לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

Kelly Pittman; Shelton Earp; Eric Ubil

doi:10.3791/60453

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60453

⸱

28 בנובמבר 2019

Kelly Pittman¹ , Shelton Earp¹ , Eric Ubil²

¹Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, ²O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.

תקציר

הגידול הנגזר הקרנף איתות הוא רכיב מתעלמים של דיכוי חיסוני מקומי והוא יכול להוביל לסביבה מתירני עבור גידול בסרטן המתמשך גרורות. אותות הפרדרין יכול לכלול מגע תא תא בין סוגי תאים שונים, כגון PD-L1 ביטא על פני השטח של גידולים הקשורים ישירות עם PD-1 על פני השטח של תאי T, או הפרשת ליגולים על ידי תא הגידול כדי להשפיע על תא החיסון. כאן אנו מתארים שיטה שיתוף תרבות כדי לחקור את ההשפעות של הגידול מופרש ליגנדס תא החיסונית (מקרופאג) הפעלה. הליך זה פשוט מנצל מסחרית זמין 0.4 יקרומטר ממברנה פוליקרבונט חדירות תומך ולוחות התרבות רקמה סטנדרטית. בתהליך המתואר, מקרופאגים הם מתורבתים בחדר העליון תאים סרטניים בחדר התחתון. הנוכחות של מכשול 0.4 יקרומטר מאפשר לימוד של איתות התרבות ללא משתנה מייסד של מגע פיזי, כי שני סוגי התא לחלוק את אותו בינונית וחשיפה לליפות הקרנף. גישה זו יכולה להיות משולבת עם אחרים, כגון שינויים גנטיים של המקרופאג (למשל, בידוד מן העכברים לנקוש החוצה גנטית) או גידול (למשל, CRISPR-בתיווך שינויים) כדי ללמוד את התפקיד של גורמים מופרשים ספציפיים וקולטנים. הגישה גם משאיל את עצמה לניתוחים ביולוגיים מולקולריים סטנדרטיים כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת (רביעיית-PCR) או ניתוח כתמי אבן מערבי, ללא צורך במיון זרימה כדי להפריד בין שתי אוכלוסיות תאים. חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) יכול להיות באופן דומה להיות מנוצל כדי למדוד מופרש ליגנדס כדי להבין טוב יותר את האינטראקציה הדינמית של איתות התא בהקשר סוג תא מרובים. משך התרבות המשותף יכול להיות מגוון גם לחקר האירועים המווסתים באופן זמני. שיטה זו שיתוף תרבות היא כלי חזק המקל על חקר אותות הגידול מופרש בהקשר החיסונית.

מבוא

מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו ביכולת של תאים סרטניים כדי למנוע זיהוי על ידי תאים חיסוניים, לדכא את ההפעלה החיסונית המקומית, או לייצר הגידול tolerogenic מתירני הגידול מיקרוסביבה. שתי שיעורים רחבים של גידול ואינטראקציות תאים החיסונית תוארו כי להקל על ההשפעות הללו: קשר-מתווך אינטראקציות או ליגניות המופרשים. אחד הטוב ביותר לחקור מנגנוני צייתן קלינית של קשר-תיווך החיסונית עיכוב מנוצל על ידי גידולים היא הביטוי של pd-L1, אשר אינטראקציה עם PD-1 על התאים T לעכב את ההפעלה שלהם פונקציה¹^,². בתגובה אינטרפרון-גמא (IFNγ), אשר מתבטא על ידי מספר תאים חיסוניים מופעלים, תאים סרטניים יכולים להגביר את הביטוי של PD-L1 כדי לגרום לתשיש....