מאמר שיטה

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

DOI:

10.3791/60422

⸱

26 בנובמבר 2019

 ,  , 
1Department of Zoology, The University of British Columbia, 2Life Sciences Institute, The University of British Columbia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות המורכבות של מערכות רב-תאיים לבלבל את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים החילוץ והתנהגויות הסלולר הפרט. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את הקשר הישיר בין הרמזים תלויי הקשר וצירי החלוקה באמצעות שימוש בשיטת C. אלגיה העובר בלסטומרים וחרוזי פוליסטירן מוקצף.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במערכות רב-תאיים, תאים בודדים מוקפים ברמזים פיזיים וכימיים שונים המגיעים מתאים שכנים ומהסביבה. מורכבות רקמות זה מבלבלת את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים חיצוניים ודינמיקה סלולרית. מערכת מלאכותית מחדש מתגבר על בעיה זו בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לבדוק אות מסוים תוך חיסול אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש דפוסי קשר של התאים עם האלגיה הבודד Caenorditis בלייסטורה ומחרוזות פוליסטירן מוקצף. ההליכים כוללים הסרת קליפת ביצה, בידוד בלסטורה על ידי שיבוש תא תא הדבקה, הכנת חרוזים פוליסטירן מוקצף, והחוקה של תא תא או קשר עם חרוז תא. בסופו של דבר, אנו מציגים את היישום של שיטה זו כדי לחקור את הכיוון של צירי החטיבה התאית התורמת לוויסות הריבוב הסלולר המרחבי ואת מפרט הגורל התא בפיתוח עוברים. שיטת החשיבה האיתנה והמגוונת מאפשרת ללמוד יחסים ישירים בין דפוסי קשר של תאים מרחביים ותגובות סלולריות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך פיתוח רב-תאיים, התנהגויות הסלולר (למשל, ציר החלוקה) של תאים בודדים מצוינים באמצעות רמזים כימיים ופיזיים שונים. כדי להבין כיצד תא בודד מפרש מידע זה, וכיצד הם מסדירים הרכבה רב-תאיים כמאפיין מתהווה מהווה אחת המטרות הסופיות של לימודי הורפוגנזה. האורגניזם מודל C. אלגיה תרם באופן משמעותי להבנת הרגולציה ברמה התאית של מורפוגנזה כגון קוטביות תא1, תא הניתוח1, החלטה של תא הגורל2, ותקנות בקנה מידה של רקמות כגון החיווט העצבי3 ו אורגנוגנזה4,5. למרות שיש כלים גנטיים שונים זמינים, שיטות הנדסת רקמות מוגבלות.

שיטת הנדסת הרקמה המוצלחת ביותר בחקר ה -C. אלגיה היא הבידוד הקלאסי של6; כמו העובר C. אלגיה מוקפת קליפת ביצה וחדירות מחסום7, הוצאתם היא אחת הפרוצדורות העיקריות של שיטה זו. בעוד שיטת הבידוד הבלסטורה מאפשרת ליצור מחדש את הקשר של תא התא באופן פשוט, הוא אינו מאפשר חיסול של רמזים לא רצויים; קשר התא עדיין מהווה הן מכני (למשל, הדבקה) ורמזים כימיים, ובכך להגביל את היכולת שלנו לנתח באופן מלא את הקשר הסיבתי בין האות והתנהגות תאית.

השיטה המוצגת במאמר זה משתמשת carboxylate אוחר שונה פוליסטירן מחרוזות שיכול לאגד באופן מיטבי לכל מולקולות של האמין-תגובתי כולל חלבונים כמו ליגנדס. במיוחד, השתמשנו בצורה של מין מגיב-מאמין של rhodamine אדום-X כמו ליגנד כדי לעשות חרוזים הן העקיבה החזותית ודבק לתא. קבוצות קרבוקסילי של משטח חרוז וקבוצות אמין הראשי של ליגנד מולקולה הם ביחד על ידי מסיס מים קרבודיאימיד 1-אתיל-3-(dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד (edac)8,9. חרוזים מקבל דבק לאפשר את ההשפעות של הרמז המכני על דינמיקה סלולרית10. השתמשנו בטכניקה זו כדי לזהות רמזים מכניים הנדרשים לכיוון חלוקת תאים10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פוליסטירן מוקצף לחרוז

הערה: פרוטוקול זה אינו דורש טכניקה אספזיהומית.

  1. שוקל 10 מ ג של carboxylate אוחר שונה פוליסטירן חרוזים בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
  2. כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף 1 מ ל 2-(N-מורגואולנו) מאגר חומצה ethanesulfonic (MES) לתוך השפופרת. מאז מאגר MES אינו מכיל פוספט ו אצטט, אשר יכול להפחית את הפעילות מחדש של קרבודיאימיד, הוא מתאים לשימוש בתגובת צימוד חלבון. מערבולת הצינור לערבב את החרוזים.
  3. ספין הצינור עבור 60 s ב 2,000 x g באמצעות צנטריפוגה העליון שחקן.
  4. השמט את הסופרנטנט בזהירות מתוך הוצאת המאגר.
  5. שטוף שוב את החרוזים עם 1 מ ל של מאגר MES על-ידי ביצוע השלבים הבאים 1.2-1.4.
  6. הוסף 1 מ ל של מאגר MES המכיל 10 מ"ג של edac לתוך הצינור להפעיל את פני השטח קרבוקסילי. מערבולת הצינור לערבב את החרוזים.
  7. לסובב את הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. לסובב את החרוזים עבור 60 s ב 2,000 x g.
  9. השמט את הסופרנטנט בזהירות מתוך הוצאת המאגר.
  10. כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף 1 מ ל של מלוחים באגירה פוספט (PBS) לתוך הצינור. מערבולת הצינור לערבב את החרוזים.
  11. ספין במורד הצינור עבור 60 s ב 2,000 x g.
  12. השמט את הסופרנטנט בזהירות מתוך הוצאת המאגר.
  13. שטוף שוב את החרוזים עם 1 מ ל של PBS על ידי הצעדים הבאים 1.10-1.12.
  14. הריכוז הסופי של הרדמון בשימוש יהיה תלוי במתח הנמצא בתמונה. הכינו 1 מ ל של 1-, 10-, 100-, ו-1000 מתקפל סדרת דילול של Rhodamine אדום-X מתוך 0.65 mM Rhodamine אדום-X הפתרון מניות.
  15. פיפטה 20 μL של חרוזים. לכל צינור הדילול הסדרתי
  16. לסובב את הצינור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  17. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ ל של PBS בצעדים חוזרים 1.10-1.12.
  18. הוסיפו 1 מ ג של PBS לתוך הצינור ואחסנו אותו ב -4 ° c עד 6 שבועות. בדקו את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של החרוזים מתחת למיקרוסקופ המשמש ליצירת הדמיה חיה. הריכוז המתאים של אסתר האדום-X של הרודטין, הינו תלוי בתנאי ההדמיה (איור 1).
    הערה: חרוזים ללא הטיפול האדום-X של Rhodamine אינם נצמדים לתא. Rhodamine אדום-X משמש סמן פלואורסצנטית, כמו גם מולקולה דבק. האינטראקציה האלקטרו-סטטית בין הטעינה החיובית של Rhodamine אדום-X וממברנה פלזמה טעונה שלילית היא גורם הדבקה.

2. מכלול פיפטה בפה

  1. גזור רחב (קוטר הפנימי 6.35 מ"מ) וצרה (3.175 מ"מ בקוטר הפנימי) הצינורות Tygon אל כ 25 ס"מ ו 40 ס מ אורך, בהתאמה (איור 2).
  2. לחבר את צינורות tygon עם מסנן polyטטרפלואורואתילן (0.2 יקרומטר גודל נקבובית) (איור 2).
  3. פירוק צינור מסחרי זמין מסחרית ולצרף את המחזיק נימי שלו ו לסוף צינורות Tygon רחב, בהתאמה (איור 2).
    הערה: באמצעות פיפטה בפה, נעשה שימוש במסנן הצדפות כדי למנוע שאיפת אדים של תמיסת היפוכלוריט.

3. בידוד של העובר בלסטורה

הערה: לבש כפפות ומעיל מעבדה כדי למנוע גזירה וקשר עם פתרון הלבנת.

  1. החזיקו כל קצה של מיקרונימי (קיבולת; 10 μL) עם יד ימין ושמאל.
  2. משוך את המיקרוקפילר לעבר שני הקצוות כדי להחיל מתח ולהביא את מרכז הקפילר על פני מבער כדי ליצור שתי נימיםמשכוביד (איור 3א).
  3. חתוך את קצות נימים משכו ביד עם מלקחיים מתחת למיקרוסקופ מבתר וחברו את הנימים הנמשכים לתוך מכשיר ליטוף בפה (איור 2). הכינו שני סוגי פיפטות. גודל הפתיחה של הטיפ עבור הפיפטות צריך להיות כ-2x ו-1x אורך הציר הקצר של העוברים (30 μm) עבור העברת העובר והסרת קליפת המין, בהתאמה איור 3B-D).
  4. פיפטה 45 μL של תמיסת מלח ביצה על הבאר של שקופית רב-שכבתי (איור 4א; למטה).
  5. מניחים 5-10 למבוגרים בלבד הכולל תמיסת מלח ביצים.
  6. כדי להשיג את העוברים המוקדמים של המחוז , חותכים מבוגרים לחתיכות על ידי מיקום שתי מחטים לימין ולשמאל של הגוף C. אלגיה והזזת המחטים מעבר לשני (איור 4א; תרשימים עליונים).
  7. פיפטה 45 μL של תמיסת היפוכלוריט על באר ליד הבאר המכילה את תמיסת מלח הביצה (איור 4ב).
  8. פיפטה 45 μL של מדיום הגדילה של שלטון על שלוש הבארות הבאות לצד הבאר המכילה את הפתרון ההיפוכלוריט (איור 4ב).
  9. העבר את השלב הראשון של התאים והשלב המוקדם של שני תאים לתוך התמיסה של ההיפוכלוריט באמצעות נימי הפה עם הקפילר המצויר ביד להעברת העובר (איור 4ב').
  10. המתן 40-55 s.
  11. שטפו את העוברים באמצעות העברת העוברים מתמיסה היפוכלוריט לתוך מדיום הצמיחה של שלטון בעזרת הקפילר המצויר ביד לצורך העברת העובר (איור 4ב').
  12. שטוף את העוברים שוב על ידי העברת העוברים לבאר חדשה של מדיום הצמיחה של שלטון על ידי מלטף עם הקפילר מצוירת ביד להעברת העובר (איור 4ב).
  13. העבר את העוברים שטף לבאר חדשה של בינונית הצמיחה של שלטון ידי ליטוף עם הקפילר ביד להעברת העובר. בעזרת הקפילר המצויר ביד להסרת קליפת ביצה, חזרו בזהירות על הפיליטוף (איור 4ג; תרשימים אמצעיים). אם ביצה הוסר בהצלחה, התאים העובריים יהפכו יותר כדוריים (איור 4ג; ימין).
  14. הפרד בין הבלסטומרים העובריים בשלב שני תאים בעדינות ובאופן רציף עם נימי הידיים הנמשכים להסרת קליפת ביצה (איור 4ד).

4. החוקה של דפוסי קשר עם בלסטורה ו חרוז

הערה: עבודה תחת מיקרוסקופ הדמיה כדי למנוע הדיסוציאציה של תא מתוך חרוז כדי להקל על רכישת תמונה בזמן.

  1. כדי להתבונן במיקרוסקופ הפוך, הכינו חדר דימות כמו באיור 5.
    1. מניחים שמיכות על מחזיק שמיכות (איור 5א).
    2. הקלטת את קצות הכיסויים כדי לייצב אותו. הצד עם הקלטת הוא הצד האחורי (איור 5א, ב).
    3. הפוך את מחזיק הכיסויים אל הצד הקדמי וצייר עיגול על שמיכות עם עט הידרופובי (איור 5ג).
      הערה: כל מאכל בתחתית הזכוכית פועל גם כן, בתנאי שהעוברים ממניחים על ידי הפיפטה בפה.
  2. הוסף את מדיום הצמיחה של שלטון בתוך המעגל שצויר על ידי סמן ההידרופובי (איור 5ד).
  3. העבירו את הבלסטורה המבודד. לחדר ההדמיה
  4. מחלק נפח קטן מהחרוזים המשואמים בעזרת נימי היד הנמשכים להעברת העובר.
  5. לשלוט על המיקום של חרוזי פוליסטירן על ידי פיצוץ לתוך הנימים מצוירת ביד עד חרוז מתחבר לבלסטורה מבודדת.
  6. הר שמיכות כדי למנוע אידוי של בינונית (איור 5E). בצע הדמיה חיה.

5. הכנת ריאגנטים חשוב

  1. ביצה פתרון מלח (10 mL): לשלב 235 μL של 5 M הנאל ו 240 μL של 2 M KCl עם 9525 μL של dH2O.
  2. היפוכלוריט פתרון (10 mL): לשלב 7.5 mL של Clorox (המכיל כ 7.5% היפוכלוניט נתרן) עם 2.5 mL של 10 N NaOH (הריכוז הסופי של היפוכלוריט נתרן הוא כ 5.625%).
    הערה: למרות שיטות רבות שפורסמו השתמשו chitinase כדי לעכל קליפות בביצים הרסניות, אימצנו שיטה באמצעות היפוכלוניט פתרון11. על ידי הימנעות אצווה-to-אצווה וריאציות של פעילויות chitinase, אנו מאמינים שיטה זו היא יותר להיות הגישה האפקטיבית וחסכונית.
  3. 0.81 מ"מ פתרון אינולין (40 mL)
    1. הוסף 0.2 גרם של אינולין ל 40 מ ל של dH2O.
    2. האוטוקלב להתמוסס.
      הערה: ממשיך לחודש אחד ב -4 ° c.
  4. 0.5 M מאגר מס (500 mL)
    1. התמוססות 48.81 גרם של MES ב400 מ ל של מים מזוקקים (dH2O).
    2. התאם את ה-pH ל-6.0.
    3. הביאו את אמצעי האחסון הכולל ל-500 mL עם dH2O.
  5. הפתרון PBS (1 ל)
    1. כדי להפוך את פתרון ה-PBS 10 לקפל, לפזר חבילה 1 של אבקת PBS מראש x 1 L של dH2O.
    2. שילוב 100 mL של פתרון PBS 10 מתקפל עם 900 mL של dH2O.
  6. 5% pvc פתרון (4 מ ל)
    1. בתנאים סטריליים, לפזר 0.2 g של PVP ב 4 מ ל של דרוזוהילה שניידר בינונית.
      הערה: יש לפתוח תמיד את המניה הבינונית של שניידר במכסה התרבות של הרקמה (TC). המשך חודש אחד ב -4 ° c.
  7. מ0.65 מניות אדום-X של הרודאמלין (2 מ ל)
    1. שוקלים 1 מ ג של רומדיין אדום-X.
    2. הוסף 2 מ ל diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לפזר.
    3. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
  8. בינוני הגדילה של שלטון (SGM) (10.25 mL)
    1. בתנאים סטריליים, לשלב 8 מ ל של דרוזוהילה שניידר בינונית, 1 מ ל של פתרון PVP, 1 מ ל של פתרון אינולין, 1 מ ל של בסיס הנשר הבזאלי (BME) ויטמינים, 50 μL של פניצילין-סטרפטומיצין, ו 100 μL של ליפיד להתרכז יחד.
    2. Aliquot 325 μL של SGM לתוך 1.5 mL מיקרוצינוריות.
      הערה: המשך כחודש אחד ב -4 ° c.
    3. ביום של בידוד בלסטורה, הוסף 175 μL של סרום של שור עוברי (FBS) אל SGM (עבור נפח כולל של 500 μL).
      הערה: החנות FBS ב-20 ° צ' והפשרת אותו לפני השימוש. FBS לא צריך להיות הרוגים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור הכנת חרוזים, קבענו את הכמות האופטימלית של הרדאמלין אדום-X מסוג הרמדמידימאדיל עבור הזן הטרנסגניים המבטא GFP-רירן II ו-mCherry-histone (איור 1א-ד). השתמשנו mcherry מתויג היסטון כסמן של התקדמות מחזור התא. מכיוון הן rhodamine אדום-x ו-mcherry יהיה מואר על ידי 561 ננומטר לייזר, האינטנסיביות האופטימלית של האות האדום rhodamine הוא דומה לזה של היסטון לאפשר הדמיה בו של תא ו חרוז. לדוגמה, האות הפלואורסצנטית מהחרוז שטופל עם 0.005 μg/mL הייתה חלשה מכדי להמחיש את החרוז (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקה החוזרת של דפוסי קשר של תא מפושט יאפשר לחוקרים לבדוק את התפקידים של דפוסי קשר תאים ספציפיים בהיבטים שונים של הורפוגנזה. השתמשנו בטכניקה זו כדי להראות כי ציר החלוקה של התאים נשלט על ידי מגע פיזי עם חרוזים הדבק10. כמו מפרט ציר החלוקה הוא חיוני עבור פיתוח רב-תאיים על ידי תורם מורפוגנזה14, תא גזע החטיבה15,16, והומאוסטזיס רקמות15,16, שיטה זו אמורה להיות מסוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא מצהירים על ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג פרינס ולברוס בוקרמן לקבלת ייעוץ ולמתן זנים של C. אלגיה , דון מירמן, קוטה מיזומוטו, ומכון למדעי החיים במכון לעיבוד ציוד וריאגנטים, אחאי הירוסו, ליסה פרננדו, מין ג'י קים למען תחזוקת הג והקריאה הקריטית של כתב היד שלנו. העבודה שלנו נתמכת על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochlorideAlfa AesarAAA1080703להכנת החרוזים
מכלול צינור שואבDrummond21-180-13לבידוד הבלסטומר.
זן Caenorhabditis elegans: N2,גנטיקה של Caenorhabditisבר N2זן ששימש במחקר זה
זן Caenorhabditis elegans: KSG5, גנוטיפ: zuIs45; itIs37בביתזן KSG5ששימש במחקר זה
Mircopipets מכויל, 10 ומיקרו; LDrummond21-180-13לבידוד הבלסטומרים
חרוזי פוליסטירן שעברו שינוי קרבוקסילט (30 ומיקרו; קוטר מ ')KISKER BiotechPPS-30.0COOHPלהכנת חרוזים
CD Lipid ConcentrateLife Technologies11905031לבידוד הבלסטומר. עבודה במכסה המנוע של תרבית רקמות.
קלורוקסקלורוקסנ. א.לבידוד הבלסטומר. פתח בקבוק חדש כאשר הטיפול בהיפוכלוריט אינו עובד טוב.
מחזיק כיסויבביתנ.א.לבידוד הבלסטומר.
מיקרוסקופ ניתוח: Zeiss Stemi 508 עם מעמד M. מקור האור הוא LED מובנה. הגדלה של חתיכת העין היא פי 10.Carl ZeissStemi 508לבידוד הבלסטומר.
סרום בקר עוברי, מוסמך זריקה אחת, ממוצא קנדהGibcoA3160701לבידוד הבלסטומר. עבודה במכסה המנוע של תרבית רקמות.
שימוש כללי ומחטים היפודרמיות להחלקה מדויקת, 25 מדBD14-826AAלבידוד הבלסטומרים
אינוליןאלפא AesarAAA1842509לבידוד הבלסטומרים
MEM Vitamin Solution (100x)Gibco11120052לבידוד הבלסטומר.
MES (גבישים לבנים עדינים)פישר ביו-ריאגנטיםBP300-100להכנת החרוזים
שקופית רב-מבחנית 10 בארMP ביו-רפואיתICN6041805לבידוד הבלסטומרים
PBS, מי מלח חוצץ פוספט, 10 x אבקתפישר ביו-ריאגנטיםBP665-1להכנת החרוזים
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Gibco15140148עבור בידוד בלסטומר.
פוליוויניל פירולידוןפישר ביו-ריאגנטיםBP431-100לבידוד הבלסטומרים
אשלגן כלוריביושופPOC888לבידוד הבלסטומרים
רודמין אדום-X, סוקסינימידיל אסטר,בדיקות מולקולריותR6160להכנת החרוזים
שניידר s Drosophila Sterile MediumGibco21720024לבידוד הבלסטומר. עבודה במכסה המנוע של תרבית רקמות.
נתרן כלוריביושופSOD001
לתמיסת נתרן הידרוקסידN Fisher ChemicalSS255-1לבידוד הבלסטומרים
מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב: Yokogawa CSU-X1, היקף הפוך של Zeiss Axiovert, מצלמת Quant EM 512, עדשת אובייקטיבית 63X NA 1.4 Plan apochromat. המערכת נשלטה על ידי Slidebook 6.0.חדשנות הדמיה חכמהנ.א.להדמיה חיה
מסנני מזרק, PTFE,Basix13100115לבידוד הבלסטומר.
צינורות מעבדה Tygon S3, ניסוח E-3603, קוטר פנימי 3.175 מ"מSaint Gobain Performance Plastics89403-862לבידוד הבלסטומר.
צינורות מעבדה Tygon S3, ניסוח E-3603, קוטר פנימי 6.35 מ"מSaint Gobain Performance Plastics89403-854לבידוד הבלסטומר.
מרכז מסוג 5 איזומרים לבידוד בלסטומר, 10 לא סטרילי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624(2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C Elegans EmbryoBlastomere IsolationCell Contact ReconstitutionEggshell RemovalCapillary PreparationFluorescent LabelingLive ImagingSpindle OrientationCell Division Axis

מאמרים קשורים