שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

Renat  N. Khaliullin; Jeffrey  M. Hendel; Adina Gerson-Gurwitz; Shaohe Wang; Stacy  D. Ochoa; Zhiling Zhao; Arshad Desai; Karen Oegema; Rebecca  A. Green

doi:10.3791/60362

Method Article

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

DOI:

10.3791/60362

⸱

October 29th, 2019

Renat N. Khaliullin¹^,²^,³ , Jeffrey M. Hendel¹^,² , Adina Gerson-Gurwitz¹^,² , Shaohe Wang¹^,⁴^,⁵ , Stacy D. Ochoa¹^,⁶ , Zhiling Zhao¹^,⁷ , Arshad Desai¹^,² , Karen Oegema¹^,² , Rebecca A. Green¹^,²

¹Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, ³Recursion Pharmaceuticals, ⁴Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, ⁵Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, ⁶Department of Biology, San Diego State University, ⁷Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג. אלגיה היא המערכת המובילה לניתוח שיטתי של מפרט הגורל התא ואירועים מורפולגנטיים במהלך התפתחות עובריים. אתגר אחד הוא שembryogenesis דינמי נפרש על פני תקופה של כ -13 שעות; זה חצי ציר זמן אורך היום יש להגביל את היקף הניסויים על ידי הגבלת מספר העוברים שניתן לדימות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חצי-גבוה-תפוקה המאפשרת הדמיה בזמן התלת-ממד הסימולטני של פיתוח ב-80-100 עוברים ברזולוציה מתונה, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת ללילה. הפרוטוקול הוא פשוט יכול להיות מיושם על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם היכולת לבקר הנקודה. השירות של פרוטוקול זה מוכח על ידי שימוש בו לתמונה שני זנים בנויים אישית ביטוי סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של שכבת נבט מפרט מורפולגנזה. כדי לנתח את הנתונים, תוכנית מותאמת אישית החותכת את העוברים הבודדים משדה רחב יותר של תצוגה בכל הערוצים, z-steps ונקודות זמן ושומרת את הרצפים עבור כל עובר לתוך מחסנית tiff נפרדת. התוכנית, הכוללת ממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש (GUI), מפשט עיבוד נתונים על ידי בידוד, טרום עיבוד, ו בצורה אחידה עוברים בודדים לקראת ויזואליזציה או ניתוח אוטומטי. שסופקו גם היא מאקרו ImageJ המבצע הידור של נתוני העובר בודדים לתוך קובץ מרובה חלוניות המציג הקרנה בעוצמה מירבית של הקרנת הקרינה ותמונות ברייטפילד לכל עובר בכל נקודה. הפרוטוקולים והכלים המתוארים במסמך זה אומתו באמצעות השימוש בהם לאפיון התפתחות עובריים בעקבות ה40 של הגנים ההתפתחותיים שתוארו לעיל; ניתוח זה דמיינו לעיל פנוטיפים התפתחותיים וחשף חדשים. לסיכום, עבודה זו מפרטת שיטת הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה ביחד עם תוכנית חיתוך ו-ImageJ הכלי להדמיה, כאשר בשילוב עם זנים המבטא פלורסנט אינפורמטיבי סמנים, מאיצה מאוד ניסויים לנתח פיתוח עובריים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העובר C. אלגיה היא מערכת חשובה מודל עבור ביולוגיה של התא מכניסטי וניתוח של מפרט הגורל תא ואירועים גנטיים מורפוליום נהיגה פיתוח עובריים¹^,²^,³^,⁴ ^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. עד היום, רוב האפיון של האירועים ברמה התאית ואת מפרט הגורל התא בעובר הושג באמצעות ברזולוציה גבוהה יחסית הזמן ניסויים הדמיה (כלומר, רכישה כל 10-100 s) של עוברים ביטוי סמני פלורסנט. למרות שמתאים מאוד לאירועים בס....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 . הכנת העוברים עבור הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה

הערה: המטרה של חלק זה של הפרוטוקול היא לטעון אוכלוסיה של מסונכרן למחצה (2 עד 8-תא הבמה) C. אלגיה עוברים, גזור זני סמן מתאים (איור 2), לתוך התחתון זכוכית 384-צלחת להדמיה. תבניות אחרות צלחת גם לעבוד, אבל 384 לוחות היטב הם העדיפו בגלל הגודל הטוב קטן מגביל את התפשטות העוברים לאזור קטן יחסית, אשר מקלה על זיהוי של שדות המכילים עוברים מרובים עבור הדמיה בזמן. בערך סנכרון העוברים מבטיח שתהליך ההתפתחות המלא ייתפס עבור כל אחד מהעוברים בשדה.

הכינו 5 – 10 מ ל של 0.1 מ"ג/mL פתרון של tetramisole הידרוכלוריד (TMHC) הרדמה מומס קרח קר M....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתגר משמעותי באפיון ההשפעה של רטבאליות מולקולרית על ההתפתחות העובריים של ה -"אלגיה " היא שלוקח כ-10 שעות להתקדם מהמחשוף הראשון ועד לסוף התארכות ב -20 °¹⁶. שיטה בעלת תפוקה מלאה למחצה שבה יכולות להיות הדמיה של קבוצות גדולות של עוברים בו, שימושיות לאירועים בקנה מידה זה, משום שהיא מאפשרת הדמיה של תנאים מרובים במקביל לגודל הרכב מספיק עבור כל תנאי כדי לאפשר אנליזהכמותית(איור 1א).

שיטת הדמיה של תפוקה גבוהה למחצה ו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מתארת חבילה של כלים ושיטות שפותחו כדי לאפשר מאמצים גדולים יותר לפרופיל הפונקציה של גנים בהתפתחות עובריים בג. שיטת התפוקה הגבוהה שלנו למחצה מאפשרת הדמיה של זמן תלת-ממד של התפתחות עובריים ברזולוציה של 20 דקות עבור 80 – 100 עוברים בניסוי אחד. בעוד פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש עם זן סמן הרצוי (s), עבודה זו ממחישה את הפוטנציאל של השיטה באמצעות שני זנים מותאמים אישית שפותחו כדי לפקח על אירועים במהלך embryogenesis: (1) מאמץ שכבת הנבט, שבו מסוימים הרקמה היזמים לכונן את הביטוי של האבנים פלורסנט כדי לסמן א.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.D.O. היה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית בחסות אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו המחקר המוסדי ופיתוח הקריירה האקדמית פרס (NIH/IRACDA K12 GM068524). Ad ו K.O. תמכו על ידי המכון לודוויג לחקר הסרטן, אשר גם סיפק להם מימון מחקר המשמש לתמיכה זו עבודה. אנו אסירי תודה לאנדרו צ'ישולם על עצתו בשלבים המוקדמים של הפרויקט הזה, רונלד ביגס לתרומות לפרויקט זה לאחר שלב פיתוח השיטה הראשונית, ודייב ג'נקינס ואנדי Shiau לתמיכה וגישה לגילוי המולקולה הקטנה מערכת הדמיה של התוכן הגבוה של הקבוצה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
מכלול צינור שואב	Drummond Scientific	2-000-000
פיפטה מכוילת (25 מ"ל)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	כלול בצינור חרוטי CV1000
(15 מ"ל)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 מיקרוסקופ	Yokogawa Electric Corp	CV1000
שקופית דיכאון (3 בארות)	Erie Scientific	1520-006
מיקרוסקופ דיסקציה	ניקון	SMZ-645
צנטריפוגה אפנדורף 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	קוד פתוח	https://imagej.net/Fiji
מעבדת מאגר M9	מוכנה	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab מוכן	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
אזמל #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 באר, F-bottom, גריינר תחתון זכוכית	Bio-One	781855
טטרמיסול הידרוכלוריד	Sigma Aldirch	T1512-10G
פינצטה, Dumont #3	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	0109-3-PO
U-PlanApo מטרה (10× 0.4 NA)	אולימפוס	1-U2B823
U-PlanApo מטרה (60&1.35 NA)	אולימפוס	1-U2B832

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles