום קואורדינטות מוגדר מראש או אקראי מ תפריט הנפתח. בחר בכרטיסיה אזור עבודה ובחר באפשרות מוגבלת מהתפריט הנפתח כדי להגביל את אזור בחירת הקואורדינטות כדי לשלול את גבולות הבאר. לחץ על לשוניות הספירה וההפצה כדי לבחור את המספר וההתפלגות של נקודות שיילכדו בו, בהתאמה.
      הערה: מספר נקודות הציון שניתן להגבאם בתוך התוספת 5 דקות של נקודת הזמן הקבועה מוגבלת על-ידי מספר הבארות לדימות, כמו גם את זמן החשיפה עבור כל ערוץ. בדרך כלל, 5-8 קואורדינטות לכל טוב הם מספיק כדי להתבונן לפחות 50 תאים בכל התקדמות תנאי דרך מיטוזה בתוך 4 h.
    3. בחר והקלט את מרווח הזמן והמשך לאיסוף תמונות על-ידי לחיצה על והזנת הערכים בלוח הבקרה של Timesequence .
      הערה: רכישת תמונות כל 1 עד 5 דקות מתאימה לנטר את הדינמיקה של התקדמות mitotic. משך הדימות הכולל אמור לשקף את נקודת הקצה הרצויה ואת קצב ההפצה של קו התא. לדוגמה, 4 שעות מספיק כדי לראות תאים רבים התקדמות דרך mitosis, 16 שעות מספיק כדי לראות את רוב RPE-1 תאים בהתקדמות האוכלוסייה אסינכרוני דרך mitosis.

4. זמן התמונה ניתוח לטעות כדי לקבוע את העיתוי מטאמפאזה ואת הגורל mitotic cell בעקבות mitotic ציר רטבאליות

הערה: בצע את ניתוח התמונה באמצעות תוכנת רכישת תמונה (טבלת חומרים), imagej, או תוכנת ניתוח תמונה דומה.

  1. המחש RFP-H2B שכותרתו כרומטין על ידי בחירת תמונות שנתפסו עם קוביית מסנן RFP במקום. זיהוי תא הזנת מיטוזיס כפי שמצוין על-ידי דחיסת כרומטין ראשונית (איור 2C, ראש חץ כחול) ומעטפה גרעינית להישבר (כאשר α-טובולין-egfp אינו נכלל עוד על ידי הגבול הגרעיני).
  2. לקבוע את העיתוי mitotic של יישור מטא-פאזה והתפתחות בתאים בודדים: מעקב אחר התא באמצעות נקודות זמן רצופות בסרט הנרכש כדי לקבוע את מספר נקודות הזמן/דקות מהזנת mitotic עד RFP-H2B-כרומטין מתויג משלים את היישור בתא המשווה במהלך מטא-פאזה (איור 2ג, ראש חץ צהוב).
  3. כדי לפקח על mitotic עיתוי, mitotic אמינות וגורל התאים, המשך לעקוב אחר התא באמצעות נקודות זמן רצופות כדי לזהות את קואורדינטת הזמן שבה הפרדה בין כרומוזום אנבית ברורה (איור 2ג, ראש חץ לבן) ו/או שם התרחש הרפורמציה של כרומטין ומעטפת גרעינית (כפי שמצוין על ידי טובולין הדרה מהגרעין).
    הערה: רטבאליות בעצרת ציר או התקדמות mitotic יכול להיות מוערך כפונקציה של הזמן הנדרש כדי להשיג ציר mitotic דו-קוטבית ולהשיג יישור כרומוזום מלא, או כדי להשלים את ההפרדה של כרומוזום אנאפיום.
  4. המחש RFP-H2B לזהות תאים בכל אוכלוסייה המוצגים פגמים mitotic כולל כרומוזומים בפיגור וגשרים כרומטין במהלך הפרדה של כרומוזום אנאפא.
    הערה: mitotic בסכנה עלולה גם לגרום לתאים בעלי מיקרו או בתאי מיקרורוקליום וניתן לדמיין בתאים שלאחר mitotic יציאה, כמו באיור 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכת ההתקדמות הmitotic בנוכחות ציר רטבאליות
הוויסות של קוטב הציר התמקדות הוא צעד חיוני במערך הציר הדו המתאים. הפרעה בתהליך זה באמצעות מרוקן חלבונים, עיכוב התרופה, או שינויים ב-centrosome מבנה הציר מושחתים ועיכוב או לעצור mitoticהתקדמות 10,11,12,13. עם זאת, כמה רטבאליות רק עיכוב היווצרות הצירים עם תאים בסופו של דבר ממשיך מיטוזיס כדי להשלים את...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הרזולוציה הטמפורלית המסופקת על ידי הדמיה בזמן מאפשר להדמיה והערכה של אירועים סלולריים רציפים בתוך תאים בודדים. גישות העושות שימוש בסנכרון הסלולר ולאחריה האיסוף והקיבעון של תאים בנקודות זמן רציפות מוגבלות בהשוואות שבוצעו בסופו של דבר בין אוכלוסיות של תאים. בהקשרים שבהם התגובה התאית רטבאליות עשוי להיות לא אחיד, או כאשר התהליך להיות מדמיין הוא דינמי, לחיות הדמיה של זמן התמונה הוא מצויד טוב יותר לעקוב ולנתח הן את הדינמיקה של תאים בודדים, כמו גם את הטרוגניות בתוך אוכלוסיה תאית. בדרך זו, הדמיה זמן לפקיעה שימושי במיוחד בניטור ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

DLM נתמך על-ידי NSF GRFP. ALM נתמך על ידי מימון פרס משפחת סמית ' למצוינות במחקר ביו-רפואי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסיןGibo-Life sciences25-510סרין פרוטאז המשמש לשחרור תאים דבקים מכלי תרבית
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהאולימפוס פלסטיק28-101
20x CFI תוכנית פלואור אובייקטיבי Nikonלשימוש בהדמיית תאים חיים כדי להמחיש הן שדה בהיר והן פלואורסצנטי
293T CellsATCCCRL-3216לשימוש בטרנספקציה רטרו-ויראלית; משמש בשלב 1.1
a-tubulin-EGFP הוסףמספרים שוניםוקטור ביטוי עבור אלפא טובולין התמזג לתג חלבון פלואורסצנטי ירוק; לשימוש בהדמיה של טובולין בהדמיית תאים חיים: זמין מסחרית באמצעות addgene וספקים אחרים
AlisertibSelleckchemS1133מעכב מולקולות קטנות של הקינאז המיטוטי Aurora A. ריכוז המלאי מוכן ב-10 מ"מ ב-DMSO, ומשמש בריכוז סופי של 100 ננומטר.
BlasticidinInvitrogenA11139-03חומר לבחירת אנטיביוטיקה; משמש לבחירת תאים המבטאים a-tub-EGFP
C02Airgasלשימוש בתרבית תאים והדמיית תאים חיים
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)Chroma49005סט מסנני פס יחיד; אורך גל עירור 545 ננומטר עם רוחב פס ופליטה של 25 ננומטר באורך גל של 605 ננומטר עם רוחב פס של 70 ננומטר; להדמיה של H2B-RFP
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)Chroma49002סט מסנני פס יחיד; אורך גל עירור 470 ננומטר עם רוחב פס של 40 ננומטר ופליטה באורך גל של 525 ננומטר עם רוחב פס של 50 ננומטר; להדמיה של
צנרת פסטור חד פעמית GFP-tubulin, מעוקרת פישר סיינטיפיק13-678-6Aלשימוש בתאים שואבים 
דולבקו s מדיום נשר שונה (DMEM)Gibo-Life sciences11965-084מדיום תרבית תאים לגידול תאי RPE-1 ו-293T
סרום בקר עוברי (FBS)Gibo-Life sciences10438-026תוסף מדיום תרבית תאים
ליפופקטמין 3000 ו-p3000InvitrogenL3000-015מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים לטרנספקציה של פלסמידים; משמש ב-1.1.4
כלי תרבית רקמות מרובי בארותקורנינגשוניםלשימוש בתרבית תאים, טרנספקציה/זיהום והדמיית תאים חיים
מיקרוסקופ Nikon Ti-Eמיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך של Nikon לשימוש בהדמיית תאים חיים
Nikonגרסה 4.51תוכנה לאיסוף וניתוח תמונות; בשימוש בסעיפים 3 ו-4
OPTI-MEMGibo-Life sciences31985-070מדיום סרום מופחת לטרנספקציה של תאים; משמש בשלב 1.1.3
פניצילין/סטרפטומיצין Gibo-Life sciences15140-122אנטיביוטיקה המשמשת בתרבית תאים
תמיסת מלח בינונית פוספט (PBS)Caisson labsPBP06-10X1LTתמיסת מלח סטרילית לשימוש עם תרבית תאים
pMD2.GAddgene12259Lentiviral VSV-G מבנה ביטוי מעטפת; משמש בשלב 1.1.4
PolybreneSigma-AldrichH9268פולימר קטיוני המשמש לשיפור יעילות הזיהום הנגיפי; משמש בשלב 1.1.10
psPAXAddgene12260פלסמיד אריזות לנטי-ויראליות מהדור השני; משמש בשלב 1.1.4
PuromycinInvitrogenant-pr-1חומר בחירת אנטיביוטיקה; משמש לבחירת תאים המבטאים RFP-H2B
RFP-היסטון 2B (H2B)הוסףמספריםשוניםוקטור ביטוי עבור היסטון 2B מתויג חלבון פלואורסצנטי אדום; לשימוש בהדמיה של כרומטין בהדמיית תאים חיים: זמין מסחרית דרך Addgene וספקים אחרים
RNAi MaxInvitrogen13778-150מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים לטרנספקציה של מבני siRNA תאי
RPE-1 ATCCCRL-4000קו תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושי
צלחת תרבית רקמות 100x20 מ"מקורנינג 353003לשימוש בתרבית תאים דבקים
מצלמת Zyla sCMOS ניקוןמחוברת למיקרוסקופ, המשמשת לצילום תמונות של תאים
NIS Elements HC מצלמת

מקורות

  1. Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
  2. Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
  3. Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
  4. Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
  5. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
  6. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  7. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
  8. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
  9. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
  10. Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
  11. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
  12. Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
  13. Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
  14. Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
  15. Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
  16. Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
  17. Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
  18. Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
  19. Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
  20. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  21. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
  22. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
  23. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
  24. Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
  25. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.