הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

5.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60362

⸱

29 באוקטובר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

במאמר זה

סיכום

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

תקציר

ג. אלגיה היא המערכת המובילה לניתוח שיטתי של מפרט הגורל התא ואירועים מורפולגנטיים במהלך התפתחות עובריים. אתגר אחד הוא שembryogenesis דינמי נפרש על פני תקופה של כ -13 שעות; זה חצי ציר זמן אורך היום יש להגביל את היקף הניסויים על ידי הגבלת מספר העוברים שניתן לדימות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חצי-גבוה-תפוקה המאפשרת הדמיה בזמן התלת-ממד הסימולטני של פיתוח ב-80-100 עוברים ברזולוציה מתונה, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת ללילה. הפרוטוקול הוא פשוט יכול להיות מיושם על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם היכולת לבקר הנקודה. השירות של פרוטוקול זה מוכח על ידי שימוש בו לתמונה שני זנים בנויים אישית ביטוי סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של שכבת נבט מפרט מורפולגנזה. כדי לנתח את הנתונים, תוכנית מותאמת אישית החותכת את העוברים הבודדים משדה רחב יותר של תצוגה בכל הערוצים, z-steps ונקודות זמן ושומרת את הרצפים עבור כל עובר לתוך מחסנית tiff נפרדת. התוכנית, הכוללת ממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש (GUI), מפשט עיבוד נתונים על ידי בידוד, טרום עיבוד, ו בצורה אחידה עוברים בודדים לקראת ויזואליזציה או ניתוח אוטומטי. שסופקו גם היא מאקרו ImageJ המבצע הידור של נתוני העובר בודדים לתוך קובץ מרובה חלוניות המציג הקרנה בעוצמה מירבית של הקרנת הקרינה ותמונות ברייטפילד לכל עובר בכל נקודה. הפרוטוקולים והכלים המתוארים במסמך זה אומתו באמצעות השימוש בהם לאפיון התפתחות עובריים בעקבות ה40 של הגנים ההתפתחותיים שתוארו לעיל; ניתוח זה דמיינו לעיל פנוטיפים התפתחותיים וחשף חדשים. לסיכום, עבודה זו מפרטת שיטת הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה ביחד עם תוכנית חיתוך ו-ImageJ הכלי להדמיה, כאשר בשילוב עם זנים המבטא פלורסנט אינפורמטיבי סמנים, מאיצה מאוד ניסויים לנתח פיתוח עובריים.

מבוא

העובר C. אלגיה היא מערכת חשובה מודל עבור ביולוגיה של התא מכניסטי וניתוח של מפרט הגורל תא ואירועים גנטיים מורפוליום נהיגה פיתוח עובריים1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. עד היום, רוב האפיון של האירועים ברמה התאית ואת מפרט הגורל התא בעובר הושג באמצעות ברזולוציה גבוהה יחסית הזמן ניסויים הדמיה (כלומר, רכישה כל 10-100 s) של עוברים ביטוי סמני פלורסנט. למרות שמתאים מאוד לאירועים בסדר שניות עד עשרות דקות, גישה זו הופכת להיות מגבילה מבחינה טכנית לאפיון תהליכים ארוכים יותר, בסדר שעות עד ימים. פיתוח עובריים מפני המחשוף הראשון עד סוף התארכות לוקח בערך 10 h. במהלך הזמן הזה, חצי-high-תפוקה שיטות שיאפשרו הדמיה בזמן הנמוך ביותר ברזולוציה נמוכה (כלומר, רכישה ב 5 – 20 מרווחי זמן) של כתרים גדולים יותר של עוברים, מתנאים שונים, יפתח מגוון חדש של ניסויים; לדוגמה, הפעלת מאמצי הקרנה בקנה מידה גדול וניתוח מספר מספיק של עוברים להשוואות של השלכות הרטבאליות המולקולריות.

כאן, אנו מתארים שיטה למחצה התפוקה לניטור C. אלגיה embryogenesis המאפשרת הדמיה בו בזמן תלת-ממד של התפתחות ב 80-100 עוברים, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת לילה. הפרוטוקול הוא פשוט ליישם והוא יכול להתבצע על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם יכולות ביקור הנקודה. השלבים העיקריים בפרוטוקול זה מתוארים באיור 1. בקצרה, עוברים גזור מבוגרים gravid המבטא סמנים פלורסנט של עניין והעברת עוברי צעירים (2 – 8 הבמה התא) כדי בארות של 384-צלחת לוח עבור הדמיה. בתבנית זו, בגודל הטוב יחסית funnels עוברים לתוך אזור צר, אשר מקלה על זיהוי של שדות המכילים עוברים מרובים עבור הדמיה בזמן מפקיעה. כדי לשמור על התפתחות סינכרונית באופן כלשהו על פני הקבוצה של העוברים, הניתוח מבוצע בתקשורת מקורר והצלחת מוחזקת על הקרח, אשר מונע התפתחות משמעותית במהלך שעת הניתוח במשך שעה. הצלחת מועברת המיקרוסקופ והעוברים מצולמים בחדר מבוקר טמפרטורה, ב 20 דקות מרווחי זמן, באמצעות שמן 60x טבילה 1.35 NA עדשה, כדי לאסוף את המלא z-טווח ב 2 יקרומטר שלבים. 50 שדות, כל אחד המכיל בין 1-5 עוברים, הם התמונה במהלך אחד לילה הפעלה. בהתאם לניסוי הרצוי, ניתן להגדיל את רזולוציית הזמן (לדוגמה, הדמיה ב-5-10 דקות) על-ידי הפחתת המספר של שדות הדמיה באופן פרופורציונלי.

עם פרוטוקול זה, אפילו הפעלת לילה אחת מייצרת כמות משמעותית של נתונים (80-100 עוברים הפרושים מעל 50 שדות) וניסויים גדולים יותר יכולים להיות במהירות ביחס לניתוח נתונים. כדי להקל על עיבוד, הדמיה חזותית וייעול הניתוח של נתונים אלה, נבנתה תוכנית לחיתוך והכנה של עוברים ולביצוע שלבי עיבוד מקדים (אופציונלי) ומאקרו ImageJ המבצע הידור של הנתונים כדי לפשט את הצפייה. ניתן להשתמש בתוכניות אלה כדי לעבד תמונות שנאספו באמצעות גישות קונבנציונליות, מאחר שהן אינן תלויות בשיטת הדימות, ודורשות רק מטוס ביביואלי יחיד. התוכנית הראשונה מקבלת בשדה 4D המכיל עוברים מרובים (אפשרות GUI או קוד מקור embryoCrop.py) או שדות 4D מרובים המכילים עוברים מרובים (screenCrop.py), גידולים הדוקים העוברים וכיוון אותם בתצורה האחורי הקדמי. תוכניות אלה גם נותנות למשתמשים אפשרות לבצע חיסור רקע, תיקון סחיפה ותיקון החליש. הקבצים המתקבלים הם אחיד מעובד מראש, חיתוך היטב בערימות tiff עבור כל עובר הamendable לניתוח תמונה אוטומטית. כדי להפוך את זה לפשוט יותר להציג את כל העוברים עבור כל תנאי, מאקרו ImageJ (OpenandCombine_embsV2. ijm) נכתב, אשר מרכיב את כל העוברים מתנאי נתון לתוך מחסנית אחת tiff ומערכים ברייטפרופילד תמונות וצבע הקרנה מקסימלית העוצמה ( RGB) כיסויי שכבות, זה לצד זה, לכל עובר. השיטות היו מאומת על ידי שימוש בהם כדי לאפיין את הפיתוח העובריים לאחר הדפיקה של 40 בעבר-תיאר גנים התפתחותיים בזוג זנים בנוי אישית המבטא סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של הנבט-שכבה מפרט ומורפוגנזה10,11. יחד עם זאת, העברת התפוקה למחצה וכלים לעיבוד התמונה מאפשרים ניסויים במספר גבוה יותר ומאמצי הקרנה בקנה מידה גדול המיועדים להבנת תהליכים התפתחותיים. בנוסף, זנים אלה יספק גם אמצעי יעיל לבדיקת ההשפעות של רטבאליות מולקולרית על embryogenesis.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1 . הכנת העוברים עבור הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה

הערה: המטרה של חלק זה של הפרוטוקול היא לטעון אוכלוסיה של מסונכרן למחצה (2 עד 8-תא הבמה) C. אלגיה עוברים, גזור זני סמן מתאים (איור 2), לתוך התחתון זכוכית 384-צלחת להדמיה. תבניות אחרות צלחת גם לעבוד, אבל 384 לוחות היטב הם העדיפו בגלל הגודל הטוב קטן מגביל את התפשטות העוברים לאזור קטן יחסית, אשר מקלה על זיהוי של שדות המכילים עוברים מרובים עבור הדמיה בזמן. בערך סנכרון העוברים מבטיח שתהליך ההתפתחות המלא ייתפס עבור כל אחד מהעוברים בשדה.

  1. הכינו 5 – 10 מ ל של 0.1 מ"ג/mL פתרון של tetramisole הידרוכלוריד (TMHC) הרדמה מומס קרח קר M9 בינונית (0.45 M Na2hpo4∙ 7h2O, 0.11 m KH2PO4, 0.04 m הנאל, 0.09 m NH4Cl) להשתמש במהלך ניתוח והדמיה. מדיה זו כוללת חומר הרדמה כדי להבטיח שהזזת הזחל המקווקו לא משבש את ההדמיה של עוברים בשלבים התפתחותיים מוקדמים יותר.
    הערה: אם נעשה שימוש בכלי החיתוך וההדמיה לניתוח נתונים שנרכשו באמצעות שיטות הרכבה סטנדרטיות של כרית, דלג קדימה לסעיף 3 להלן.
  2. Aliquot 70 μL של הפתרון המוכן לתוך בארות בודדות של התחתון זכוכית 384-באר עם אחד טוב עבור כל תנאי; למנוע את שתי השורות החיצוניות של הצלחת כדי למנוע תופעות קצה.
    הערה: זה שימושי להסוות את הבארות שמסביב באמצעות דבק רדיד PCR לוחית (ראה דוגמה באיור 1ד) זה שומר על בארות סמוכות לניסויים עתידיים ומקל על איתור בארות מתאימות תחת מיקרוסקופ הניתוח. לאחר הפתרון הוא מצוטט, לשמור את הצלחת ואת הפתרון הנותר על הקרח במהלך הניתוח.
  3. צור בעלי חיים להעברת העוברים מתוך שקופית הדיכאון (שם הרמאת gravid הדיכוטים הם גזור) לבארות. משוך בעלי חיים קפילר (25 μL מכויל מכוילים) מעל להבה והפסקה כדי ליצור סוף דק ומחודדות (איור 1ד). Pipet אחד נדרש בכל מצב כדי למנוע זיהום צולב; להיפטר pipet לאחר השימוש.
  4. השתמש בפינצטה עדין כדי להעביר ~ 10 gravid מבוגרים מתחת לטווח הניתוח לתוך 150 μL של הקרח קר TMHC פתרון מצוטט אל שקופית דיכאון עבור כל תנאי. באמצעות מלקחיים ואזמל, מנתחים את התולעים כדי לשחרר את העוברים.
  5. לטעון את הקפילר משכו לתוך ההחזקה המצורפת כלול עם pipet, ואת הפה מלטף להעביר את כל 2 כדי 8-cell בשלב העוברים לתוך הבאר האישית של הצלחת מוכן (איור 1ד). להימנע מהעברת עוברי שלב מאוחר ופסולת חיתוך. לבחון תחת טווח הניתוח ואם אגרגטים של העוברים נמצאים, הפה מלטף למעלה ולמטה או ברז גושים של עוברים עם טיפ pipet להתפזר.
    הערה: כדי למנוע מזהמים, לנקות ציוד הניתוח ולהשתמש בחיית מחמד בפה טרי תוך כדי תנועה בין התנאים. . לאחסן את הלוחית על הקרח בין הניתוח
  6. פעם תולעים מכל התנאים היו גזור העוברים ממוקמים היטב המתאים שלהם, לסובב את הצלחת 384-באר עבור 1 דקות ב 600 x g כדי ליישב את העוברים.
  7. לנגב את החלק התחתון של הצלחת עם מחיקה האתנול ספוג להסיר כל שאריות ולמקם את הצלחת על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד עם מחזיק צלחת בסביבה מבוקרת טמפרטורה.
    הערה: השלבים הבאים מפרטים את השיטה באמצעות הגדרת המעבדה; נא לשנות את תנאי הרכישה כדי להתאים את הצרכים הניסיוניים וציוד. כאן, תיבת סורק קונפוקלית וקד מצויד מיקרועדשה משופרת כפול nipkow מסתובב דיסק, a 512 x 512 EM-CCD מצלמה, דיוק גבוהה auto-XY-שלב (החלטה מיועדת 0.1 μm) ו מוטורי z-ציר בקרה (החלטה ייעודי 0.1 μm) משמש. מערכת זו נשמרת בחדר של 16 ° c, השומרת על טמפרטורת המיקרוסקופ בין 21 ל -23 ° c במהלך הדמיה של לילה.
  8. כדי לזהות שדות עם עוברים מתאימים, בצע סריקה מראש של כל טוב באמצעות מטרה 10x 0.4 NA ותוכנת דימות מתאימה. השדות האופטימליים ביותר יכילו יותר מעובר שלב מוקדם אחד הנמצא באותו מישור מוקד כמו עוברים אחרים ובאופן אידיאלי יהיה קשר מינימלי בין עוברים סמוכים. סמן עמדות של אזורים מתאימים.
  9. כדי לבחור שדות דימות, עבור למטרת ה-60x וכוונן את המישור המוקד בכל נקודה ביקור בסעיף הראוי לעוברים. 1 – 4 שדות לכל טוב הם התמונה, עבור סך של 50 שדות על פני 14 בארות, וכל שדה יכול להכיל בין אחד לחמישה עוברים. בסך הכל, 4 עד 15 עוברים נבחרים מכל תנאי לדימות ברזולוציה גבוהה.
    הערה: משתנה מפתח בשלב זה הוא השימוש בשמן מספיק; מניחים שמן על המטרה, נקודות ביקור בכל באר כדי לפזר את השמן סביב פני השטח של כל הבארות ולאחר מכן להחיל טיפה נוספת של שמן למטרה לפני מבחר של שדות.
  10. התמונה השדות שנבחרו באמצעות מטרה 60x 1.35 NA לרכוש 18 z מקטעים ב 2 יקרומטר מרווחי כל 20 דקות עבור 10 h. תנאי הדימות באמצעות שכבת הנבט ומורפולגנזה זנים כתבת הם כדלקמן: ברייטפילד, 90% כוח, 25 ms, 20% רווח; 488 ננומטר, 100% כוח, 200 ms, 60% רווח; 568 ננומטר, 45% כוח, 150 ms, 60% להרוויח.
  11. לאחר הדמיה הושלמה, להעריך את החיים העובריים על ידי ביצוע הגדלה נמוכה (10x 0.4 NA מטרה) כל טוב לסרוק את השדה ~ 20 – 24 h בעקבות התחלת הדמיה לילה.

2. הבקיע לטבליות עובריים

  1. שימוש בשדות הסרוקים שלאחר ההפעלה 10x, הערכת הטבוליות עובריים ופגמים בזחל על ידי ספירת תולעים מקווקו ועוברים בלתי מקווקו עבור כל באר.
  2. הניקוד הבלתי מקווקו כקטלני. לא לכלול נעצר אחד עד ארבעה תאים בשלב מספירת התיאליות, מאז העוברים בגזור צעירים לפעמים להיכשל היווצרות קליפת ביצה (אם מיוזה II עדיין לא הושלמה) וליקויים חדירות יכול להוביל סיבוכים אוסמוטי במהלך שני הראשונים חטיבות.
  3. ציון תולעים מקווקו או מקווקו באופן חלקי עם מורפולוגיה הגוף או פגמים התנהגותיים, כגון הדומפי או משותק, כמו ' זחל נורמלי '.

3. חיתוך אוטומטי (איור 3א)

הערה: התוכנה שוכנת בשני מיקומים: (1) Zenodo מארח גירסה ידידותית למשתמש של התוכנה12 שאינה דורשת מומחיות בתכנות. (2) Github מכיל את קוד המקור עבור התוכנה שלנו embryoCropUI.py ו screenCrop.py13, אשר דורשים מיומנות עם פיתון. הוראות מפורטות להורדת ותפעול הן הגירסאות של התוכנית ניתן למצוא להלן.

  1. חיתוך אוטומטי באמצעות גירסת הפעלה embryoCropUI (גירסה ידידותית למשתמש)
    1. כדי להשתמש בתוכנית embryoCropUI, הורד תחילה את התוכנית מ-Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
      1. הורד את ה-MacOS או גירסת התבנית של Windows של התוכנית (שים לב כי הגירסה MacOS דורש MacOS X 10.11 או גבוה יותר).
      2. הורד את קובץ ההוראות (GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx), אשר מספק צעד אחר צעד הוראה לבדיקה ושימוש בתוכנית embryoCropUI.
      3. הורד את test_files. zip כדי לבדוק אם התוכנית פועלת כראוי על הפלטפורמה (ראה הוראות).
    2. לאחר הורדת, לפתוח ולנווט כדי למצוא את ההפעלה embryoCropUI (... \embryoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe) או (... \embryoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe). לחץ פעמיים כדי להשיק (או בחר ' לפתוח עם ' מסוף) ולהפעיל את embryoCropUI ההפעלה.
    3. ההפעלה GUI לגידולים שדה אחד 4D של תצוגה בכל פעם. בפינה השמאלית העליונה, בחר בלחצן פתח כדי לטעון את השדה הספציפי לחיתוך (ריבוי tiff). אם חיתוך סדרת tiff, עם ממדים מרובים (כלומר z, זמן, ערוץ), טען רק את התמונה הראשונה בסידרה בתוך התיקיה (סדרת tiff אחת לכל תיקיה).
    4. לאחר טעינת תמונות, ציין את הפרטים הבאים: מספר הפרוסות z, (Z), מספר נקודות הזמן (T), מספר הערוצים (C), הערוץ המתאים ל-DIC או ברייטפילד (ראשון = 1, שני = 2, וכו ').
    5. בחרו עיבוד נוסף להפעלה בתמונות. התוכנית מציעה תיקון להיסחף, הרקע חיסור, תיקון החליש.
    6. ציין פרמטרים עבור ' חיסור רקע ' ו'תיקון החליש ' כדי להדריך את המאמצים לעיבוד בשורת הפקודה GUI. באפשרות ' הפחת רקע ', הגדירו את גודל התכונה הגדול ביותר שישקף את גודל האות בעל המשמעות; אין להתייחס לגודל תכונה זה כרקע ועליו להיות ערך מספר אי-זוגי. קלט ערך מ-0-1 עבור תיקון החליש. הערך ' תיקון החליש ' משקף את אחוז העוצמה המקורית הנותרת בעומק המרוחק של האובייקט הנמצא בתמונה.
      הערה: יש להפעיל יחד את ' חיסור רקע ' ו'תיקון החליש '.
    7. ציין את סדר אוסף התמונות (כלומר, ערוץ-z-time (czt) או z-time-channel (zct)).
    8. ציינו את המלנים לכל פיקסל בתמונות בהתבסס על השימוש במצלמה.
      הערה: חיתוך תמונה ירודה יתרחש אם גודל הפיקסל אינו מוגדר כראוי.
    9. בחר באפשרות הפעלה בפינה השמאלית התחתונה. תיקיית משנה חדשה הנקראת "חיתוך" תיווצר באותו נתיב של התיקיה שלא נחתכה; גירסאות שנחתכו יישמרו במיקום זה. בהתאם לגודל הקובץ, החיתוך אמור להיות מושלם תוך שניות לדקות.
  2. חיתוך אוטומטי באמצעות screenCrop.py (גרסת אצווה חלופה embryoCrop GUI המתואר לעיל;פיתון מתמצא למשתמשים בלבד)10,13
    1. כדי להשתמש screenCrop.py, גירסת התוכנה פייתון לחיתוך של ערכות נתונים גדולים יותר בפורמט אצווה, לשכפל או להוריד את קוד המקור מ Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
    2. קרא את ההוראות לקביעת תצורה של סביבה וירטואלית נאותה ובצע את מערכת מתן השמות לקבצים המתוארת; שניהם מפורטים בקובץ README במאגר Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
    3. לאחר משתנים סביבתיים ומוסכמות למתן שמות הוקמו כראוי, לפתוח parameters.py ו screenCrop.py בעורך הבחירה.
    4. כדי לשנות פרמטרים הניתנים לשינוי מבלי לגעת בקוד המקור, ערוך את קובץ parameters.py .
      הערה: ניתן גם לשנות באופן ישיר פרמטרים בתוך הכותרת של screenCrop.py.
      1. אם נעשה שימוש בקובץ התצורה parameters.py, שנה את ההגדרה use_configure ל-True. אם אתה משתמש בעריכה ישירה בתוך screenCrop.py, השאר את ההגדרה use_configure ב-False.
      2. אתר את המידע הבא בתוך קובץ parameters.py וביצוע שינויים בהתאם לפרמטרי ההדמיה הרצויים ולמבנה הקבצים:
        1. loadFolder (קו 9): שינוי לכונן שבו מאוחסנים הקבצים (לדוגמה, Z:/, D://, וכו ')
        2. date (שורה 7): שנה לתיקיה המכילה קבצים עבור הפעלת ההדמיה. פעולה זו נקראת ' הניסוי שם תיקיה ' בקובץ המעקב בתבנית CSV (ראה הוראות).
        3. trackingFile (קו 11): שינוי בנתיב לקובץ ה-CSV שבו מאוחסן פרטי הניסוי.
        4. z (קו 13): קבע כמספר מטוסי z.
        5. nT (line14): קבע כמספר נקודות הזמן.
        6. nWells (קו 19): להגדיר כמספר הבארות המשמשות.
        7. ביקורים בנקודות (קו 20): קבע כמספר מירבי של ביקורים בנקודה (לכל היותר).
        8. בשורה 10 מצא את המיקום הכבוש כרגע על-ידי ' CV1000/' ולהזין את התיקיה החיצונית המשמשת בנתיב הקובץ. כדי להימנע מבעיות, השתמש במוסכמה הבאה: ' XXXXXXX/'.
        9. בשורה 12, הזן נתיב קובץ חוקי לאחסון נתוני יחס גובה-רוחב עבור נתונים שנחתכו.
        10. בשורות 15, 16, 17 ו-18 קלט True/False אם התמונות עוברות את העיבוד הבא:
          1. קלט True או False עבור תיקון הסחף בקו 15.
          2. קלט True או False עבור רקע חסר בקו 16. גודל תכונה חייב להיות מקובע בצורה מדעית עבור זנים סמן שונים וגדלים פיקסל. בתצורה כאן, גודל התכונה הוגדרה כ 41 עבור זן נבט שכבה ו 201 עבור זן מורפוגנזה. יש לבצע הפחתה ברקע בשילוב עם תיקון החליש.
          3. קלט True או False עבור תיקון הנחתה בשורה 17.
          4. קלט True או False עבור סיבוב אחורי קדמי בקו 18.
    5. לאחר שכל השינויים נעשו, חיתוך יכול להתחיל. לשם כך, עבור אל screenCrop.py ובחר את סמל ההפעלה בסרגל הכלים, בתפריט הנפתח בחר באפשרות הפעל כ> פייתון run.
    6. כמו חיתוך יכול להימשך מספר שעות כדי להשלים ערכת נתונים גדולה (50 נקודות ביקורים 18 z שלבים, 3 ערוצים, 31 timepoints), מעקב אחר התקדמות חיתוך בחלון המסוף. לאחר חיתוך הושלמה, חלון קטן יציג תצוגה מקדימה של התמונות שנחתכו לפני שמירה. עבור כל תמונה ישנן 3 אפשרויות:
      1. שמור: לחץ על מקש הרווח כדי לשמור את התמונה אם התמונה נחתכת כראוי עם אזורים לא מעניינים להיות מנותקים.
      2. כונן X: הקש X אם נראה שהתמונה מופיעה באזורים מעניינים; התמונה תישמר עם X לפני השם כדי להפריד אותו מהתמונות האחרות.
      3. Delete: לחץ על D כדי למחוק את התמונה החתוכה אם התמונה אינה חתוכה כהלכה או שהעובר אינו משביע רצון.
        הערה: התמונות יישמרו בתיקיית ממשנה בשם "חתוכה" בתיקיה Load (מוגדרת בשורה 9 של התוכנית).

4. הדמיה (איור 4)

הערה: OpenandCombine_embsV2. ijm10,12 הוא מאקרו imagej אשר לבנות קל להציג קובץ tiff מכל התמונות עבור זן מסוים ומצב. התקנה של פיג'י/imagej14,15 נדרש. מאקרו זה פועל בהתאם למבנה הקבצים שלנו; יהיה צורך לשנותה כדי לעבוד עם מבני קבצים אחרים. מדריך למבנה הקובץ הנכון ותיאור מפורט של שיקולים חשובים ניתן למצוא בסוף GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx הקובץ על מאגר zenodo. נא לקרוא באמצעות הוראות אלה לחלוטין לפני הדמיה לשם כהלכה וקבצי מבנה לממשק הטוב ביותר עם מאקרו זה. לעיון, מבנה מיקום הקובץ שלנו נראה כך:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb \Target_Emb _ 15 מזהה ייחודי לספרות _ W #F _15 #_Z #_C. tif
i.e. Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

  1. הורד OpenandCombine_embsV2 ו GUI_Instructions_zenodo_repoV2. Docx מתוך zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
  2. הכינו את המידע הבא:
    -המיקום שבו תיקיות התמונה מאוחסנות (לאחר חיתוך).
    -שם תיקיית התמונה (ים) עבור התנאים הספציפיים שיש לעבד (כלומר, EMBD0002). הדבר נקרא "יעד" בדוגמה שלעיל
    -מזהה ייחודי alpha-נומרי של 15 ספרות שהוא ספציפי לניסוי מסוים בן לילה-מזהה זה הוא שם תיקיית הרכישה של הנתונים (כלומר, 20140402T140154) והמזהה הייחודי מוטבע בשם קובץ ה-tiff הבודד (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_ W06_1) עבור כל עובר התמונה באותו יום. המאקרו משתמש במזהה זה כדי לבדוק אם עוברים שנרכשו באותו תאריך ויכולים להרכיב תנאים חוזרים, עם תאריכים נפרדים, לקבצי ImageJ נפרדים.
  3. פתח את ImageJ, וגרור ושחרר את קובץ המאקרו, OpenandCombine_embsV2. ijm, לסרגל imagej, או פתח את המאקרו ישירות.
  4. לאחר פתיחת המאקרו, אתר את שורות 3 ו-4. הכנס את המידע שנאסף (סעיף 4.2) בהתאם לצעדים הבאים:
    1. בשורה 3 (RNAL), הזן את שם היעד עבור התמונות שיעובדו. קלט כל מטרה במבנה הבא newArray ("XXXXX/"); כוללות ציטוטים. כדי להפעיל תנאים מרובים בו, הפרד באמצעות פסיק ושמור את כל שמות היעד בתוך הסוגריים (כלומר, Newarray ("EMBD0000/", "EMBD0001/", "EMBD0002/").
    2. בשורה 4 (תאריך), קלט את המזהה הייחודי alpha-נומרי של 15 ספרות בהצעות מידע, לדוגמה Newarray ("20140402t140154").
  5. לחץ על הפעלה בקצה השמאלי התחתון של חלון המאקרו. יופיע חלון, שיפעיל בקשה לניווט אל התיקיה החיצונית המכילה את תיקיות התמונה שנחתכו (שצוינו ב4.4.1).
  6. לאחר שנבחר, יופיע חלון אחר, שיאפשר ציון של פרמטרי דימות.
    1. הזן את מספר הערוצים, את מספר פרוסות ה-Z, את גודל הגופן עבור הטקסט המשמש לתיוג התמונות שעברו קומפילציה, והצבע עבור כל אחד מהערוצים.
    2. בדוק/כיבוי אוטומטי מנוגדים בכל הערוצים.
  7. לאחר שצוינו כל הפרמטרים, לחץ על אישור בתחתית החלון. הקובץ המורכב יתחיל להרכיב; זה ייקח מספר דקות, בכל תנאי, כדי להשלים.
  8. לאחר שהושלם, סקור את הקבצים שנותרו פתוחים במידת הצורך. ניתן לסגור אותן ללא שמירה, מאחר שהמאקרו שומר כבר את הקבצים בתיקיה חדשה שנוצרה, הקרויה באופן הבא: שם התיקיה החיצונית (מצוין בבקשה לסעיף 4.5) + "-פיג'י-מעובד-פלט" (כלומר, Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אתגר משמעותי באפיון ההשפעה של רטבאליות מולקולרית על ההתפתחות העובריים של ה -"אלגיה " היא שלוקח כ-10 שעות להתקדם מהמחשוף הראשון ועד לסוף התארכות ב -20 °16. שיטה בעלת תפוקה מלאה למחצה שבה יכולות להיות הדמיה של קבוצות גדולות של עוברים בו, שימושיות לאירועים בקנה מידה זה, משום שהיא מאפשרת הדמיה של תנאים מרובים במקביל לגודל הרכב מספיק עבור כל תנאי כדי לאפשר אנליזהכמותית(איור 1א).

שיטת הדמיה של תפוקה גבוהה למחצה ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה זו מתארת חבילה של כלים ושיטות שפותחו כדי לאפשר מאמצים גדולים יותר לפרופיל הפונקציה של גנים בהתפתחות עובריים בג. שיטת התפוקה הגבוהה שלנו למחצה מאפשרת הדמיה של זמן תלת-ממד של התפתחות עובריים ברזולוציה של 20 דקות עבור 80 – 100 עוברים בניסוי אחד. בעוד פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש עם זן סמן הרצוי (s), עבודה זו ממחישה את הפוטנציאל של השיטה באמצעות שני זנים מותאמים אישית שפותחו כדי לפקח על אירועים במהלך embryogenesis: (1) מאמץ שכבת הנבט, שבו מסוימים הרקמה היזמים לכונן את הביטוי של האבנים פלורסנט כדי לסמן א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

S.D.O. היה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית בחסות אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו המחקר המוסדי ופיתוח הקריירה האקדמית פרס (NIH/IRACDA K12 GM068524). Ad ו K.O. תמכו על ידי המכון לודוויג לחקר הסרטן, אשר גם סיפק להם מימון מחקר המשמש לתמיכה זו עבודה. אנו אסירי תודה לאנדרו צ'ישולם על עצתו בשלבים המוקדמים של הפרויקט הזה, רונלד ביגס לתרומות לפרויקט זה לאחר שלב פיתוח השיטה הראשונית, ודייב ג'נקינס ואנדי Shiau לתמיכה וגישה לגילוי המולקולה הקטנה מערכת הדמיה של התוכן הגבוה של הקבוצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכלול צינור שואבDrummond Scientific2-000-000
פיפטה מכוילת (25 מ"ל)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager SoftwareYokogawa Electric Corpכלול בצינור חרוטי CV1000
(15 מ"ל)USA Scientific1475-0501
CV1000 מיקרוסקופYokogawa Electric CorpCV1000
שקופית דיכאון (3 בארות)Erie Scientific1520-006
מיקרוסקופ דיסקציהניקוןSMZ-645
צנטריפוגה אפנדורף 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJIקוד פתוחhttps://imagej.net/Fiji
מעבדת מאגר M9מוכנהhttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)USA Scientific1615-5500
Microseal F-foil SealBio-RadMSF1001
NGM PlatesLab מוכןhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
אזמל #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 באר, F-bottom, גריינר תחתון זכוכיתBio-One781855
טטרמיסול הידרוכלורידSigma AldirchT1512-10G
פינצטה, Dumont #3מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית0109-3-PO
U-PlanApo מטרה (10× 0.4 NA)אולימפוס1-U2B823
U-PlanApo מטרה (60&1.35 NA)אולימפוס1-U2B832

מקורות

  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
  3. Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948(2012).
  4. Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
  5. Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
  6. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
  7. Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
  8. Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
  9. Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
  10. Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
  11. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
  12. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
  13. Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  16. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
  17. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
  18. Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
  19. Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848(2010).
  20. Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
  21. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
  22. Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
  23. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
  24. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
  25. Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימוי פסק-זמן בתלת-ממדתוכנה לחיתוך עובריםערכת כלים לוויזואליזציה ב-ImageJזני סממנים פלואורסצנטייםמיקרוסקופיה קונפוקליתניתוח נתונים אוטומטיסריקה מבוססת RNAiפרוטוקול להכנת עוברים
שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.