מאמר שיטה

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60478

⸱

15 בנובמבר 2019

 , 
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה איתנה ומפורטת של ניתוח מיקרוטוכדורית בתאים מסונכרנים בprometaphase באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב של תא חי מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מבוסס MATLAB.

תקציר

אנו מתארים שינוי של שיטה מבוססת לקביעת הדינמיקה המיקרוכדורית בתאי החיים. הפרוטוקול מבוסס על הביטוי של סמן מקודד גנטית עבור הקצוות החיוביים של microtubules (EB3 מתויג עם חלבון פלורסנט tdTomato) ו במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה, הדמיה של תא חי באמצעות מיקרוסקופ הדיסק מסתובב מיקרוסקופית. סנכרון התאים והצפיפות המוגברת של microtubules מתבצעים על ידי הפרדה מרבית בתאי הmitotic, וניתוח הצמיחה מבוצע באמצעות תוכנת U-Track של מקור פתוח. השימוש בחלבון פלורסנט בהיר ואדום הוזז, בשילוב עם כוח לייזר נמוך יותר וזמן חשיפה מופחת הנדרש עבור מיקרוסקופ דיסק מסתובב להפחית את הרעילות וההסתברות של חפצים המושרה באור. הדבר מאפשר הדמיה של מספר גדול יותר של תאים בהכנה זהה תוך שמירה על התאים במדיום גדילה תחת תנאי תרבות סטנדרטיים. מכיוון שהניתוח מבוצע באופן אוטומטי מפוקח, התוצאות הן עמידות סטטיסטית ומפוקחת.

מבוא

Microtubules (MTs) הם מבנים דינמיים מאוד למצוא כמעט כל התאים איקריוטית ובכמה חיידקים1. . הם מפסל את שלדהציטו2,3 תא החטיבה4, מולקולה הובלה5, מכות הדגל6, התחושה של הסביבה המקיפה דרך הסייום7, שמיעה (kinocilium)8,9, embryogenesis10,11,12, פלישה גרורות13,14, ואפילו היווצרות זיכרון15,16,17,18, ותהליכים רבים אחרים מסתמכים בעיקר על MTs. השתתפות MTs בכל האירועים הללו יהיה בלתי אפשרי ללא היכולת המדהימה שלהם לעבור במהירות בין הצמיחה (פלמור) והצטמקות (דפלוניזציה). מאפיין זה מתואר כאי-יציבות דינאמית19. הר הדינמיות משתנה בתנאים פתולוגיים רבים20,21,22. לפיכך, קביעת אופי הנכס יכול לעזור להבין את מנגנוני המחלות ולאחר מכן את הטיפול שלהם.

רשימה ארוכה של שיטות פותחו עבור ניתוח MT דינמיקה, שרובם מבוססים על טכניקות דימות23. בתחילה, מיקרוסקופים אור שדה רחב שימשו להתבוננות היווצרות פולימרים טובולין בתוך מבחנה24. הגילוי של מחייב הקצה (EB)-חלבונים שאוספים ב-MT פלוס-מסתיים ופיתוח של שיטות כדי לתייג חלבונים באנרגיה fluorescently אופן מאפשר לבחון את התנהגותו של MTs ישירות בתאים חיים עם שדה רחב ו-מיקרוסקופ מיקרוסקופים פלואורסצנטית25,26,27. EB-פרוטאין אחד הוא חלבון מחייב הקצה 3 (EB3)28; על ידי הבעת יתר ומעקב EB3 התמזגו חלבון פלורסנט, MT פלוס-end תעריפי ההרכבה ניתן לקבוע29,30.

לייזר confocal וקד סריקת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (CLSM) משמש לעתים קרובות כדי לעקוב MT הדינמיקה. עם זאת, טכניקת הדמיה זו מהווה סיכון גבוה לפוטורעילות ופוטוהלבנה, שני תהליכים לא רצויים עבור תא חי והדמיה לדוגמה עמומה31. כדי לקבל יחס טוב יותר של אות לרעש, את כוח הלייזר ואת משך החשיפה צריך להיות גבוה מספיק בעוד לא לפגוע בדגימות, וזה דורש הקרבת החלטה בתמורה למהירות. חלופה מתאימה ל-CLSM היא ספינינג32מיקרוסקופ דיסק. מודאליות זו מבוססת על השימוש של דיסק Nipkow33, אשר מורכב דיסק נע הנושאת מערך של חורים, ועובד אופן מיקרוסקופים CLS רבים הדמיה זהה בו34. לכן, האור מהלייזר יאיר מספר אזורים במדגם בו זמנית, אך ישמור על הטבע הטוב. הדיסק Nipkow, לכן, מאפשר קבלת תמונות דומות CLSM אבל מהיר יותר באמצעות כוח לייזר פחות. The Nipkow הדיסק היה שיפור נוסף על ידי Yokogawa אלקטריק, אשר הציג דיסק שני עם מערך של microlenses על זה כי בנפרד אור ישיר לתוך pinhole בהתאמה, הפחתת הרעילות הרבה יותר phototoxicity לבנת35. כך, מסתובב מיקרוסקופית דיסק סריקה לייזר הפכה לשיטה של בחירה עבור הדמיה תא חי, וזה מאפשר להשיג תמונות עם יחס אות לרעש גבוה במהירות גבוהה31,36, אשר חיוני לפתרון אותות כגון אלה מתוך הצמיחה המהירה MT.

הדינמיקה של MT שונה באופן זמני. לדוגמה, mitotic MTs הם דינמיים יותר מאשר האינטרפאזה37,38. באופן דומה, הבדלים בקצב הצמיחה הצטמקות נצפו גם בתוך שלב אותו מחזור התא, כגון מיטוזה39,40. לכן, כדי להימנע מאיסוף נתונים שווא, יש להגביל את המדידה של הדינמיקה של MT לחלון זמן צר במהלך מחזור התא. לדוגמה, מדידה של MT דינמיקה ב prometaphase ניתן להשיג על ידי טיפול בתאים עם dimethylenאסטרה (dme), אנלוגי monastrol המונע את המנוע קינזין Eg541 ומונע את היווצרות של הmitotic ציר דו-קוטבית42. עיכוב של תאים ב prometaphase עם Eg5 מעכבי dme ונגזרים monastrol אחרים לא משפיעים על MT דינמיקה43,44,45, מה שהופך dme כלי שימושי ללמוד mt דינמיקה הן בתאים קבועים וחיים44.

כאן אנו משלבים את השיטה של ניתוח הדינמיקה MT בתאים prometaphase שתוארו על ידי Ertych ואח '44 עם הדמיה דיסק מסתובב כפול. שיטה זו מאפשרת מדידה של הדינמיקה MT ב prometaphase תאים שנאספו ממישור מוקד אחד עם קצב הדמיה גבוה יותר, אך ללא הלבנת ומינימלית פוטורעילות. יתר על כן, כעיתונאי פלורסנט, אנו משתמשים בחלבון פלורסנט (tdTomato) הכולל בהירות ופוטויציבות לעומת חלבון פלורסנט ירוק (EGFP) והוא נרגש עם אור אנרגיה נמוכה46. לכן, tdTomato דורש פחות כוח לייזר עבור עירור והוא פחות פוטורעיל. בסך הכל, אנו משפרים עוד את השיטה על-ידי הפחתת הרעילות ושיפור הרזולוציה והטיפול בדואר הנדרש לניתוח הדינמיקה של MT. בנוסף, אנו יוצרים בסיס לשינויים עתידיים בשיטה על-ידי שילובם בשיטות סינכרון אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. זריעת תאי הלה

  1. להכין 2 מ ל של 5 μg/mL fibronectin פתרון ב פוספט באגירה מלוחים (PBS) ולהוסיף 450 μL של אותו לתוך כל טוב של 4 שמיכות היטב הצ (#1 .5). מודיית את השקופית עבור 15 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  2. לשטוף באופן אסינכרוני בתאי הלה גדל עם מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) ו דגירה עם טריפסין-EDTA (0.05%: 0.02%; w:v) עבור 5 דקות ב 37 ° c. להפסיק את התגובה אנזימטית על ידי תוספת של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני בתוספת 10% החום מופעל סרום עגל העוברי (FCS) ב 3:1 (v:v) יחס של טריפסין הוסיף-EDTA.
    הערה: תאי הלה שמרו ב RPMI 1640 בינוני בתוספת של 10% חום מופעל FCS ב 37 ° צ' ו 5% CO2 ו היו באופן שגרתי בעבר הגיעו 80-90% שליטה כמתואר לעיל.
  3. קבע את ריכוז התא. באמצעות תא נויבאואר מערבבים 50 μL ליטר של השעיית התא עם טריבן כחול ב 1:1 (v:v) יחס, השעיה מחדש, והעברה 10 μL של ההשעיה אל החדר. הרוזן רק את התאים הכחולים-שליליים בתוך ארבעת הריבועים הגדולים (לפרטים ראו פיילן47ואח '). גזור את ריכוז התא ממספר התא שנספר באמצעות הנוסחה הבאה:
    figure-protocol-1
  4. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 2 דקות. Resuspend שעיה עם חדש RPMI 1640 על מנת להשיג 1 x 106 תאים/mL.
  5. הסר את fibronectin מתוך שמיכות השינה, לשטוף את הבארות פעמיים עם DPBS, ואת הזרע 50,000 תאים לכל טוב.
  6. להחזיר את שמיכות השינה עם התאים לחממה ולגדול אותם 24 שעות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.

2. ביטוי של pEB3-tdTomato בתאי הלה

  1. . הכן שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ ל עבור כל צינור, לדלל 2 μg של pEB3-tdTomato48 עם מאגר החצייה (סינתטי מוצר בפתרון מימית) לנפח הסופי של 396 μl.
  2. הוסף 4 μL של מגיב (non-lipidic, המכיל פוליאתילן) לצינור הראשון, ומערבולת את התערובת מיד בדיוק 10 s.
  3. בקצרה לסובב את הצינור עם מיקרוצנטריפוגה ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות.
  4. הסירו את תאי הלה מהאינקובטור. Dropwise, להוסיף 100 μL של תערובת החצייה לכל הבאר של 4 שמיכות היטב, ולהחזיר את התאים לחממה.
  5. לאחר 4 h של דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2, מוסף את התאים עם בינוני גדילה טריים ו-דגירה לפחות 24 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    הערה: יש צורך למטב את תנאי ההעברה עבור כל סוג תא. רמות הביטוי צריכות להיות נמוכות מספיק כדי לאפשר זיהוי של קצוות MT אחד גדל. לחילופין, קו תא המבטא באופן בלתי נשכח EB3-tdTomato ניתן להשתמש בניסויים; זה יפחית את השונות ברמות הביטוי של EB3-tdTomato בין ההכנות ובין תאים מאותה הכנה49.

3. סנכרון ולייב תא הדמיה של pEB3-tdTomato – ביטוי בתאי הלה

  1. הכנת פתרון μM 2.5 של dimethylenאסטרה (DME) ב-פנול-אדום חינם מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DME) שיושלם עם 10% FCS ו 2 מ"מ L-גלוטמין או אספקת גלוטמין חלופית.
  2. החלף את מדיום הצמיחה ב coverslip שמיכות עם 500 μL של מדיום הצמיחה המכיל 2.5 μM DME ו-מארג התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  3. לאחר 3.5 h של דגירה עם DME, להעביר את התאים למיקרוסקופ, הר שמיכות לתוך חדר הסביבה עם פאנלים כהים עבור הדמיה ב 37 ° צ' ו 5% CO2, ו מודטה נוספת עד הזמן הדגירה הכולל הוא 4 h.
    הערה: תחזוקת הטמפרטורה ב-37 ° צ' ללא תנודות היא חיונית לניסוי.
  4. לבצע את ההדמיה הזמן הדמיה על מיקרוסקופ הפוך מצויד 100x 1.49 N.A. שמן טבילה המטרה, מערכת מסתובב כפול הדיסק קונפוקלית, ואת מערכת האוטומטי אמין עבור תחזוקה רציפה של מטוס מוקד. הגדר את פרמטרי ההדמיה כדלקמן.
    הערה: אנו משתמשים מכשיר אלקטרוני הכפלת חיוב בשילוב מצלמה (EM-CCD).
    1. לעירור EB3-tdTomato, השתמש בקו לייזר של 561 ננומטר עם 200 ms זמן חשיפה. לאסוף את האור הנפלט באמצעות bandpass מרובעת (405, 488, 561, 640 nm) דיקרואיק מראה ומסנן פליטת nm 600/52.
      הערה: ניתן לכוונן את כוח הלייזר עבור כל תא הניתן לדימות כדי למנוע רוויית תמונה. בכל הזמנים הסרטים שניתנו כאן הכוח לייזר הוגדר 5.3 mW.
    2. למצוא תא ב prophase ולהתמקד Z-מישור המתאים למרכז של ציר הmitotic מונוסולאר. לרכוש תמונות כל 0.5 s על סך של 1 דקות ללא ביננינג ולא תאורה בין החשיפות.

4. ניתוח הדינמיקה של MT באמצעות U-Track v 2.2.0

  1. כדי לנתח את הדינמיקה MT נדרשת תוכנת סביבת מיחשוב נומרית (לדוגמה, MATLAB).
    הערה: הבנה בסיסית של התוכנה מספיקה לניתוח. חומר עזרה מקיף וערכות לימוד זמינים באתר האינטרנט של המפתחים (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
  2. הורד (https://github.com/DanuserLab/u-track) והתקן את תוכנת הקוד הפתוח u-track v 2.2.0 בעקבות ההוראות המפורטות שניתנו בקובץ "Readme_u-track. pdf"50,51,52.
  3. הפעל את תוכנת ניתוח המספריים והוסף את תיקיית ה-U-Track v 2.2.0 עם תיקיות ממשנה לנתיב החיפוש של התוכנה.
  4. מתוך חלון הפקודה קוראים. " הדבר פותח חלון דיאלוג שממנו ניתן לייבא את הקבצים הגולמיים שהופקו על-ידי תוכנת רכישת התמונות במיקרוסקופ (איור משלים 1, איור 2, איור 3, איור 4).
    הערה: תוכנת ה-U-Track תואמת לתבניות אחרות של נתוני תמונה. היא משתמשת ביו-פורמטים, אשר מזהה חיים שונים מדעי הנתונים תבניות53.
  5. הגודל של כל תמונה נקרא מתוך המטא-נתונים באופן אוטומטי. הזן באופן ידני את הצמצם המספרי של המטרה (במקרה זה 1.49) ואת מרווח הזמן (0.5 s) המשמש לדימות (איור משלים 1B). בנוסף, מידע על אורך הגל, fluorophore ואת זמן החשיפה ניתן גם לספק, אבל הם לא קריטיים לניתוח נוסף.
  6. לאחר טעינת כל התמונות, שמור את סידרת הזמן שהוזנה כרשימת סרטים על-ידי בחירתרשימת הסרטים "שמור כסרט". בצד הימני של חלון הדיאלוג בחר באפשרות "U-Track" ולחץ על "המשך" (איור משלים 1c).
    הערה: הערכים ממוטבים לתאי הלה. אם מעבר לקו טלפון אחר, יש להגדיר שוב את הערכים. לחלופין, השתמש בהגדרות המומלצות על-ידי מפתחי התוכנה. ההסבר המפורט של כל אחד מהפרמטרים וכיצד יש להגדירה ניתן למצוא בדו ח הטכני המסופק עם הגירסה הקודמת של התוכנה, באמצעות מכשיר המעקב50.
  7. מהחלון המוקפץ, בחרבאפשרות"מסוף מיקרוטוכדורית" ולחץ על "אישור" (איור משלים 1c). חלון הדיאלוג החדש מאפשר לקבוע את הפרמטרים לשלושת השלבים של הניתוח (איור משלים 1D), שבהם מדובר בזיהוי, מעקב וניתוח מעקב.
  8. בשלב 1 בחר באפשרות "הגדרות" ומהתפריט הנפתח בחר "זיהוי שביט" כשיטת זיהוי (איור משלים 2 ב).
    1. מתוך חלון הדיאלוג החדש להגדיר את הפרמטרים עבור ההפרש של מסנן גאוסים ומפלח פרשת הזמן כדלקמן (איור משלים 2 ג): תהליך מסכה לשמש עבור הזיהוי = ללא; סטיית תקן של גאוסיאנית בעלת המעבר הנמוך = פיקסל אחד; סטיית תקן של גאוס-מעבר גבוהה = 3 פיקסלים; סף מינימלי = 3 סטיות סטנדרטיות; גודל השלב של הסף = 0.25 סטיות סטנדרטיות. בחר "החל הגדרות על כל הסרטים" ו "החל".
  9. בשלב 2, הפרמטרים לקישור, סגירת מרווח, מיזוג ופיצול, ופונקציות מסנן קלמן מוגדרות בשלושה שלבים המסומנים בצבע ורוד, ירוק וכחול, בהתאם (איור משלים 3 ב). עבור שלבים אלה, בחר באפשרות "דינמיקה מיקרוכדורית פלוס" ומהאפשרות "הגדרה", הגדר את הערכים כפי שמצוין באיור 3C – E, בהתאמה.
    1. לבעיות עם מנות מימדית, בחרו ' 2 ' מהתפריט הנפתח. השתמש במרווח מירבי כדי לסגור = 5 מסגרות; אורך מינימלי של מקטעי מסלול משלב ראשון = 3 מסגרות. כמו קודם, לבחור "להחיל הגדרות על כל הסרטים" ולחץ על "להחיל".
  10. בשלב 3 של הניתוח, התגלו שירים MT מסווגים (איור משלים 4). כשיטה לניתוח מעקב, בחרו באפשרות 'סיווג מיקרוטורודינמיקה' והגדירו את הפרמטרים באמצעות הלחצן 'הגדרה' כפי שמצוין באיור 4 ב, ג. לאחר מכן, בחר את התיבה "החל הגדרות על כל הסרטים" ולחץ על "החל".
  11. לאחר כל הפרמטרים מוגדרים, מתוך "לוח הבקרה-U-Track" חלון (איור משלים 1d) בחר את "החלת בדוק/בטל את כל הסרטים" ו "הפעל את כל הסרטים" ולחץ "לרוץ". פעולה זו תיזום את הניתוח MT של סדרת הקפיצה בזמן.
  12. לאחר השלמת עיבוד הסרט, מוצגת הודעה "הסרטים שלך עובדו בהצלחה". לחץ על "אישור", ואז "שמור".
  13. עכשיו בטוח לפרוש מתוכנת. הניתוח המספרי התוצאות מעיבוד הסרט מאוחסנות במבני תיקיות מסגרות כקבצי m בתיקייה שבה מאוחסנות הקבצים הגולמיים.

5. אנליזה סטטיסטית של MT דינמיקה

  1. יבא את קובצי ה-m לתוכנית של ניתוח סטטיסטי מועדף.
    הערה: במקרה שלנו, אנו מייבאים תחילה את הקבצים בגיליון אלקטרוני רגיל כדי להפוך אותם לקריאים. קובצי m מכילים מידע סטטיסטי (חציון, ממוצע וסטיית תקן) בפרמטרים שונים (לדוגמה, מהירות צמיחה, מאיץ הדינמיות של MT). הרשימה המפורטת של הפרמטרים מוענק בדו ח הטכני המסופק עם הגירסה הקודמת של התוכנה,ב50,52. קבצי m שנוצר יכול גם להיות מיובאים לתוך תוכנות עיבוד נתונים אחרים.
  2. בחר את "מהירות צמיחה ממוצע" הפרמטר ולייבא אותו לתוך שולחן לסטטיסטיקה ולהציג. הזן את המידע על פרמטרים אחרים, (לדוגמה, "דינמיות") בטבלה חדשה או בעמודה חדשה של אותה טבלה ומזימה מקובצת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול הנתון המתואר באיור 1A, ה-PEB3-tdTomato באופן מידי התבטא באופן מבוקר בתאי חלה הגדלים באופן אסינכרוני. התאים סונכרנו 48 h לאחר הprometaphase באמצעות טיפול DME (איור 1B). שלב זה הבטיח כי המדידה של MT דינמיקה נעשתה תמיד באותו שלב של מחזור התא. הסרטים בזמן הקפיצה היו מעובדים ונותחו באמצעות U-Track v 2.2.0 כפי שמתואר בתיעוד המשלים שלה50,51,52. למרות שהפרוטאינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים שינוי של שיטה שהוקמה לראשונה על ידי ארפטיכון ואח '.44. יחד עם מספר שינויים אחרים, אנו משלבים את הטכניקה הזו של הניתוח MT דינמיקה עם הדמיה כפולה מסתובב הדיסק. השימוש בדיסק מסתובב כפול משפר את הרזולוציה של הגוברת MTs תוך הפחתת רעילות התמונה36. אנחנו עוד להקטין את התמונה הלבנה ונזק לייזר המושרה של התאים על ידי מעבר לכתב פלורסנט אורך גל ארוך יותר. חלבון פלורסנט tdTomato יש מקדם גבוה יותר של פוטויציבות ובהירות בהשוואה ל-EGFP46. לבסוף, מידת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים לחברי מתקן המיקרוסקופיה, מכון מקס פלנק לרפואה ניסויית, לייעוץ ולתמיכה המומחים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DimethylenastronMerck324622
DMEM עם פנול אדוםGibco31053-28
DPBSGibco14190-094
סרום בקר עובריBiochromS0415
פיברונקטין פלזמה בקרMerckF4759אבקה סטרילית
GlutaMAXGibco35050-038תחליף גלוטמין יציב
jetPRIMEPolyplus114-15
EB3-TdTomatoAddgeneפלסמיד #50708
RPMI 1640Gibco61870-010
Trypan BlueMerckT8154-20ML
תמיסת טריפסין/EDTABiochromL21430.05%/0.02% w/o סידן ומגנזיום
ומיקרו;- שקופיתIbidi80426שקופית 4 בארות עם #1.5 כיסוי
Eclipse Ti מיקרוסקופ הפוךNikonNA
ObjectiveNikonMRD01991CFI Apo TIRF 100xC שמן
ACAL לייזר Excahngerניקון. 405, 458, 488, 514, 561 ו 647 ננומטר
מודול דיסק מסתובבAndorCSU-W
מצלמהאנדורiXon Ultra 888
כההOkolabמצויד באספקת CO2, בקרת טמפרטורה ומכשיר אדים
HeLa CellsDSMZACC-57
NIS Elements v4NikonSpinning דיסק מיקרוסקופ. תוכנת רכישה
MATLABMathworksסביבת מחשוב
פריזמה 8GraphPadתוכנת ניתוח ותצוגה סטטיסטית
תיבת לייזר תא סביבתי תא

מקורות

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8(2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4(2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343(2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153(2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39(2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. , EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3(1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138(2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EB3 tdTomatoU TrackTime Lapse

מאמרים קשורים