שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

סיכום

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

תקציר

בשנים האחרונות הפכו כיום למרכז מחקר נרחב בביולוגיה ובפתולוגיה של כלי הדם. החשיבות של קרום הלב במבנה מחסום הדם והפיזיולוגיה מומחש כעת, אך הבסיס המולקולרי שלו נותר ברובו לא ידוע. כתפקיד הפתופסולוגי של קרום הלב המוחית בהפרעות נוירולוגיות מרתקת ובעלת חשיבות רבה, מודלים בלתי מתורבת לא רק מתאים מספיק אלא גם מסוגל לשלב טכניקות שונות למחקרים אלה. מספר שיטות הוצעו כמודלים של מבחנה להפקת קרום הלב, למרות שפרוטוקול ללא אנטיביוטיקה עם תפוקה גבוהה רצוי. החשוב ביותר, שיטה כי יש מוגברת תפוקה לכל החילוץ מפחית את השימוש של בעלי חיים נוספים.

כאן, אנו מציעים שיטה פשוטה ויעילה להפקת קרום הלב מוחין עם תפוקה גבוהה מספיק. רקמת המוח העכבר המגון מעורבב עם פתרון BSA-dextran להפרדה של פסולת רקמות וכלה מיקרונימי. אנו מציעים הפרדה של שלושה צעדים ולאחר מכן סינון כדי להשיג filtrate עשיר מיקרוכלי. עם שיטה זו, את כמות שברי מיקרוכלי דם שהתקבלו מ 10 עכברים מספיק זרעים 9 בארות (9.6 ס מ² כל אחד) של צלחת 6-היטב. מעניין ביותר עם פרוטוקול זה, המשתמש יכול להשיג 27 בארות עשיר כלציט (9.6 ס מ² כל אחד) במעבר 2. הטוהר של התרבויות לקרום הלב מאושרות עם ביטוי של סמנים לקרום הלב הקלאסי: NG2, PDGFR-β ו CD146. שיטה זו ממחישה את הכלי היעיל והריאלי לחקר החוץ של המחקרים הפיזיולוגיים והפתופיזילוגיים על כקרום הלב.

מבוא

קרום הלב הם מרכיב חיוני של היחידה נוירונימי (NVU), אשר כוללת יחידה תפקודית עם תאי המוח מוחין של מכשול המוח בדם (BBB), תאי גליה, מטריקס מטריתאי ונוירונים. כולציטים הם חלק חיוני בתפקוד מוסדר של מערכת העצבים המרכזית (CN) כפי שהם משמשים כאחד הממשקים עבור חילופי מידע מולקולרי ותאי.

קרום המוח מוטבע בצד האבלומיאלי של כלי המיקרו-כלים, והם חיוניים להקמת¹ ולשמירה על² הפיזיולוגיה של bbb. מספר יצירות האחרונות הדגישו גם את תפקידה של קרום הלב המוח באנגיוגנזה³ והתבגרות הספינה⁴, אנדותל מורבגנזה⁵ והישרדות⁶, ובשליטה על מטבוליזם המוח כולסטרול⁷. וחשוב מכך, הדיסרגולציה בכל אחד מהתהליכים הללו מהווה הסימנים ההיכר של מחלות ניווניות.

אכן, קרום הלב הם הכרח פונקציונלי לתפקוד BBB נורמלי והגנה שלה מפני ההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מספר. הפיזיולוגיה וההפסד של קרום המוח הם המכנה המשותף של מחלת האלצהיימר⁸, אובדן עצבי במהלך בתפקוד החומר הלבן⁹, טרשת נפוצה¹⁰, ספיגה אנצפלופתיה¹¹, בשלב אקוטי שבץ מוחי¹² ובהפרעות נוירולוגיות אחרות. קרום הלב הם גם אינסטרומנטלי הגידול גרורות¹³. מעניין, קרום הלב הוכחו גם להפגין תפקיד החילוץ לאחר טראומה והפרעות נוירולוגיות: ב reמיאלונציה במוח¹, משיחת איסכמי, פגיעה בחוט השדרה¹⁴ וקידום אנגיוגנזה¹⁵. הרגישות של קרום הלב כדי לחזק את הביטוי הפתופסולוגי של טראומה נוירולוגית והפרעות הופך אותם מטרה טיפולית פוטנציאלית¹⁶.

במודלים של מחקר בתחום הפריולוציטים בבית BBB הם כלים חשובים לניהול מחקרים נרחבים. מודלים אלה מספקים פלטפורמה למחקרים משוכללים יותר על ידי ייצוג דגמי העבודה של BBB ועוד. לדוגמה, ניתן להשתמש במודלים אלה כדי להבין את הפיזיולוגיה התאית בתוך קרום הלב ובין סוגי תאים אחרים של NVU. כמו כן, במודלים של חוץ גופית הם כלי חקירה ממקור ראשון לבדיקת ההשפעה הפרמקולוגית של תרופות חדשות ומולקולות על כלציטים. מודלים אלה יכולים לשמש גם כדי להבין את התפקיד הפתופסולוגי של קרום הלב ביחס להפרעות נוירולוגיות. למרות זאת, התפתחות במודלים של מבחנה דורשת תפוקה מוגברת כדי לאפשר חופש ניסיוני. מודלים אלה אמורים להיות קלים ומהירים, ולהקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות. בנוסף, היכולת לפתח מודלים כאלה לתוך מודלים של תרבות תא כפול ומשולש רצוי.

קיימים פרוטוקולים רבים שפותחו. הפרוטוקולים המוצעים על ידי תיגבור ואח '¹⁷, חן ואח '¹⁸, תומסן ואח '¹⁹, יאצאקי ואח '²⁰, ו קראוץ ' ו doetsch²¹ הם גישות ראוי לספק את רוב הצרכים. כל השיטות הללו מפיקות תוצאות אפקטיביות, אך התלות במספר רב של בעלי חיים ניסיוניים נותרה מכנה משותף לפרוטוקולים אלה. לכן, זה הופך להיות הכרחי כדי לפתח שיטת פלט גבוהה שיכולה לבודד ולטהר את קרום הלב עם היעילות המירבית האפשרית. בפרוטוקול זה, טוהר התאים שהתקבלו לאחר מעבר שני מאומת עם מספר סמנים לקרום הלב. בדקנו עבור טסיות נגזר מקדם הצמיחה קולטן-β (PDGFR-β), אשר משמש כסמן קלאסי של קרום הלב¹⁷, ועבור NG2 (תא העצב-glial אנטיגן 2), שהוא סמן של כריתת קרום המוח בתיווך מורפולגנזה²² ו vascularization²³. בדקנו גם עבור אשכול של בידול 146 (CD 146), אשר דווחה כאחת המולקולות מבוטא בקרום הלב^17,18.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת קרום הלב העיקרי מעכברים (סוג פראי או transgenics) כי יספק את כל הדרישות הנ ל עם תפוקה גבוהה. אנו מעסיקים אנטיביוטיקה וimmunopanning שיטה מבוססת בחירה חינם של התפשטות עבור קרום הלב הראשי המוח, אשר יוכיח את עצמו מודל יעיל לניהול לימודי מבחנה.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בעקבות הנחיות המכון לשימוש וטיפול בבעלי חיים. בהתאם לחקיקה הצרפתית, אושרה מתקן בעלי החיים באוניברסיטת Artois על ידי הרשויות המקומיות (התייחסות: B62-498-5). בהתאם לחקיקה של האיחוד האירופי (הוראה 2010/63/האיחוד האירופי), כל ההליכים אושרו על-ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים והשימוש (קומיא ד'אתאן, הכוונה: C2EA 75) ומשרד המחקר הצרפתי (התייחסות: 2015090115412152).

1. הכנת פתרונות

1. להכין 500 mL של מאגר כביסה A (WBA): 10 מ"מ פתרון HEPES בתמיסה מלח מאוזן של האנק (HBSS). חנות ב -4 ° c.
2. הכינו 500 מ ל של מאגר כביסה B (WBB): 0.1% בסרום שיבמין (BSA) עם פתרון של 10 מ"מ HEPES ב HBSS. חנות ב -4 ° c.
3. הכינו 300 mL של 30% הפתרון תוספי ב wba על ידי ערבוב את הפתרון לילה בטמפרטורת החדר. אוטוקלב את הפתרון ב 110 ° c עבור 30 דקות לפני השימוש. לאחר אוטוקלינג, תן את הפתרון לנוח בטמפרטורת החדר עבור 2-3 h. אחסן את הפתרון ב-4 ° c.
4. הכינו 100 mL של 0.1% bsa פתרון בפתרון תוספי קר. טלטל במרץ עבור 3-4 דקות ולאחסן ב -4 ° c.
5. הכינו מדיה מלאה של הנשר השונה ביותר של Dulbecco (DMEM) על ידי המסת 20% סרום עגל, 2 מ"מ גלוטמין, 50 μg/mL בג, 1% ויטמינים, 2% חומצות אמינו בסיס הנשר הבזאלי (BME) במדיה DMEM בסיס וחנות ב 4 ° c. להוסיף 1 ng/mL בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ גורם (bFGF) לפני השימוש.
6. הכנת מדיית כלציט מלאה על-ידי הוספת תוספי גדילה (בתנאי מדיה לכליים) ו -20% סרום לעגל עוברי (FCS) בתוך התקשורת הבזכית והחנות ב -4 ° c.

2. התאוששות מרקמת המוח והסרת מניגס

1. לעקביות, להשתמש בעכברים של גיל דומה ומגדר זהה בכל קבוצה של חילוץ. השתמש במקלט לבעלי חיים נטול הפתוגן ומספק גישה למים מבית מודעות. כדי להבטיח יעילות ושימוש מינימלי של בעלי חיים, להימנע מאובדן של חומר רקמה.
2. המתת חסד C57BL/6J, בת 4-6 שבועות, עכברים זכרים (מעבדות יאנייה, לה ג'נסט-סאינט-האי, צרפת).
3. הבלו במהירות את רקמת המוח בתנאים סטריליים, למנוע כל נזק לרקמות. בזהירות מניחים את הרקמה ב 40 mL של תמיסת מלח קר פוספט מאגור (PBS).
4. העבר את רקמת המוח ב-PBS הקרה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ).
5. מניחים את רקמת המוח על מנגב סטרילי נטול-סיבים יבשים עם מלקחיים תשר מעוקל, להסיר את המוח החצי, הסטריאטום ואת העצבים העורף.
   1. להסיר את כל משחת הקרום הגלויים עם מספוגית כותנה. מניחים את רקמת המוח הפוך ולפתוח את האונות עם ספוגית כותנה באמצעות משיכות אור כלפי חוץ. להסיר את כל כלי הדם הגלויים.
   2. מניחים את רקמת המוח חינם בצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) עם 15 מ ל של WBB קר.

3. הומוגון

1. העבר את הרקמה לצינור מרגמה מטחנת רקמות Dounce ולהוסיף 3-4 mL של WBB עם מלקחיים.
2. החמול את הרקמה עם ' משוחרר ' כתש 55 פעמים. שטפו את הפסל הרופף באמצעות WBB. עכשיו, הגבר את הבשלה. "
3. לחלק את התערובת באופן שווה לתוך 2 50 מ"ל צינורות ולהוסיף 1.5 x נפח של קר 30% BSA-dextran, במרץ לטלטל את צינורות לערבב את השקר.

4. בידוד של שבר כלי הדם

1. לאחר לטלטל במרץ את הצינורות, צנטריפוגה את הצינורות עבור 25 דקות ב 3,000 x g ו 4 ° c.
2. להעביר את supernatant (יחד עם שכבת המיאלין העליון) כדי 2 צינורות חדשים, ו צנטריפוגה את הצינורות עבור 25 דקות ב 3,000 x g ו 4 ° c. לשמר את כדורי מצנטריפוגה הראשון על ידי הוספת 3 מ ל של WBB קר (לשמור את הגלולה ב 4 ° c).
3. חזור על שלב 4.2 ושמור בזהירות את כדורי מ 2^nd צנטריפוגה.
4. להיפטר תוספי ואת המיאלין עם פסולת רקמות מן הצינורות משלב 4.3. שמור על כדורי ב-WBB קר.
5. הבריכה את התוכן של צינור 1 ו-tube 2 משלב 4.1 ולפצות על הנפח הסופי של 10 mL עם קר WBB.
6. חזור על שלב זה עבור צינורות משלב 4.2 וצעד 4.3.
   הערה: לבסוף, יש 3 צינורות מ 3 centrifugations.
7. הנתק את הגלולה עם 6 למעלה ולמטה משיכות באמצעות הצינורות 10 מ"ל, עד לא הגושים הגלויים של כדורי נותרים.
8. בעזרת מסנן ואקום מסנן רשת שינוי ניילון, לסנן את השעיות התא של כל צינור.
   הערה: שלב סינון זה חשוב כדי להסיר כלי זמן ארוכים יותר/גדולים יותר דרך מסנן רשת השינוי.
9. לשחזר ולהשעות מחדש את נימי ידי גירוד המסנן בעזרת מלקחיים עצה שטוחה או מגרד ב WBB בטמפרטורת החדר. לסנן את ההשעיה עם מסנן טרי כדי לשחזר נימים יותר
10. לחלק את פילטרט באופן שווה לשתי שפופרות ו צנטריפוגה עבור 7 דקות ב 1,000 x g ו RT.
    הערה: במהלך צעד צנטריפוגה זה, הכן את הפתרון האנזימטי. קבע את עוצמת ה-WBB הדרושה בהתאם למספר בעלי החיים בהם נעשה שימוש (ראה טבלת חומרים). להוסיף 1x של DNase 1 ו-1x של טוסיל-L-לייסיל-כלורמתאן הידרוכלוריד (TLCK) (ראה טבלת חומרים) ב wbb ו-לחמם מראש עד 37 ° c.
11. לאסוף את כדורי משלב 4.10 בצינור אחד עם WBB מראש מחומם עם אנזימים. הוסף/י/י/י/י מחמם מחומם מראש. מניחים את הצינור באמבט מים שולחן לרעוד ב 37 ° c עבור בדיוק 33 דקות.
12. הפסיקו את תגובת האנזים על ידי הוספת 30 מ ל של WBB קר. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 7 דקות ב 1,000 x ו RT.
13. להיפטר supernatant בזהירות לנתק את הגלולה ב-WBB עם 6 למעלה ולמטה משיכות באמצעות צינורות 10 מ"ל. שלב זה צריך להיות קפדני פחות יחסית מהר יותר.
14. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 7 דקות ב 1,000 x ו RT.
    הערה: במהלך שלב זה, להשליך את הציפוי מתוך מנות התרבות ולשטוף אותם פעם אחת עם DMEM בטמפרטורת החדר. מנות תרבות תא המעיל עבור לפחות 1 h ב RT.
15. להיפטר supernatant מן הצינור שהושג בשלב 4.14, ו הנתק את הגלולה במדיה חדשה DMEM הצלחת התאים (יום 0, P0) ב 9 בארות של 6-היטב צלחות (1 גם של 9.6 ס"מ² כל).

5. התפשטות קרום הלב המוחית

1. שמרו על תרביות תאים ב-37 ° c ו -5% CO₂ באינקובטור סטרילי. החלף את מדיית התרבות לאחר 24 שעות (יום 1) של ציפוי התאים על ידי הסרת הפסולת בזהירות. לאחר יום 1, לשנות את מדיית התרבות בכל 48 h.
2. צפו בתרבית התאים לפחות 7-8 ימים. בשלב זה, גידולים סלולריים על החלק העליון של unilayer אנדותל צריך להיות נצפה.
3. העבר את התאים ביום 8-10 (בהתאם לשטף) בתווך תרבות קרום המוח למעבר 1 (P1) על לוחות תרבות מצופים ג'לטין. . לשנות את מדיית התרבות בכל יומיים שימו לב לתאים במשך 6-7 ימים. תאים מפוצלים ברציפות שוב למעבר 2 (P2) ביום 17 [ומעבר 3 (P3) ביום 24 רק אם נדרש], גדל במדיום כלציט בצלחות מצופה ג'לטין.
   הערה: התאים יהיו מוכנים לניסויים/התבוננות בכמעט 80-90% שליטה.

תוצאות

פרוטוקול זה (איור 1) מניב ביעילות 9 בארות (מתוך 6 צלחות) בזמן זריעה ב-P0 (איור 2א (P0: יום 1)).

מ P0 כדי P2, יש מאפיינים מורפולוגיים ספציפיים שבהם תאי האנדותל (מסומנים על ידי חיצים לבנים) ו-s עלייה הדרגתית בקרום הלב (מצוין על ידי חיצים שחורים) ניתן לצפות. ב P0, התאים האנדותל מוארך המתפתחים ממיקרוכלים הם בשפע (איור 2A, P0: יום 3), בעוד שפע של תאים מאורכים כאלה מופחת ב P1 ונעדר ב P2. להיפך, קרום הלב מופיעים כתאים מרובע אשר שופע P2 (איור 2A, P2: יום 18).

כדי לאשר את טוהר תרבות קרום הלב ב P2, בדקנו את הביטוי של NG2, CD146 ו pdgfr-beta כמו סמנים לקרום הלב באמצעות ה-PCR כמותי (איור 2B), אימונוציטוטוכימיה (איור 2ג), ואת הכתם המערבי (איור 3). קרום הלב ב P2 לבטא רמות גבוהות יותר של CD146, NG2 ו PDGFR-β בהשוואה לביטוי במוח העכבר הכולל (Ms Br) תמצית. כפקד, ביטוי של סמנים אנדותל הסגר CD31, האסטרוציטים לסמן glial fibrillary חלבון חומצי (gfap) ו מיקרוגלייה סמן CD11b נצפו גם נעדרים ב P2.

איור 1: סיכום הפרוטוקול. חלוקה לרמות זו מייצגת צעדים קריטיים להפקת כלציט, המתחיל בהתפוררות רקמות עם מטחנת זכוכית ולאחריה הפרדה של 3 צעדים ב דקטרן וסינון. פרוטוקול זה מעסיק את שלב העיכול של 33 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מורפולוגיה תאים וביטוי סמנים. (א) הניגודיות הפאזה תמונות של קרום הלב ב P0, P1 ו P2 בשלבים של התפשטות. תאים שופע אנדותל ב P0 מצוינים על ידי חיצים לבנים. המספר שלהם ירד ב P1 והם נעלמו ב P2. החיצים השחורים מציינים את קרום הלב. (ב) אנליזה של CD146, NG2 ו-PDGFR-β ביטוי על ידי PCR בקרום המוח ב P2 עם קרום הלב בתוך P1 ומוח העכבר (Ms Br) דגימות. (ג) דמויות מייצגות של קרום הלב ב P2 מציג חיסוני חיובי של CD146, PDGFR-β ו, NG2. סרגל קנה מידה: 50 יקרומטר (הגדלה 20x) ו-20 יקרומטר (הגדלה 40x). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: טוהר הנציגים של תרביות התא. ניתוח של CD146, PDGFR-β, NG2, סגר, GFAP, CD31, CD11b וביטוי טובולין על ידי בלוק המערבי בקרום הלב P2 והמוח העכבר (Ms Br) דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השוואה מייצגת של שיטות שונות של התפוררות רקמות, טיהור, העשרה ועיכול אנזימטי. כל פרוטוקול שפורסם מסוכם באמצעות אינדיקציות על מספר בעלי החיים המשמשים עבור כל פרוטוקול. התפוקות מצוינות גם ביחס למספר הבארות שהתקבלו בעת זריעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

קרום הלב מוחין הוא חלק אינטגרלי של NVU ולשחק תפקיד פעיל אינדוקציה ותחזוקה של BBB²⁴. באופן דומה, התפקיד של תאים אלה בהפרעות ניווניות שונים הפתווגיות כלי דם הוא מסקרן. מכאן, מודל תא מרכזי להפקת פלט יעיל יספק פלטפורמה יעילה למחקרים בעלי מבחנה.

ישנם פרוטוקולים שונים שהוצעו לבידוד של קרום הלב העיקרי (איור 4). טיגס ואח '¹⁷ הציע שיטה כולל רקמה קורטיקלית עם מניגס. גישה זו היא הטפיקציה של רקמות מ 6 עכברים (37 ° c, 70 דקות העיכול עם אנזימים papain/DNase) ואחריו צעד התפוררות באמצעות 21 G ו 18 G מחטים. פרוטוקול זה מציע הפרדה של צעד אחד (צנטריפוגה בתוך 22% BSA/ערוץ PBS) התשואות לפחות 2 קולגן אני מצופה בארות של צלחת 6-היטב. התאים מתוחזקים במדיום צמיחת התאים האנדותל (ECGM) עד מעבר 3 ומאוחר יותר באמצעי גדילה (PGM) עבור תאי המעבר כדי לקדם התפשטות כריתת קרום המוח. בגישה דומה אחרת, צ'ן ואח '¹⁸ הדיסוציאציה של רקמת העור על ידי קוצצת את הרקמה עם להב תער מעוקר ואת העיכול רקמות עם קולגן וכלי/dnase עבור 90 דקות ב 37 ° c. בעקבות הפרדה של צעד אחד (צנטריפוגה ב -22% BSA) של התאים, שכבת המיאלין מוסרת והגלולה נשטפה פעמיים ב-ECGM. כלי המיקרו מצופים ב -3 בארות של קולגן שאני מכוסה בצלחות בנות 6. לאחר שהגיעו למפגש, התאים מגיעים פעמיים ומאוחר יותר מתוחזקים PGM. בסופו של דבר, אם התאים מועברים ביחס של 3, אנחנו יכולים להשיג 27 וולס של לוחיות 6-טוב רק בשימוש של 10 עכברים בתחילת הפרוטוקול.

בתומסן ואח ', המחברים ממליצים על בידוד קרום הלב של המוח באמצעות העיכול האנזים בעל שני השלבים¹⁹. . ודגימות מוח נחתכו לחתיכות קטנות החלקים רקמה לעבור את תגובת האנזים הראשון ב-כלקולאז/DNase I עבור 75 דקות ב 37 ° c, בעקבות צעד אחד של הפרדה 20% BSA. הגלולה נאסף ועוד מתעכל ב-קולגן/dispase/DNase I עבור 50 דקות ב 37 ° c. שלב זה מלווה בהפרדה של 33% חלחול ושטף עוד פעם אחת. כלי המיקרו מצופים במנות מצופות 35 מ"מ בקולגן הרביעי/fibronectin. התפשטות קרום הלב היא המועדף על 10% FCS ו gentamicin סולפט ב DMEM עבור 10 ימים. בגישה נוספת לעיכול של שני צעדים, יאמאצאקי ואח '. מראים מחדש את הרקמה^{המחפירה}ב-dmem הקרה. בתגובת האנזים הראשון, הדגימות מטופלות עם הקולאז/DNase I עבור 75 דקות ב 37 ° c. בעקבות צעד אחד צנטריפוגה, את הגלולה הוא שטף שוב פעם אחת תגובת האנזים השני הוא יזם בשנת הקולגן/dispase עבור 60 דקות ב 37 ° c. בעקבות הפרדה של צעד אחד, הגלולה הוא מושעה מחדש ו centrifuged בפתרון BSA 22%. לבסוף, הגלולה מיקרוכלי דם מושהה. ומצופה בצלחת של 6 מטרים עבור 5 מוחות העכבר, 1 טוב של צלחת 6-באר יכול להיות מצופה. כדי להשיג את קרום הלב, תרבויות אנדותל הם החוצה שלוש פעמים בזמן שנשמר במוח העכבר תא אנדותל (mBEC) בינונית II. קראוץ ' ו Doetsch²⁰ מציעים שיטת טיהור כלציט על ידי facs. דגימות רקמה מקליפת המוח-אזור תת-חדרית של מוחי העכבר הם מיקרו-גזור ובטחון ביסודיות עם אזמל. לאחר הקולגן/הדגירה האנזים במשך 30 דקות ב 37 ° c, הרקמה מתעכל מופרד מאלין ופסולת centrifuged ב 22% v/v הפתרון חלחול. השעיית התא הוא לאחר מכן מודענב נוגדנים מצובזות בשנת פלואורוסקופים ניתוח ומיון של FACS. התאים ממוינים מצופה קולגן מצופה בארות של 24 צלחת הבאר. הוא הציע כי קליפת אחד מניב מספיק תאים עבור ציפוי אחד ב 1 היטב של צלחת 24.

גם אם פרודוקטיבי, שיטות אלה מגיעות עם מספר מגבלות, מן השימוש של מספר רב של בעלי חיים עבור בידוד אצווה אחת כמות מוגבלת מאוד של פלט.

במהלך הפיתוח של הפרוטוקול המוצע, הצלחנו להשיג תפוקה גבוהה: 9 בארות של צלחת 6-היטב מתוך מעטים כמו 10 עכברים. למטרה זו, הסרת הקרום מבטיח את ההסרה צעד אחד של כלי גדול מן הרקמה. מטחנת הרקמה של הדיאונקיה מתאימה יותר לרקמות רכות כגון המוח. הוא גם מבטיח הפחתת דגימה עם הפילינג הרופף, הומוגון עם הפסל הצמוד, ומונע נזקים סלולאריים מיותרים. אחת המטרות העיקריות בפרוטוקולי תרבות התא הראשוני היא בזבוז מינימלי של רקמות ושליפה מורחבת של ואצלב המוח. בפרוטוקול המוצג, זה מושגת על ידי צנטריפוגה חוזרים של dextran-BSA רקמה המרקמת העור אכל. גישה שלושה שלבים צנטריפוגה מסייעת לשחזר כמויות גדולות של ואצלב מן רקמת המגון ate. זה מספק 3x התאוששות משופרת של כלי מיקרו. בעקבות הפרדה, סינון הוא הצעד החיוני הבא, אשר מעדיף את החרגה של תא שריר חלק הקשורים כלי גדול. כפי שהוזכר לפני שילוב של אנזימים שונים הוצע לעיכול אנזימטי. בעוד DNase ו הקולגן/dispase משמשים כדי להפחית את הגושים של תאים ולבודד תאים יחיד בהתאמה, חשוב מאוד למנוע מוות של תאים בסביבה פולשנית כגון זה מונע על ידי TLCK, אשר ובכך מגביר את התשואה הסופית. בתחילה, המעבר הראשון מותר לגדל מונאולייר אנדותל, שמאוחר יותר תומך בצמיחת קרום הלב הצמוד בunilayer. כיוון שהישרדותה של תאי האנדותל הראשוניים מופחתת על-ידי הפסחתה, היא מגבירה את ההסתברות לאיחזור כדוריות דם. כמו-כן, פרוטוקול זה מעסיק מעבר נוסף המבטיח הימנעות מזיהום תאי האנדותל. יש לציין כי עם מספר גבוה יותר של תאים מ P2, את התלות בהמשך ההתיישנות של התאים מופחת. בנוסף, הוא מפחית את האפשרות של צמיחה קרום המוח שהוא השיג בתאי שריר חלקה, אשר מתרבים בקצב גבוה בהרבה.

על מנת להשיג תפוקה גבוהה יותר, ישנם מספר שלבים קריטיים ויש לבצע אותם באופן מדויק ביחס לטמפרטורה וזמן. ערבוב של רקמת הומוזה לתוך BSA-dextran צריך להיות מהיר. הדיסוציאציה גלולה לאחר השלבים צנטריפוגה צריך להיות מהיר כדי למנוע מוות תאים. יתר על כן, 33 מינימום של עיכול אנזימטי צריך להיעשות בדיוק ובטיפול. אחת המגבלות עבור פרוטוקול זה היא המשך היום 7-8 שunilayer אנדותל מותר לצמוח ולהקל עוד יותר את התפתחותם של קרום המוח. ככל הנראה, הבידוד של כלי הדם הוא btter, הצמיחה של unilayer הוא מהיר יותר, ולכן יש מספר מוגבר של קרום הלב. מומלץ לא להשתמש פחות מ 10 עכברים בכל חילוץ כדי להבטיח מספר הולם של שברים microvascular כדי לתמוך בצמיחה קרום הלב עוד. אם הנקודות הנ ל מעקב בזהירות, צפיפות התא הרצויה עבור תרבות קרום המוח ניתן להשיג בקלות.

במודלים של חוץ גופית מספקים פלטפורמה אפשרית לפיתוח מודלים נגזרים לקבלת מידע נוסף על הרלוונטיות הפתופסולוגית ותקשורת בין התאים האחרים של NVU במהלך הפרעות נוירולוגיות. ניתן לשלב בין כדוריות הקרום הבודדות בתרבות דו-תאית (עם תאי אנתל או גליאל) ובתרבות תלת-תאית (תאי האנדותל וגליאל). התפתחות מודלים אלה לא נדונה כאן. לסיכום, פרוטוקול זה מספק גישה אחת לבידוד של תאים ראשוניים עם תפוקה גבוהה יותר ופלטפורמה טובה יותר למחקר מתורבת הקשור לביולוגיה מוחית קרום הלב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצות אמינו BME	Sigma	B-6766	יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
Basal DMEM media	Invitrogen	316000083	Store ב-4 מעלות צלזיוס.
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי	Sigma	F-0291	חנות ב-20 מעלות צלזיוס.
חנות BSA	Sigma	A-8412	ב-4 מעלות צלזיוס.
קולגנאז dispase	Sigma	10269638001	הכן תמיסת מלאי פי 10 ב-PBS-CMF סטרילי. סנן את התמיסה עם 0.22 μ מסנן מזרק m ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הערה: לשלב עיכול האנזים של הפרוטוקול, עבור כל סט של 10 עכברים למיצוי, 300 ומיקרו; נדרש L של 10x קולגנאז דיספאז.
Dextran	Sigma	31398
DNase I	Sigma	11284932001	הכינו תמיסת מלאי 1000X על ידי המסת 100 מ"ג ב-10 מ"ל מים סטריליים ואחסנו בטמפרטורה של -20&0 מעלות צלזיוס.
ג'לטין	סיגמא	G-2500	הכן את ציפוי העבודה על ידי הכנת תמיסת ג'לטין 0.2% ב-PBS-CMF סטרילי (8 גרם/ליטר NaCl, 0.2 גרם/ליטר KCl, 0.2 גרם/ליטר KH2PO4, 2.86 גרם/ליטר NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). חיטוי התמיסה למשך 20 דקות לפחות ב-120 מעלות; C ושומרים בטמפרטורת החדר. כלי תרבות לציפוי לפחות 4 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
חנות Gentamycin	Biochrom AG	A-2712	ב-4 מעלות צלזיוס.
חנות גלוטמין	Merck	I.00289	ב-20 מעלות צלזיוס.
חנות HBSS	Sigma	H-8264	ב-4 מעלות צלזיוס.
חנות HEPES	Sigma	H-0887	בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
Matrigel	BD Biocoat	354230	הכן תמיסת ציפוי עובדת של Matrigel על ידי דילול מלאי ב-DMEM קר ביחס של 1:48 כאשר הריכוז הסופי שלו יהיה 85 ומיקרו; גרם/סמ"ר. יש לצפות כלי תרבית תאים לפחות למשך שעה בטמפרטורת החדר.
מעבדות המחקר	Pericyte Medium-mouse	1231	חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone	Sigma	T-7254	הכן תמיסת מלאי 1000X ב-WBA על ידי המסה של 16 מ"ג ב-10.88 מ"ל של WBA ליצירת תמיסה של 4 מ"מ ואחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
ויטמינים	סיגמא	B-6891	חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
<דרישות ציוד >חזקות
כלי סינון	ספר, רשת ניילון, נקבוביות
ציוד מעבדה	צנטריפוגת
אמבט מים עם תסיסה
קולט אדים למינרי: BSL2
כלי זכוכית (כל הרכיבים יהיו חום מעוקר)	מטחנת רקמות Dounce עם עלי זכוכית
עלי I: 0.0035 - 0.0065 אינץ'
עלי II: 0.0010 - 0.0030 אינץ'
מכלול מסנן ואקום עם בסיס
כלי חיתוך כירורגיים (כל הרכיבים לעיקור בחום)	מלקחיים, מספריים, מבער בונסן כותנה ספוגיות, מד