לכאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הדור הניתן להתרבות של אורגנואידים האשך של חזירי עם ארכיטקטורת רקמה ספציפית בראש באמצעות מערכת התרבות הזמינה מסחרית למיקרוגל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור של מבנה האשך של פורצין עם הארכיטקטורה הספציפית ביותר באמצעות התרבות של המיקרוגל
במאמר זה
סיכום
תקציר
אורגנואידים הם שלושה מבנים ממדיים המורכב מסוגי תאים מרובים המסוגלים ללכוד את ארכיטקטורת הרקמה ופונקציות של איברים בvivo. היווצרות אורגנואידים פתחה שדרות שונות של מחקר בסיסי וטרנסלייתי. בשנים האחרונות, אורגנואידים האשכים צברה עניין בתחום ביולוגיה של הגבר הרבייה. אורגנואידים האשכים לאפשר את המחקר של אינטראקציות תא תא, התפתחות רקמות, ואת התא הנבט נישה מיקרואקולוגיה ולהקל על התפוקה הגבוהה של סמים והקרנות רעילות. שיטה נדרשת באופן אמין ומתוכשל ליצור אורגנואידים האשכים עם הרקמה הספציפית של רקמת רקמות. מערכת התרבות של המיקרוגל מכילה מערך צפוף של המיקרוגל בצורת פירמידה. תאים האשכים נגזר מפני האשכים pubertal הם centrifuged לתוך המיקרוגל האלה ותרבותי כדי ליצור אורגנואידים האשכים עם ביקורות-הרקמה הספציפית בדיקות ואגודות תאים. בתהליך זה ניתן ליצור אלפי אורגנואידים אחידים. הפרוטוקול המדווח כאן יהיה עניין נרחב לחוקרים הלומדים רבייה גברית.
מבוא
בשנים האחרונות, היתה תחייה של עניין באורגנואידים תלת ממדיים. איברים שונים כגון המעי1, בטן2, הלבלב3,4, הכבד5, ואת המוח6 נגזר בהצלחה לתוך 3d מערכות אורגאיד. לאורגנואידים אלה יש דמיון אדריכלי ופונקציונלי לאיברים בvivo והם רלוונטיים יותר ביולוגית לחקר מיקרואקולוגיה של רקמות מאשר מערכות התרבות7. כתוצאה מכך, מארגני האשכים החלו לקבל ריבית כמו גם8,9,10,11,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: האשכים מ 1-שבוע החזרזירונים התקבלו מחוות חזיר מסחרית כתוצר לידי מסירוס של חזירים מסחריים. המקור של האשכים אושרה על ידי ועדת הטיפול בעלי חיים באוניברסיטת קלגרי.
1. הכנת פתרונות אנזימים לעיכול רקמות
הערה: יש צורך בשלושה פתרונות אנזימטיים שונים, הכוללים שתי פתרונות לקולגן שונים (פתרון A, B) ופתרון deoxyribonuclease I (DNase I).
- כדי להכין את הפתרון A, לפזר 20 מ"ג של הקולגן של העירוי (טבלת חומרים) ו 40 מ"ג של הקולגן של הרביעי W (טבלת חומרים) ב 25 מ ל של בינונית הנשר השונה של Dulbecco של מדיום (dmem). לאחר מכן לסנן לעקר עם מסנן יקרומטר 0.22. הוסף 0.4 mL של סרום העוברי (....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תאים מבודדים מ 1-שבוע האשכים חזירי שהיו מתורבתים במיקרוגל עצמי מאורגן לתוך spheroids (איור 1A, איור 2), עם החיצוני הנבדל ונפרד (אפיתל הרקמות) ותאי פנים ( interstitium) (איור 1ב, איור 2). שני התאים היו מופרדים על ידי קולגןהרביעי וקרום מרתף. L1+ ve תאים נבט ו GATA4+ ve sertoli תאים היו בתא החיצוני על קרום ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקמנו שיטה פשוטה המאפשרת את עקבית, הדור לשחזור של מספר גדול של אורגנואידים האשכים עם אדריכלות רקמות דומה להעיד ב vivo12. בעוד הגישה פותחה באמצעות תאי התפיסה של חזירי, היא ישימה יותר באופן כללי גם על העכבר, הפרימטים הלא אנושיים ו-האדם12. מספר שיטות שונות דווחו להפקת אורגנואידים האשכים8,9,10,11. Baert et אל. שנוצר האשכים האנושיים אורגנואידים ממבוגרי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לדוקטור אנגרין יש אינטרס פיננסי. בטכנולוגיית הצובר כממציא
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי NIH/HD091068-01 לד ר רינה דוברינסקי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת תרבית רקמה צמודה נמוכה במיוחד 100 מ"מ | קורנינג | #CLS3262 | |
| צלחת תרבית רקמות 100 מ"מ | קורנינג | #353803 | |
| Aggrwell 400 | טכנולוגיות תאי גזע | #34411 | |
| טכנולוגיות תאי גזע תמיסת שטיפה נגד היצמדות | #07010 | ||
| קולגנאז מסוג IV מבית Clostridium histolyticum | סיגמא-אולדריץ' | #C5138 | המכונה קולגנז IV S |
| קולגנאז סוג IV וורת'ינגטון | וורת'ינגטון-ביוכימיה | #LS004189 | המכונה קולגנאז IV W |
| דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקר | סיגמא-אולדריץ' | #DN25 | |
| דולבקו s Modified Eagle' s בינוני/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני - גלוקוז גבוה | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco' s פוספט בופר | מלח סיגמא-אולדריץ' | #D8537 | |
| גורם גדילה אפידרמיס | מו"פ & D Systems | #236-EG | |
| מסנני תאי פלקון 70 ומיקרו; m | FisherScientific | #352350 | |
| מסנני תאי פלקון 40 ומיקרו; m | FisherScientific | #352340 | |
| סרום בקר עוברי | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| אינסולין-טרנספרין-סלניום | Gibco | #41400-045 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | סיגמא-אולדריץ' | #P4333 | |
| רקמת אשך חזירית | Sunterra Farms Ltd (אלברטה, קנדה) | ||
| Steriflip-GP צינור צנטריפוגה סטרילי יחידת מסנן עליון | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
מקורות
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
