אנו מציגים חזקה, להעברה וניבוי מערכת חשיפה מחוץ למערכת להקרנה וניטור של חלקיקים מוטס בנוגע לרעילות חריפה של הריאות שלהם על ידי חשיפת מעובד בתאי הריאה האנושיים בממשק האוויר-נוזלי (ALI).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת הרעלת שאיפת חריפה של חלקיקי מוטס על ידי חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק האוויר-נוזלי
במאמר זה
סיכום
תקציר
כאן, אנו מציגים מודולרי מעוצב במיוחד במערכת חשיפה מחוץ לגוף המאפשרת חשיפה הומוגנית של תאי הריאה האנושיים מעובדים על ALI לגזים, חלקיקים או אטמוספרות מורכבות (למשל, עשן סיגריות), ובכך לספק פיסיולוגיים מציאותיים חשיפת המשטח האפיפיורי של האזור האנושי הכתשיים לאוויר. בניגוד מודלים חשיפה רציפים עם הדרכה תרסיס ליניארי, העיצוב המודולרי של מערכת הזרימה הרדיאלי עונה על כל הדרישות של הדור המתמשך והובלה של אווירת הבדיקה לתאים, התפלגות הומוגנית והפקדת את החלקיקים ואת ההסרה הרציפה של האטמוספירה. שיטת חשיפה זו מיועדת בעיקר לחשיפת תאים לחלקיקים מוטס, אך ניתן להתאים לחשיפה של אירוסולים נוזליים וגזים רעילים ואגרסיביים מאוד בהתאם לשיטת הדור התרסיס ולחומר של מודולי החשיפה .
במסגרת מחקר אימות שהושלם לאחרונה, מערכת חשיפה זו הוכחה כשיטת הקרנה להעברה, מוכחות וחזוי להערכת האיכות של רעילות הריאות חריפה של חלקיקים מוטס, ובכך שעלולים להפחית או להחליף ניסויים בבעלי חיים שבדרך כלל יספקו את ההערכה הטוקסיולוגית הזאת.
מבוא
האינהלציה של חלקיקים רעילים מוטס היא דאגה לבריאות הציבור, המובילה להמון סיכונים בריאותיים ברחבי העולם ומיליוני מקרי מוות מדי שנה1,2. שינוי האקלים, הפיתוח התעשייתי המתמשך והביקוש העולה לאנרגיה, מוצרי חקלאות וצרכן תרמו לגידול מחלות הריאות בשנים האחרונות3,4,5,6. ידע והערכה של חומרים הניתנים לאינהלציה בנוגע לרעילות האינהלציה החריפה שלהם, מספקים את הבסיס להערכת סיכונים ולניהול סיכוני, אך מידע זה עדיין חסר במגוון רחב של חומרים אלה7,8
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול של ניסוי חשיפה אחד מכסה תקופה של שלושה ימים.
היום הראשון
1. ההכנות הכלליות וטיפוח התאים
הערה: הריאה האנושית אדנוקרצינומה קו אפיתל התאים A549 שימש לניסויים חשיפה. יש לטפל בתאים תחת תנאים סטריליים. ניתן להשתמש בקווי תאים אחרים המתאימים לטיפוח-תרגול ב-ALI.
- להכין את הצמיחה בינונית (בינונית מינימלית של מינימום של החברה (DMEM), שיושלם עם 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו 5 μg/mL בינוני) ואת בינונית חשיפה (DMEM בתוספת עם 5 μg/mL הריכוז הסופי של HEPES 100 mM).
- התרבות A549 תאים בינונית צמיחה ב 37 ° c באווירה מחולל לחות המכיל 5% CO2.
- לטפח תאים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
CULTEX RFS הוא מודולרי תוכנן במיוחד מערכת חשיפה מחוץ למערכת המאפשרת חשיפה ישירה והומוגנית של תאים ב-ALI. במסגרת מחקר טרום-אימות לשעבר, הישימות הכללית של מערכת החשיפה הזאת והיכולת שלה, היציבות והתוכסות הוכחו בהצלחה. בפרויקט מחקר שנערך לאחרונה במימון משרד החינוך והמחקר הגרמני, מערכת החשיפה אומתה בהצלחה והוקמה כמודל חיזוי (PM) עבור מפגעי אינהלציה חריפה של תרכובות נבדק. כאשר איכות השליטה באוויר הנקי התברר כפרמטר קריטי במהלך מחקר טרום-האימות, מספר מיטובי פרוטוקול ושיטות (למשל, שינוי של מוסיף ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודלים רבים של הרעלת שאיפת בעלי חיים לא פותחו בשנים האחרונות על מנת לקבל מידע על מפגעי האינהלציה החריפה של חלקיקי שאיפה ולהפחית ולהחליף ניסויים בבעלי חיים על פי עיקרון ה-3R25.
במונחים של מודלים של תרבות התא, חשיפה של תאים ניתן לבצע בתנאים מתחת לאור או ב-ALI. חשיפת התאים בתנאים שמתחת לתחתית עלולה להשפיע על התכונות הפיזיקאלית-כימיות ולכן התכונות הרעילות של חומר מבחן12. לעומת זאת, במודלים של עלי שאיפת מבחנה, מחקים את מצב החשיפה האנושית עם דמיון ביול.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים AT, ק ג, AB, SH, HM, TG, HT ו-DS אין מה לחשוף. החברה Cultex טכנולוגיה GmbH (לשעבר מעבדות Cultex GmbH) מייצרת מכשירים (g., CULTEX RFS, CULTEX DG) בשימוש במאמר זה. NM הייתה עובדת של GmbH מעבדות Cultex במהלך המחקר הזה. בסדר הוא עובד של Cultex הטכנולוגיה GmbH (לשעבר מעבדות Cultex GmbH). PCT פטנט/EP2009/007054 עבור המכשיר הוא להחזיק על ידי מייסד הטכנולוגיה Cultex GmbH פרופ ' ד ר אולריך Mohr (לשעבר מעבדות Cultex GmbH).
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי משרד החינוך והמחקר הגרמני (Bundesministerium ger בילדונג ו Forschung, BMBF, גרמניה (גרנט 031A581, תת-פרוייקט A-D)) ועל ידי הקרן המחקר הגרמני (דויטשה פורשונגסגסםהסלבירכתיים, DFG, מחקר קבוצת הדרכה GRK 2338).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>תאים | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| <חזק>מדיום תרבית תאים ואספקה | |||
| DMEM | ביוכרום, ברלין, גרמניה | FG 0415 | משמש כמדיום גידול |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, דרמשטדט, גרמניה | 22320 | משמש כמדיום חשיפה |
| FBS superior | Biochrom, ברלין, גרמניה | S 0615 | |
| Gentamycin (10 מ"ג/מ"ל) | Biochrom, ברלין, גרמניה | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, גרמניה | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, ברלין, גרמניה | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, ברלין, גרמניה | L 2143 | |
| <חזק>חומר תרבית תאים | |||
| CASY כוסות | Roche Diagnostic GmbH, מנהיים, גרמניה | REF 05651794 | |
| צלחות תרבית תאים | קורנינג, ויסבאדן, גרמניה | 3516 | צלחות 6 & ביישנות; |
| צלחות באר; 0.4 ומיקרו; m | |||
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, מנהיים, גרמניה | REF 05651808001 | |
| אוויר דחוס (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleiß heim, גרמניה | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, קיימברידג', בריטניה | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schä rfe System GmbH, רויטלינגן, גרמניה | ||
| תרמוסטט זרימה | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, גרמניה | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - מכבש הידראולי | Cultex® Technology GmbH, הנובר, Gemany | ||
| CULTEX להכניס שרוול | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - מערכת זרימה רדיאלית סוג 2 (מודול לחשיפת חלקיקים) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - מערכת זרימה רדיאלית סוג 2 (מודול לחשיפה לאוויר נקי) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX אספקת | |||
| בקר זרימה 0-30 מ"ל/דקה (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| 0-1,5 ליטר/דקה (EL-Flow) | מסנני Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| (גדולים) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, גרמניה | LP-050 | Munktell מסנן סטרילי; יעילות שימור חלקיקים > 99,999% |
| מסננים (קטנים) | Parker Hannifin Corporation, מיינץ, גרמניה | 9933-05-DQ | מסנן חד פעמי Balston |
| משאבה בינונית | Cole-Parmer GmbH, ורטהיים, גרמניה | Ismatec IPC מתקן רב ערוצי דיוק גבוה | משאבה פריסטלטית דיגיטלית |
| קורא Microplate Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, גרמניה | ||
| משאבת Vakuum | KNF, פרייבורג, גרמניה | N86 KT.18 | |
| Vö בקר זרימת מסה gtlin 0,2-10 ליטר לדקה | TrigasFI GmbH | Vö ווסת קומפקטי gtlin אדום-y, מס' טיפוסי: GCR-C3SA-BA20 | |
| אמבט מים | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, גרמניה | Ecoline Staredition RE 104 |
מקורות
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
