הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60453

⸱

28 בנובמבר 2019

 ,  , 
1Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 2O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.

תקציר

הגידול הנגזר הקרנף איתות הוא רכיב מתעלמים של דיכוי חיסוני מקומי והוא יכול להוביל לסביבה מתירני עבור גידול בסרטן המתמשך גרורות. אותות הפרדרין יכול לכלול מגע תא תא בין סוגי תאים שונים, כגון PD-L1 ביטא על פני השטח של גידולים הקשורים ישירות עם PD-1 על פני השטח של תאי T, או הפרשת ליגולים על ידי תא הגידול כדי להשפיע על תא החיסון. כאן אנו מתארים שיטה שיתוף תרבות כדי לחקור את ההשפעות של הגידול מופרש ליגנדס תא החיסונית (מקרופאג) הפעלה. הליך זה פשוט מנצל מסחרית זמין 0.4 יקרומטר ממברנה פוליקרבונט חדירות תומך ולוחות התרבות רקמה סטנדרטית. בתהליך המתואר, מקרופאגים הם מתורבתים בחדר העליון תאים סרטניים בחדר התחתון. הנוכחות של מכשול 0.4 יקרומטר מאפשר לימוד של איתות התרבות ללא משתנה מייסד של מגע פיזי, כי שני סוגי התא לחלוק את אותו בינונית וחשיפה לליפות הקרנף. גישה זו יכולה להיות משולבת עם אחרים, כגון שינויים גנטיים של המקרופאג (למשל, בידוד מן העכברים לנקוש החוצה גנטית) או גידול (למשל, CRISPR-בתיווך שינויים) כדי ללמוד את התפקיד של גורמים מופרשים ספציפיים וקולטנים. הגישה גם משאיל את עצמה לניתוחים ביולוגיים מולקולריים סטנדרטיים כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת (רביעיית-PCR) או ניתוח כתמי אבן מערבי, ללא צורך במיון זרימה כדי להפריד בין שתי אוכלוסיות תאים. חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) יכול להיות באופן דומה להיות מנוצל כדי למדוד מופרש ליגנדס כדי להבין טוב יותר את האינטראקציה הדינמית של איתות התא בהקשר סוג תא מרובים. משך התרבות המשותף יכול להיות מגוון גם לחקר האירועים המווסתים באופן זמני. שיטה זו שיתוף תרבות היא כלי חזק המקל על חקר אותות הגידול מופרש בהקשר החיסונית.

מבוא

מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו ביכולת של תאים סרטניים כדי למנוע זיהוי על ידי תאים חיסוניים, לדכא את ההפעלה החיסונית המקומית, או לייצר הגידול tolerogenic מתירני הגידול מיקרוסביבה. שתי שיעורים רחבים של גידול ואינטראקציות תאים החיסונית תוארו כי להקל על ההשפעות הללו: קשר-מתווך אינטראקציות או ליגניות המופרשים. אחד הטוב ביותר לחקור מנגנוני צייתן קלינית של קשר-תיווך החיסונית עיכוב מנוצל על ידי גידולים היא הביטוי של pd-L1, אשר אינטראקציה עם PD-1 על התאים T לעכב את ההפעלה שלהם פונקציה1,2. בתגובה אינטרפרון-גמא (IFNγ), אשר מתבטא על ידי מספר תאים חיסוניים מופעלים, תאים סרטניים יכולים להגביר את הביטוי של PD-L1 כדי לגרום לתשישות של PD-1 – הבעת הפעלת תאי T, ובכך למנוע מהם ביעילות להשמיד תאים סרטניים3. השימוש נוגדנים לחסום את האינטראקציה בין PD-L1 ו-PD-1 משמש כיום לטיפול בסוגי סרטן מרובים בבני אדם4. לאור ההצלחה הקלינית הזאת ואחרים, הזיהוי והמיקוד של מנגנוני הדיכוי האנטי-סרטניים, קיבל את תשומת הלב הגוברת.

מעבר דיכוי של חסינות אדפטיבית, גידולים ידועים גם להפריש גורמים לדכא את התגובות הפרו דלקתיות של תאים חיסוניים מולדים. גידול נגזר או הפרשות הגידול המושרה, כולל il-6, il-10, וגרה, il-23, ואת המושבה גורם ממריץ (שדרתי-1), הוכחו לעכב את תגובות הגידול של הרוצח הטבעי (NK) תאים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטים ב מיקרוסביבה הגידול5,6,7. תאים סרטניים יכולים גם להפריש גורמים הטיית הגיוס והבידול של תאים מיאלואידית-נגזר במיקרו הסביבה הגידול כדי לקדם את הדיכוי של ההפעלה תא T8,9.

סוג אחד של תא מולדים החיסון כי יש השפעה עמוקה על התקדמות הגידול הוא מקרופאג. במשך שנים רבות, הנוכחות של מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) השתמשו כתחזיות שליליות של הישרדות החולה10. המושג כי מדכאים TAMs לצנן את התא החיסונית מתווכת הסיווג של גידולים הוצג לפני יותר מ 40 שנים11. לאחרונה, זה הוכח כי התגובה מקרופאג pro-דלקתיות יכול להיות מוסדר בעוד פנוטיפ הגידול pro יכול להיגרם מיקרוסביבה הגידול. אלה מקרופאגים מדכאים יכול לתרום לתגובה tolerogenic, נהיגה התקדמות הגידול ועמידות לכימותרפיה-טיפול חיסוני12. בהינתן כי מקרופאגים הם לעתים קרובות אחד לוקיציטים הנפוץ ביותר עם הגידול, שחזור של פעילות החיסון הספציפי שלהם לגידול מייצג יעד פוטנציאלי עבור תרופות נגד סרטן therapeutics13.

בעוד קשר-מתווך אינטראקציה בין תאים סרטניים מקרופאגים ניתן להקים באמצעות התרבות coculture ישירה, השימוש של ממברנה חדיר תומך יכול להבהיר איזה גורם הגידול מופרש הם החיסונית ללא השפעה הפוטנציאל של הגידול-תא החיסונית החיסון המגע. באמצעות שיטות דומות במקצת, אחרים הוכיחו את הפוטנציאל של זיהוי גורמים מופרש ב microglia/האינטראקציות נוירואליות14 , כמו גם תאים סרטניים עם תאים mesothelial15. יש לנו גם בהצלחה את הטכניקה שיתוף התרבות הזאת כדי לאפיין את התפקיד של חלבון מופרש הגידול, Pros1, כמו מדכא של ביטוי גנים פרו דלקתית לאחר גירוי של מקרופאגים הצפק עם LPS ו אינטרפרון-גמא16. כאן אנו מתארים מתודולוגיה ישירה כי ניתן להשתמש כדי לחקור כיצד גורמים מופרש הגידול יכול להשפיע על מקרופאג הפעלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים הקציר והשימוש של מקרופאגים הצפק מוריין נערכו באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ היל (UNC) ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים UNC והשתמש הוועדה (IACUC).

1. תרבות מקרופאג

הערה: הליך זה יכול לנצל את מקרופאגים הצפק הראשי (המתואר בפירוט להלן), מח עצם הנגזר מקרופאגים, או מקרופאג שורות תא כגון J774 (ATCC) או RAW264 (ATCC).

  1. קציר מקרופאגים הצפק כפי שתוארו בעבר16,17 ו צלחת ישירות לתוך החדר העליון (s) של ממברנה פוליאסטר מ0.4 יקרומטר להוסיף שיתוף תרבות 6 צלחת הבאר (איור 1a).
    הערה: התשואה המשוערת של מקרופאגים מכל בידוד הוא 1 x 106 הכולל תאים, כך המספר הממוצע של תאים לכל טוב הוא ~ 1.5 – 1.6 x 105 תאים בצלחת 6 היטב.
  2. תרבות מקרופאגים שנקטפו ב-בינוני הנשר המתוקן של דולבco (DMEM)/F12, 10% סרום של שור עוברי (FBS), 1 x פניצילין/סטרפטומיצין, 20 ng/mL מקרופאג המושבה גורם מגרה (M-שדרתי) במשך 3 ימים ב 37 ° c, 5% CO2.
    הערה: החדר העליון מכיל 1 מ ל של מדיום תרבות בעוד החדר התחתון מתמלא 1.5 mL. יש להוסיף את המדיום לכל חדר.

2. התרבות של תאים סרטניים עם מקרופאגים

  1. לפני השימוש, תרבות תאים סרטניים זמינים מסחרית במדיום המתאים שלהם בעקבות השיטות המומלצות לתרבות רקמות רקמה.
  2. לשטוף תאים סרטניים חסיד פעם עם מלוחים באגירה פוספט (PBS), להוסיף 0.05% טריפסין + ethylenedi37 amiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii השהה מחדש את התאים ב-FBS המכיל בינוני, כימות המספר הכולל של תאים באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תאים, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 220 x g כדי גלולה.
  3. במהלך הצנטריפוגה, מלבין את המדיום מן התאים העליונים והתחתונים של לוחיות התמיכה של קרום הממברנה המקרופאג המכילות ולהחליף במדיום טרי.
    1. לחדרי התחתון שבו תאים סרטניים יהיה מצופה, למלא עם 1 מ ל של בינונית במקום 1.5 mL כדי לאפשר נפח מספיק עבור התוספת התא.
  4. המדיום מוחלק מתאי הגידול מחדש ומשהה את התאים החוזרים ב-DMEM/F12 עם 10% FBS, 1x פניצילין/סטרפטומיצין, ו 20 ng/mL M-שדרתי בריכוז של 3 x 105 תאים/ml.
  5. הוסף 0.5 mL של 3 x 105 תאים/ml תאים סרטניים לחדר התחתון של בארות הרצוי (איור 1b).
    הערה: ניתן לטפל בתאים באופן מיידי.

3. טיפול בתאים משותפים

  1. כדי לגרום מקרופאג pro-דלקתיות ביטוי גנטי, לטפל ביחידים או שיתוף מקרופאגים על ידי הוספת 100 ng/mL IFNγ ו 50 ng/mL LPS.
    1. לשנות את משך זמני הטיפול בתרבות לפי הצורך. הפעלה מקרופאג מתרחשת בתוך 2 h וכמה מתווכת הגידול מתווך מתרחשת על ידי 8 h. שיתוף התרבות עבור 24 התשואות הגידול יציב ועקבי הדיכוי הנגזר.
      הערה: לחילופין, מקרופאגים יכולים להיות המושרה כדי לאמץ את הטיפול הפרו הפצע הריפוי דרך התוספת של גורמים כגון interleukin 10 (IL10), ואת ההשפעה של הגידול מופרש ליגנד המשוער.
  2. כשליטה שלילית, מקרופאגים של התרבות ביחידים ולא מטופל. בתור שליטה חיובית, לטפל ביחידים מקרופאגים תרבותי עם 100 ng/mL IFNγ ו 50 ng/mL LPS.

4. ניתוח במטה של תאים משותפים

  1. לאחר זמן הדגירה הרצוי חלף, לבודד את התא ליפוסט או בינוני תרבות ממוזג כרצונך, בהתאם לצורכי הבדיקה.
  2. כדי לבודד את התא ליפוסט עבור תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ניתוח, לחלק את התקשורת משני התאים של הבאר ולשטוף פעם אחת עם 2 מ ל של PBS. החל מאגר לפירוק RNA לחדר העליון המכיל את מקרופאגים. בעדינות לגרד את הקרום כדי לשחרר את התא ליפוסט, ולהעביר לצינור הקולקציה לעיבוד נוסף בהתאם לפרוטוקול של היצרן בידוד RNA ערכת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לקבוע את ההשפעה של ליגניות מופרש בגידולים על מקרופאג polarization, ההליך המתואר היה מנוצל. מקרופאגים הצפק תרבותי בהעדר תאים סרטניים שימשו שלילית (מטופל = רחוק משמאל) וחיובי (IFNγ ו-LPS מגורה = 2nd משמאל) פקדים (איור 2a). לחילופין, מקרופאגים הצפק היו שיתוף תרבותי עם תאים סרטניים B16F10 מלנומה (ATCC) (איור 1A). מיד לאחר ציפוי, תאים היו מטופלים עם IFNγ ו LPS או לא מטופל. לאחר 24 שעות של תרבות, מקרופאגים נקצרו, RNA שהוכנו, ו רביעיית-PCR הופיעו כדי למד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השינוי בתרבות שיתוף הציג כאן הוא שינוי של בחני שנקבעו בעבר, המאפשר לימוד של גורמים מופרש הגידול על הפעלת התא החיסונית. בעוד המגע תא התא ידוע כדי לגרום לשינויים בפעילות החיסונית, היכולת של הגידול המופרש גידולים לווסת את ההפעלה החיסונית הוא מובן פחות טוב. אנו מתארים שיטה אשר, שלא כמו שיתוף התרבות הישירה, ניתן להשתמש כדי לחקור כיצד הגידול נגזר הגורמים המופרשים ההשפעה על הפעלת התא החיסונית ללא האופי המייסד של הקשר-תיווך איתות. בהינתן החשיבות הקלינית הפוטנציאלית של ליגלים מופרש בגידולים בדיכוי חיסוני, שיטה זו מציעה כלי קל לשי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אריק Ubil היה ממומן, בין השאר, על ידי האגודה האמריקנית לסרטן החברה פוסט דוקטורט (128770-PF-15-216-01-LIB). העבודה נתמכה על ידי מענק NIH (R01-CA205398) ו סרטן השד מחקר הקרן פרס (BCRF 18-041) ל HSE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
B16-F10ATCCATCC CRL-6475
ערכת סינתזה cDNAPromegaA3500
DMEM/F12 מדיהThermoFisher Scientific- Gibco11320033
סרום בקר עובריMilliporeTMS-013-B
J774A.1ATCCATCC TIB-67
ליפופוליסכרידים מבית Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL5293-2ML
עכברים M-CSFProspecCYT-439
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)ThermoFisherScientific- Gibco15140122
Pros1 ELISAMyBioSourceMBS2886720
RAW264.7ATCCATCC TIB-71
עכבר רקומביננטי IFN&גמא;BioLegend575302
Sensimix SYBR ערכת Low-ROXBiolineQT625-05
Transwell חדיר תומךFisher Scientific07-200-170
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific- Gibco25200056

מקורות

  1. Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
  2. Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
  3. Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
  4. Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).
  5. Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
  6. Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
  7. Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
  8. Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
  9. Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
  10. Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
  11. Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
  12. Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
  13. Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
  14. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
  15. Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).
  16. Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
  17. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).
  18. Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

איתות פראקריניליגנדים מופרשים מגידולשיטת תרבית משולבתתמיכת ממברנה חדירהדיכוי חיסוני של גידולחלבון SWestern Blotאינטרפרון גמאגנים פרו-דלקתיים
לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.