מאמר שיטה

שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן

DOI:

10.3791/60651

⸱

28 בינואר 2020

 ,  ,  ,  , 
1Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים את המודל ממברנה העוף כוראואליאלי כחלופה, השתלה שולחן, במודל vivo עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית תאים לסרטן וגידולים הנגזר החולה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים עכבר הם בדיקות בחינת ביצועים עבור בלימודי סרטן vivo. עם זאת, עלות, זמן, שיקולים אתית הובילו שיחות חלופיות לvivo מודלים סרטניים. הקרום כוראלאלי ממברנה (CAM) המודל מספק חלופה זולה, מהירה המאפשרת ויזואליזציה ישירה של פיתוח הגידול מתאים הדמיה vivo. ככזה, ביקשו לפתח פרוטוקול מיטבי לחרט גינקולוגית ולהפוך גידולים אורולוגיים למודל זה, אשר אנו מציגים כאן. כ 7 ימים הפריה, תא האוויר מועבר לצד הvascularized של הביצה, שם נוצר פתח במעטפת. גידולים ממורין וקווי התאים האנושיים רקמות ראשיות ניתן לאחר מכן מצטלבים. אלה הם בדרך כלל שנזרע תערובת של מטריקס ובינוניות ובינוניים כדי למנוע פיזור הסלולר ולספק תמיכה מזינים עד התאים לגייס אספקת כלי דם. גידולים עשויים לצמוח לאחר מכן עד 14 ימים נוספים לפני בקיעה ביצה. על ידי שתילת תאים באופן בלתי נשכח עם גחלילית לוציפראז, הדמיה ביולומינסנציה יכול לשמש לאיתור רגיש של גידול בקרום והסרטן להתפשט לאורך העובר. מודל זה יכול לשמש לחקר הטווריגניות, פלישה, גרורות, ויעילות טיפולית. מודל מצלמת עוף דורש פחות זמן ומשאבים פיננסיים בהשוואה למודלים murine מסורתיים. מכיוון שהביצים הן בעיות חיסוני ועמידות חיסונית, רקמות מכל אורגניזם יכול להיות מושתל ללא בעלי חיים הטרנסגניים יקרים (למשל, עכברים) נדרש עבור השרשה של רקמות האדם. עם זאת, רבים מהיתרונות של מודל זה יכול להיות גם מגבלות, כולל את זמן הגידול הקצר הדור החיסוני/החיסונית המצב העמידות. בנוסף, למרות כל סוגי הגידולים המוצגים כאן בתוך מודל הקרום כוראלאלי העוף ממברנה, הם עושים זאת עם דרגות שונות של צמיחת הגידול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים שימשו כאורגניזם מודל קלאסי לחקר מחלות אנוש, כולל ממאירות. כיונקים, הם חולקים. דמיון רב לבני אדם רמה גבוהה שלהם של דמיון גנטי אפשרה מניפולציה הטרנסגניים של הגנום העכבר כדי לספק תובנה עצומה לתוך השליטה הגנטית של מחלות האדם1. ניסיון רב בטיפול של וניסויים עם עכברים הביא להיות מודל הבחירה למחקר ביו רפואי. עם זאת, בנוסף חששות מוסרית ומדעית לגבי דגמי murine, הם יכולים גם להיות יקרים למדי זמן רב2,3. התפתחות של גידולים יכול לקחת שבועות או אפילו חודשים. הדיור במוסד אופייני בלבד יכול לרוץ במאות עד אלפי דולרים בעוד גידולים מתפתחים. סרטן השחלות הוא דוגמה של חיסרון זה משום הצמיחה שלה במודלים murine יכול בקלות לקחת חודשים. עיכובים התקדמות מחקר פוטנציאלי להשפיע על סרטן השחלות חולים ' בהתמדה נמוכה הישרדות שיעור 5 שנים של רק 47% (כלומר, עלייה בהישרדות של רק 10% מעל 30 שנים)4. באופן דומה, סרטן אורולוגי (כליות, ערמונית, וסרטן שלפוחית השתן) מהווים 19% של כל המקרים הסרטניים בארצות הברית ו -11% של מקרי מוות הקשורים לסרטן4. כך, רומן בגישה vivo ללמוד סרטן גינקולוגית ואורולוגיים יכול להציל מעבדה משמעותית זמן, עבודה, וכסף, גם אם מודל זה מיושם רק ניסויים הראשונית ההקרנה. בנוסף, ההאצה המתקבלת של ממצאי מחקר יכול להשפיע באופן משמעותי על 177,000 אנשים שאובחנו עם סרטן אלה מדי שנה.

מודל CAM עוף מציע יתרונות רבים הנוגעים בסוגיות הנ ל. מודל פופולרי כדי ללמוד אנגיוגנזה5,6, הפלישה תא הגידול7,8, גרורות7,9, מודל העובר אפרוח מצלמת כבר שימש ללמוד צורות רבות של סרטן, כולל glioma10,11,12, הראש והצוואר קרצינומה של תאים13,14, לוקמיה15,16, סרטן הלבלב17, ו סרטן המעי הגס18. בנוסף, מודלים קאם נוצרו עבור נוירובלסטומה19, לימפומה בורקיט20, מלנומה21, וחתולים פיברוסרקומה22. מחקרים קודמים הציגו גם חרט סרטן שלפוחית השתן23 ו סרטן הערמונית קווי התאים24, אבל עם פרטי פרוטוקול מוגבל. לא רק שהביצים זולות בהרבה מעכברים, אבל הן גם מפיקות תוצאות מאוד מובנות25,26. הם מראים פיתוח מהיר של ואסילטורה, והתפתחות הגידול יכולה להתרחש מהר ככל כמה ימים ולהיות דמיינו longitudinally דרך החלון הפתוח. עם מסגרת הזמן 21 יום בין הפריה ביצה הבקיעה, ניסויים ניתן להשלים בתוך כמה שבועות. יתרה מזאת, העלות הנמוכה, צורכי הדיור המוגבלים, וגודל קטן מאפשרים בקלות ניסויים בקנה מידה גדול שיהיה מיועד ללימודי העכבר.

לכן, ביקשו למטב את מודל CAM עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית סרטן. בשל המצב החיסוני של העובר הקודם עוף27, שני העכבר ואת התאים האנושיים יכול להיות מושתל בקלות. ככזה, יש לנו בהצלחה לחרט מנופה השחלות, כליות, ערמונית, וסרטן שלפוחית השתן. עבור כל אחד מסוגי הגידולים האלה, מצלמת בקלות מקבל הוקמה murine ו/או האדם תאים הגידול קווי. חשוב מכך, שנקטפו טרי רקמות הגידול האנושי העיקרי יכול גם לעבור מתוך תאים מתעכל או פיסות של רקמה מוצקה עם שיעור גבוה של הצלחה. כל אחד מסוגי הסרטן האלה ומקורות התא דורש אופטימיזציה, אשר אנו חולקים כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים שהוצגו בזאת נבדקו ואושרו על ידי הוועדות האתיות המתאימות באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA). השימוש deidentified, גידולים אנושיים העיקרי אושרה על ידי הלוח המוסדי באוניברסיטת UCLA (מספרי פרוטוקול 17-000037, 17-001169, ו 11-001363). ב UCLA, מחקר בעלי חיים סקירה ועדת אינו נדרש לניסויים באמצעות עוברי עוף; אישור פרוטוקול נדרש רק כאשר הביצים יוקעו. עם זאת, שיטות העבודה הטובות ביותר, כגון הנחיות AVMA עבור המתת-החסד של בעלי החיים, שימשו לטיפול בעוברי עוף מבחינה אתית וכדי להימנע מכאבים ככל האפשר. חוקרים מעודדים לאמת את דרישות הפיקוח במוסד שלהם לפני הייזום לימודים באמצעות מודלים CAM.

1. הכנת הביצים

  1. לפני קבלת הביצים, להרכיב ולספק את אינקובטור ביצה 37.8 ° צ' (100 ° פ') עם 60-70% לחות לאחר הוראות היצרן.
    הערה: כדי למזער את סיכוני הזיהום, ניתן להשתמש במים אוטומטיים כדי לשלוט בלחות.
  2. עם קבלת המופרית, רוד איילנד ביצי עוף אדום מספק ביצה מוסמך ברמה מעבדה, יבש לנגב את פני השטח של הפגזים עם נייר מגבות. ניתן להשתמש במגבת מנייר לחה בקלות כדי להסיר חומר מדבק. . תייבש מיד
    הערה: הרטבת מעטפת עם נוזל מתחת 43.3 ° c יכול להחדיר חיידקים לתוך הביצה. אם מישהו בוחר לשטוף או לחטא את הביצים, הטמפרטורה של הנוזל חייבת להיות בין 43.3-48.9 ° c. טמפרטורות גבוהות יותר. יכולות להרתיח את הביצים הבחירה של חיטוי צריך להיות מבוסס על המיקרואורגניזמים גרימת דאגה.
  3. השתמש בעיפרון או בסמן כדי לתייג את התאריך על הביצה. זה נחשב יום פיתוח 0.
  4. מניחים את הביצים לתוך החממה ביצה הדגירה לפחות 7 ימים עם סיבוב כדי לאפשר פיתוח מצלמת. מסובבי אוטומטי ניתן להשתמש, או הביצים ניתן לסובב 180 ° 2-3x ליום.

2. פתיחת הביצים

הערה: הפתיחה של הביצים יש לעשות כאשר CAM פיתחה במלואו. הדבר מתבצע בדרך כלל ביום הפיתוח 7 או 8.

  1. לחטא ארונית ביו-בטיחות. עם 70% אתנול באופן דומה לחיטוי ומקום לתוך הקבינט אבטחה טיחות מתלה ביצים, ביצה כרודלר, סמן, הכלי רוטרי אלחוטי עם סיליקון קרביד שחיקה אבן וגלגל חיתוך עגול, 18 המחט G, בבקר pipet עם שפופרות ואקום רבע אינץ ', אריזת קלטת, משרד מספריים, מספריים מעוקלים, סמקן (או דומה) מלקחיים, כדורי כותנה, ו 6 x 7 ס מ שקוף ההלבשה הסרט. כל אימת שניתן, השתמשו בכלים סטריליים, חד פעמיים או אוטומטיים.
  2. . כבה את מסובב הביצים מניחים כ-1-3 ביצים בארון הביוטיחות על מתלה הביצים. בזמן החשיכה, הניחו את הביצה כנגד קליפת הביצים כדי לזהות את תא האוויר. . סמן את המיקום של תא האוויר
    הערה: עוצמת התאורה מתוך ביצת הביצה היא חיונית להמחיש את הפנים של הביצה. אם תא האוויר או היום קשה באופן עקבי לראות, נסה להחליף את סוללות הביצית.
  3. להעביר את הביצית ביצה על המעטפת כדי למצוא רשת כלי דם גדול. לסובב את הביצה במידת הצורך. במרכז הביצה יהיה מסעף ואצלב אידיאלי. השתמש בסמן כדי לצייר מעל היום כדי לשמש להשתלה.
  4. . תדליק את האור במכסה המנוע באמצעות כלי רוטרי אלחוטי מצויד סיליקון קרביד האבן, לקדוח חור קטן במעטפת ישירות מעל המרכז של תא האוויר. תרגיל עד שרוב המעטפת הוסר, אך הקרום הפנימי הלבן אינו שלם.
    הערה: קידוח על פני תא האוויר לפני המיקוד היתרי ובנייה לקבוע את העובי של קליפת ביצה זו מעל תא האוויר ולא מעל מצלמת ה-CAM ו-vascuלטורה. אם המצלמה או הרשת מופרת, אזי הביצית אינה מסוגלת לשרשה.
  5. לקדוח ולפתוח עוד חור קטן שבו החלון כלי הדם ייפתח כפי שנעשה עבור תא האוויר (שלב 2.4).
  6. שימוש במחט של 18 גרם, לחדור בעדינות דרך הקרום הלבן, הפנימי מעל תא האוויר והסקובלטורה. אם לא יכול לחדור את המעטפת, אז לקדוח בזהירות קצת יותר. ודא כי הקרום הלבן, הפנימי (אך לא ה-CAM) משתבש לאורך כל האזור הקדח. אין צורך להסיר את פיסת הממברנה.
    הערה: אם המצלמה מופרת במהלך שלב זה, מחק את הביצה. נזק ניכר אם יש דם או אלבומין דולף מחור מקדח.
  7. . כבה את האור במכסה המנוע באמצעות בדיקת הביצה, ודא כי תא האוויר הועבר מקצה הביצה לאזור שמעל ואצלב. במקרה הצורך, מניחים את הצינורות ואקום מוכנס לתוך בקר pipet סביב החור מעל תא האוויר המקורי בעדינות להחיל יניקה צרורות קצרים כדי להזיז את התא אוויר.
  8. השתמש בסמן כדי לתאר את המיקום החדש של תא האוויר כ 0.5 ס מ בתוך גבול מצלמת האוויר. לצרף פיסת נייר אריזה. מעבר לתא האוויר החדש במקרה הצורך, השתמשו במספריים משרדיים סטנדרטיים כדי לחתוך את הקלטת בגודל המתאים.
    הערה: הקלטת יכולה לשבש את זרימת האוויר דרך המעטפת, ולא להיות גדולה מהנדרש כדי לכסות את תא האוויר במלואו.
  9. החזר את הביצים לחממה להתחמם ללא סיבוב עם תא האוויר החדש הפונה כלפי מעלה. חזור על שלבים 2.2-2.9 כדי לפתוח את הביצים הנותרות.
    הערה: ייתכן שהפרוטוקול מושהה כאן. אם בטוח האיכות של פיתוח פקה, מספר קטן של ביצים צריך להמשיך דרך שלב 2.16 לפני פתיחת הביצים הנותרות.
  10. מניחים כ 1-3 ביצים עם תאים האוויר הועברו על מתלה הביצה בארון בטיחות.
    הערה: יש לנקוט בטיפול כדי למנוע את החדרת הזיהום לתוך הביצה הפתוחה. לכן, תמיד לפתוח ביצים בתוך הקבינט אבטחה טיחות, ולהשתמש בכלים וציוד סטרילי כל אימת שניתן.
  11. באמצעות כלי רוטרי אלחוטי מצויד גלגל חיתוך עגול, לחתוך קו קטן על גבול תא האוויר שצויר בשלב 2.8. ודא כי זה כ 0.5 ס מ בתוך הגבול מצלמת אוויר בפועל כדי למנוע משבש את מצלמת ה-CAM או vascuלטורה. חותכים לגמרי דרך המעטפת אבל להיזהר לא לחדור עמוק מספיק כדי לשבש את מצלמת CAM או ואסילטורה.
  12. באמצעות מספריים מעוקלים, לחתוך מסביב לתא האוויר הנותר כדי ליצור חלון במעטפת.
    הערה: אם דם או קרום נמצאים על המעטפת הוסרו, אז הביצה אינה מתאימה השרשה. אם חלק גבוה של הביצים לא נפתח באופן נקי, לשקול לחכות לפחות 1 יום נוסף כדי לפתוח את הביצים הנותרות כדי לאפשר היווצרות מצלמת טוב יותר. אם הקליפות של הביצים שנותרו לא פירסינג, הסיבוב של הביצים בתוך החממה צריך להיות מחודש.
  13. . אמת את הכדאיות של העובר עוברים קיימא יציג בולטורה נרחבת, אלבומין ברור, תנועת העובר, או פעימת לב גלויה.
  14. באמצעות מלקחיים של סמקן, משוך פיסות כותנה קטנות מכדור כותנה סטרילי. בעדינות למחוק את פני השטח CAM להסיר את אבק פגז ופסולת.
    הערה: יש לבצע את הסרת הפסולת באותו יום שבו נפתחים הביצים.
  15. לכסות את פתיחת פגז עם פיסת אחד רבע של 6 x 7 ס"מ הסרט שקוף להתלבש.
  16. . החזר את הביצים לחממה ודא שהביצה יושבת מאובטחת עם החלון הפתוח הפונה כלפי מעלה ומצלמת לא נוגעת ברוטב הסרט השקוף. השתמש פיסת מתלה ביצים, קצה של מסובבי הביצה, או עוד פריט מתאים לתמוך בביצים כי להמשיך להתגלגל.
  17. חזור על שלבים 2.10-2.16 כדי לפתוח את כל הביצים שנותרו.
    הערה: הפתיחה של הביצים לא צריך להסתיים באותו יום כמו השרשה. מחכה לפחות יום אחד יכול לעזור לחסל ביצים אשר הכדאיות שלה נפרץ על ידי פתיחת המעטפת.

3. הכנת ההשעיה תא סרטן עבור השתלת (אפשרות 1)

הערה: יש להשלים את זה רק לפני ההשתלה, מה שצריך להתרחש באופן אידיאלי בין ימים 7 ו -10. נא עיין בהערות בתחילת שלב 5 או 6 לקבלת מידע נוסף אודות תאריך ההשתלה. גישה זו שימש עבור כל קווי התאים והגידול התרבותי של סרטן הכליה מעכל.

  1. הפשרת פתרון מטריצה החילוץ על קרח.
  2. השימוש בעיכול מכני ו/או אנזימטי מקבל השעיית תא בודד באמצעות שיטה המתאימה לסוג התא המושתל.
  3. השהה מחדש את המספר הכולל של תאים שייושתל במדיום מתאים עבור השרשה. שתלים של 1-2 x 106 תאים לכל ביצה הם טיפוסיים.
    הערה: המדיום המשמש השרשה של קווי התאים הוא בדרך כלל המדיום השלם המשמש לשימוש בתאים, המכיל FBS או החלפת נסיוב. ההשתלה של הגידול מעכל בדרך כלל משתמש בינוני שלם המשמש לקווי תאים culturing של אותו סוג סרטן. עם זאת, התאמות לניסוח בינוני יכול להתבצע אם יש צורך בניסויים. ההשפעות על התפתחות הגידול והצמיחה צריך להיות החלטי מדעית.
  4. גלולה את התאים באמצעות מהירות צנטריפוגה ואת הזמן המתאים לתאים בשימוש. מהירויות טיפוסיות הן 250-300 x g, והשעות הן 5-10 דקות.
  5. הסר את הסופרנטנט מתאי הקירור באמצעות ליטוף. מכנית מחדש את התאים במדיום שיורית באמצעות מצליף או ליטוף. . הניחו על הקרח להתקרר למדוד את עוצמת הקול של תאים בינונית באמצעות pipet בגודל כראוי.
  6. לחשב אמצעי אחסון השרשה כגון 1-2 x 106 תאים מושתלים באמצעי אחסון של 20-100 μl לכל ביצה עם ריכוז מטריצה הסופי של 2.7-4 Mg/mL חלבון. הוסף בינוני, כל גורמי הצמיחה הרצוי או תוספים, פתרון מטריצה מושג בהתאם לחישוב זה. לשמור על הקרח עד מוכן השתל.
    הערה: לחישובים בשלבים 3.3 ו 3.6, כמות נוספת של שתל ביצה אחת לפחות יש לשלב כדי להבטיח נפח הולם עבור כל הביצים בקבוצה. עבור השרשה של שורות התאים של סרטן השחלות (כלומר, SKOV3 ו-ID8), 106 תאים לכל ביצה היו מושתלים. עבור השרשה של תא הכליה קרצינומה של קו התאים RENCA, תאים מתורבתים נגזר מתעכל העיקרי האנושי האדם קרצינומה של תאים, סרטן הערמונית קווי התאים (כלומר, CWR, C4-2, ו MyC-CaP), וסרטן שלפוחית השתן קווי תאים (כלומר, HT-1376 ו T24), 2 x 106 תאים

4. הכנת חתיכות הגידול עבור השרשה (אופציה 2)

הערה: יש להשלים את זה רק לפני השרשה, מה שאמור להתרחש באופן אידיאלי בין ימים 7 ל -10. נא עיין בהערות בתחילת שלב 5 או 6 לקבלת מידע נוסף אודות תאריך ההשתלה. השחלות הראשונית סרטן שלפוחית השתן הושתל כמו חתיכות הגידול.

  1. להפשיר פתרון מטריצה מטריתאי על קרח. דלל את ריכוז החלבון הסופי של 2.7-4 מ"ג/mL במדיום המתאים המכיל את כל גורמי הצמיחה הרצוי או תוספים. . המשיכו לאכול
    הערה: השרשה של חתיכות הגידול בדרך כלל משתמשת במדיום השלם המשמש שורות תא culturing של אותו סוג של סרטן. עם זאת, התאמות לניסוח בינוני יכול להיעשות אם יש צורך בניסויים. ההשפעות על התפתחות הגידול ואת הצמיחה צריך להיות מדעית נחוש.
  2. , בעזרת אזמל או מספריים. חתיכות בלו מהגידול הטרי המידות האידיאליות נעות מ-2-5 מ"מ בכל צד. לשמור על הרקמות שקוע במדיום עד מוכן השתל.

5. השרשה באמצעות טבעת ללא מקל (אפשרות 1)

הערה: ניתן להשתיל תאים החל מיום הפיתוח 7 אם מצלמת ה-CAM מפותחת במלואה. השרשה יכולה להתרחש בכל עת לפני הבקיעה המאפשרת זמן מספיק להתפתחות הגידול והניסוי הרצוי, אבל לשים לב כי התאים החיסוניים של העובר מתחילים להיות נוכחים בסביבות היום 10 הפריה פוסט27. שיעור גידול הגידול משתנה במידה ניכרת על ידי סוג התא והוא צריך להיות באופן אמפירי נחוש עבור סוג התא של עניין. סרטן השחלות ותאי סרטן הערמונית הושתל באמצעות שיטת הטבעת nonstick. שים לב שכאשר טבעת שאינה ממקל אינה זמינה, ניתן לגזור טיפ מלטף לגודל דומה ולהשתמש בו.

  1. השתמש 70% אתנול כדי לחטא את הקבינט אבטחה טיחות ואת כל הכלים הנדרשים: מתלה ביצים, מלקחיים קשתית מעוקל, טבעות nonstick (1/4 אינץ ' בקוטר הפנימי), מערבבים זכוכית מוט, מתאים מאוד pipets מספריים וטיפים, 6 x 7 ס מ שקוף רוטב הסרט, המספריים במשרד, ו סמן או כאשר הדבר אפשרי, יש להשתמש בכלים סטריליים, חד פעמיים או באוטוקליים.
  2. מניחים ביצים להיות מושתל על מתלה ביצה בארון בטיחות. לבחור מספר לניהול של ביצים. . עד שישה זה אופייני הימנע מאפשר הביצים להתקרר באופן ניכר בעת העבודה איתם.
  3. להסיר את התחבושת הסרט שקוף מתוך המעטפת על ידי גלגול הקצוות לעבר החלון הפתוח כדי למנוע משיכת חלקים של פגז. בדוק כי הביצים הן קיימא ובריא. ביצים אידיאליות יהיה כלי גדול במרכז האזור הפתוח עם ספינות קטנות הסתעפות ממנו.
  4. באמצעות מלקחיים קשתית מעוקל, מניחים טבעת סטרילית, לא מקל על מצלמת הכלי, באופן אידיאלי על פני נקודת הסתעפות. השתמש מהומה זכוכית סטרילית מוט כדי שבעדינות מצלמת CAM.
  5. Pipet ההשעיה התא משלב 3.6 לתוך המרכז של טבעת nonstick. לחילופין, השתמש מלקחיים למקום פיסת הגידול משלב 4.2 לתוך המרכז של הטבעת nonstick ולכסות עם 20-50 μL של פתרון מטריצה החילוץ שנוצר בשלב 4.1.
  6. לחתום את הפתיחה עם פיסת ברבעון אחד של 6 x 7 ס מ שקוף ההלבשה הסרט. לתייג את הביצים עם ייעוד השתל המתאים.
    הערה: מספור הביצים בתוך קבוצה מקלה על תצפיות האורך.
  7. . החזר את הביצה לחממה ודא שפתח המעטפת יושב זקוף ושהביצה מאובטחת.
    הערה: ניתן להחזיר ביצים לאינקובטור ביצה ללא סיבוב. לחילופין, הכדאיות הגבוהה של החברה ניתן להשיג באמצעות 37-38 באינקובטור תא מעלות צלזיוס עם שיתוף2 בוטלה ו דדי לפקח על הלחות, אשר צריך להיות 50%-80%.

6. השרשה ללא טבעת שאינה מסטיק (אפשרות 2)

הערה: ניתן להשתיל תאים החל מיום הפיתוח 7 אם מצלמת ה-CAM מפותחת במלואה. השרשה יכולה להתרחש בכל עת לפני הבקיעה המאפשרת זמן מספיק להתפתחות הגידול והניסוי הרצוי, אבל לשים לב כי התאים החיסוניים של העובר מתחילים להיות נוכחים בסביבות היום 10 הפריה פוסט27. שיטה זו שימש השתלת תאים קרצינומה של תאי הכליה ואת התאים הסרטניים בשלפוחית השתן.

  1. השתמש 70% אתנול כדי לחטא את הקבינט הביובטיחות ואת כל הכלים הנדרשים: המתאים ביותר לחיות מחמד וטיפים, מאכלים סטריליים 10-cm רקמות הרקמה, מתלה ביצים, 6 x 7 ס מ שקוף ההלבשה הסרט, מספריים במשרד, ו סמן.
  2. החלשת הנפח של השעיית התא שנוצר בשלב 3.6 לתוך טיפ בגודל מתאים pipet (200 μL אופייני). בעוד מחזיק את החלק העליון של הקצה, בזהירות להוציא את הקצה מלטף ומקום אופקית לתוך מאכל סטרילי, 10 ס מ רקמות רקמה.
  3. חזור על שלב 6.2 עבור כל הדגימות בתוך קבוצה עם מנה אחת לכל קבוצה.
  4. מקום טיפים לתוך החממה 37 ° c עבור 15-30 דקות כדי לאפשר את מטריצת החילוץ באופן חלקי פולימוניזציה.
  5. לאחר 15 דקות של דגירה, התחל לבדוק את הפילמור. כמות קטנה של נוזל בדרך כלל דולפת מתוך הטיפ כאשר מניחים על המנה. ניתן להשתמש בפלוניזציה של נוזל זה כדי לאמוד את מידת הפולימוניזציה של הנוזל שבתוך הקצה.
  6. מניחים את הביצים להיות מושתל על מתלה ביצה בארון בטיחות. לבחור מספר לניהול של ביצים. . עד שישה זה אופייני הימנע מאפשר הביצים להתקרר באופן ניכר בעת העבודה איתם.
  7. הסר את רוטב הסרט השקוף מהמעטפת על-ידי גלגול הקצוות לעבר החלון הפתוח. זה מונע משיכת חלקים של פגז.
  8. בדוק כי הביצים הן קיימא ובריא. ביצים אידיאליות יהיה כלי גדול במרכז האזור הפתוח עם ספינות קטנות הסתעפות ממנו.
  9. במקום אחד טיפ pipet על pipet בגודל כראוי. לדכא את הבוכנה כדי לאלץ את השעיית התא באופן חלקי הבולם על מצלמת מצלמה גדולה, מפותחת היטב, באופן אידיאלי על פני נקודת הסתעפות.
  10. לחתום את הפתיחה עם פיסת ברבעון אחד של 6 x 7 ס מ שקוף ההלבשה הסרט.
  11. התווית את הביצה עם ייעוד השתל המתאים.
    הערה: מספור הביצים בתוך קבוצה מקלה על תצפיות האורך.
  12. . החזר את הביצה לחממה ודא שפתח המעטפת יושב זקוף ושהביצה מאובטחת.
    הערה: ניתן להחזיר ביצים לאינקובטור ביצה ייעודי ללא סיבוב. לחילופין, הכדאיות הגבוהה של החברה ניתן להשיג באמצעות 37-38 באינקובטור תא מעלות צלזיוס עם שיתוף2 בוטלה ו דדי לפקח על הלחות, אשר צריך להיות 50%-80%.

7. הדמיה ביולומינסנציה של גחלילית לוציפראז מסומן גידולים

הערה: אם התאים המושתלת היו מובחנות באופן מאוד עם קידוד גנים גחלילית לוציפראז או גורמים הדמיה אחרים, אז הגידולים המתקבלים עשויים להיות דמיינו באמצעות הדמיה biלומינסנציה. הדמיה פלואורסצנטית אינו מומלץ על ביצים שלמות בשל רקע גבוה מן קליפת הביצה. זוהי ניתוח נקודות קצה, כאשר פתיחת המעטפת מפחיתה באופן דרסטי את ההישרדות. גידולים עשויים להיות בתמונה בכל עת המתאים לצרכים ניסיוניים ואת המהירות של צמיחת הגידול. עם זאת, בממוצע, ביצים לבקוע 21 ימים הפריה. לכן, יום הפיתוח 18 הוא נקודת קצה מתאימה כדי להימנע מבקיעה בלתי רצויה.

  1. אם יש צורך, העברת ביצים. למתקן ההדמיה להקליט ביצים על מנות 10 ס מ התרבות הרקמה. החזר אותם 37.8 ° צ' (100 ° פ') אינקובטור עם מנגנון הסיבוב הוסר או בוטלה. הלחות אינה חיונית לתחבורה ולהדמיה.
  2. באמצעות מלקחיים קשתית מעוקל, לדחוף בעדינות את מצלמת הרחק מן המעטפת עד מצלמת הוא סומק עם אלבומין והעובר. שימוש רחב מלקחיים הדגימה, לשבור פיסות של המעטפת כדי להרחיב את פתיחת המעטפת כראוי עבור הדמיית הגידול.
  3. הכנס מינימום של 50 μL של 30 מ"ג/mL D-לוציפרמין לתוך אלבומין ביצה. כמות דומה של D-לluciferin יכול להיות גם מצנרת לתוך הטבעת לא מקל או על פני השטח של מצלמת באזור המכיל את התאים מושתל. הדבר מבטיח ביולומינציה אופטימלית בהעדר אספקת כלי דם אידיאלית. דגירה של 8 דקות
  4. הכנס 20-50 μL של isof, לתוך אלבומין של הביצה כדי להחדיר את הביצה. לחלופין, ניתן להכניס את הביצה לחדר אינדוקציה המכיל 2-2.5% מתאדה. עומק הרדמה נאותה מתקבל כאשר התנועה העובריים מפסיקה.
    הערה: כמויות גדולות יותר של isofלורה ane (100 μL) ניתן להשתמש כדי להרוג את הביצה.
  5. מניחים ביצים לתוך מכשיר דימות ביולומינציה ותמונה באמצעות הגדרות מתאימות כפי שנקבעו על ידי הוראות היצרן. עבור מחקר זה, השתמשו בזמן חשיפה של 1 דקות.
  6. כדי לצלם את מצלמת העובר הנותרים, לפתוח את הביצה לתוך 10 ס מ העור הגידול הצלחת.
    1. אחוז בביצה באצבעות שתי הידיים על החלק התחתון של הביצה ליד באמצע הביצה והאגודלים משני צדי פתח המעטפת.
    2. בעדינות לפרק את שני החצאים של הביצה עם האגודלים תוך כדי לחיצה עדינה לתוך הביצה עם האצבעות.
    3. כאשר הפגז הוא כמעט חצי מופרדים מתוך מצלמת והעובר, להפוך את הביצה הפוכה מעל הצלחת 10 ס מ רקמת הרקמה.
    4. המשך להפריד את החצאים של המעטפת. אם מצלמת CAM מנדבק בתוך המעטפת, בעדינות להשתמש באצבעות כדי לדחוף את מצלמת הרחק מן המעטפת.
    5. העובר עשוי להפוך לתבשיל אחר אם יש צורך.
    6. במקרה הצורך, ניתן לנהל את isofלוריאן נוספים כמו בשלב 7.4.

8. קציר הגידול

הערה: גידולים ניתן לקצור בכל עת המתאים לצרכים הניסיוניים ואת מהירות צמיחת הגידול. עם זאת, בממוצע, ביצים לבקוע 21 ימים הפריה. לכן, יום הפיתוח 18 הוא נקודת קצה מתאימה כדי להימנע מבקיעה בלתי רצויה.

  1. לתפוס את הגידול עם מלקחיים. באמצעות מספריים (מספריים איריס האביב לעבוד היטב) או אזמל, גידול הבלו בזהירות מ CAM.
  2. אם הגידול כבר התמרה עם גן לוציא גחלילית, הדמיה מחדש ניתן לבצע כדי לוודא הסרה מוצלחת של גידולים קשים לדמיין.
    הערה: גידולים מסוימים ניתן לנתח על ידי כל שיטה המתאימה לניסוי מסוים. גידולים ניתן גם להשתיל מחדש לתוך CAM או עכברים. כדי לאשר את זהות הגידול, גידולים עשויים להיות קבוע, פרפין מוטבע, ונבדק עם המטאוקסילין ו אאוזין או אימונוהיסטוכימיה כימיקלים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עד כה, מצאנו את השיטה הזאת של השרשה כדי להצליח עבור סרטן השחלות, כליה, ערמונית, ושלפוחית השתן. כל אחד מהם היה מיטבי כדי לזהות תנאים ספציפיים לשרשה, למרות שייתכנו גמישות. של סוגי גידולים נבדק, הצמיחה סרטן השחלות היה הרבה פחות מבוטא ובדרך כלל לא גלוי ללא סיוע של הדמיה ביולומינסנציה (איור 1). עם זאת, ההתקשות של מצלמת יכול להיות מורגש עם מלקחיים באזור של השרשה. זה עשוי לעזור לזהות צמיחת הגידול אפשרי בהעדר הדמיה ביולומינסנציה, אם כי אימות נוסף יידרש באמצעות היסטול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרחבת הגידול וחרט באמצעות מודל מצלמת ההיתרים מהירה יותר הנצפה ישירות הגידול מאשר קיים בדגמי בעלי חיים vivo. בנוסף, עלויות הן נמוכות באופן משמעותי לאחר הרכישה הראשונית של ציוד הושלם, במיוחד כאשר בהשוואה לעלות של עכברים הפרוצים החיסונית. המצב הראשוני והחיסוני של עוברי העוף מתיר בקלות את מצבה של רקמת האדם והמורין. אפילו עם עוצמות אלה, למודל CAM יש מגבלות. הזמן הקצר שיכול להיות יתרון יכול להיות גם לרעת אם מחקרי טיפול לטווח ארוך מוצדקת. מעמד החיסוני/עמידות החיסונית של מודל CAM יכול לסבך את המחקרים של הגידול-אינטראקציות החיסונ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לד ר פויוקו טאנוק ובין וו להכשרה הראשונית בשיטה זו. שיחות עם ד ר אווה Koziolek היו אינסטרומנטלי באופטימיזציה גישה זו והיה מוערך מאוד. עבודה זו לא היה אפשרי ללא מימון מן המקורות הבאים: מחקר טבק הקשורים לתוכנית המחקר פוסט דוקטורט (27FT-0023, כדי ACS), מחלקת ההגנה (משרד ההגנה) סרטן השחלות תוכנית המחקר (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), מחקר הקשורות לטבק תוכנית פיילוט השפעה גבוהה טייס (27FT-0016), ואת התמיכה המוסדית UCLA, כולל מענק הזרע JCCC (NCI/NIH P30CA016042) ו-3R מענק מהמשרד של סגן הקנצלר למחקר LW.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
-010 טפלון (PTFE) לבן 55 Duro Shore D טבעות O טבעותה-O-Ring StoreTEF010טבעת נון-סטיק לזריעת תאים. 1/4 אינץ' מזהה X 3/8 אינץ' OD X 1/16 אינץ' CS פוליטטרפלואורואתילן (PTFE).
C4-2ATCCCRL-3314קו תאי סרטן הערמונית האנושי.
תאי CWR22Rv1CWR היו מתנתו האדיבה של ד"ר דיוויד אגוס (Keck Medicine מאוניברסיטת דרום קליפורניה)
ציטוקרטין נוגדן 8/18 (C-51)Novus BiologicalsNBP2-44929-0.02mgבשימוש בדילול של 1:100 לניתוח אימונוהיסטוכימי של גידולי CAM בשחלות אנושיות.
D-Luciferin Firefly, מלח אשלגןGoldbioLUCK-1G
מספריים תפעוליים עדינים; מעוקל; חד-חד; אורך להב 30 מ"מ; 4-3/4 אינץ'. אורך כוללRoboz SurgicalRS6703זה מסופק כאקסample. כל מספריים מעוקלים דומים יעבדו גם כן.
ערכת כלים Dremel 8050-N/18 Micro 8V MaxDremel8050-N/18ערכה זו מכילה את כל הכלים הדרושים.
ביצי עוף מופרות (רוד איילנד אדום - חום, בדרגת מעבדה)AA Lab Eggs Inc.N/Aיהיה צורך לזהות ספק ביצים מקומי, מכיוון שספק זה מספק רק באופן אזורי.
HT-1376ATCCCRL-1472קו תאים של סרטן שלפוחית השתן האנושית.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo KitIncubator WarehouseHB1588D-NONE-1102-1588-1357ניתן להשתמש בחממות ביצים אחרות, אך יהיה צורך לאמת את אמינותן. לאחר ההשתלה, ניתן להשתמש גם בחממת תאים עם CO2 מושבת.
ID8לא זמין מסחרית, ראה PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg CandlerIncubator Warehouse1102ניתן להשתמש בפמוטים אחרים; עם זאת, זה מועדף מבין אלה שבדקנו. נר זה כלול בערכת החממה הנ"ל.
מלקחיים לאיריס, 10 ס"מ, מעוקל, משונן, 0.8 מ"מ קצותWorld Precision Instrument15915זה מסופק כדוגמה. כל מלקחיים מעוקלים דומים יעבדו גם כן. לשיטה זו נעשה שימוש במספר מותגים.
קוצץ איזופלורןמפיץ0010250
מערכת הדמיה IVIS Lumina II In VivoPerkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; קורנינגללאתמיסת מטריצה חוץ-תאית
MyC-CaPATCCCRL-3255קו תאי סרטן הערמונית בעכברים.
בקר פיפט נייד XP Pipet-AidDrummond Scientific4-000-101כל בקר פיפט דומה יהיה מתאים.
PrecisionGlide מחטים היפודרמיותBD305196זה מסופק כאקסample. כל מחט 18G תעבוד באופן דומה.
RENCAATCCCRL-2947
Semken ForcepsFine Science Tools11008-13זה מסופק כדוגמה. כל מלקחיים דומים או סגנון אחר המתאים להעדפת החוקרים יתאימו.
SKOV3ATCCHTB-77קו תאי סרטן השחלות האנושי.
מלקחיים לדגימהמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72914זה מסופק כאקסample. המלקחיים המשמשים למשיכת הקליפה להדמיית ביולומינסנציה הם באורך של כ-12.8 ס"מ עם קצוות ברוחב 3 מ"מ.
כדורי כותנה סטרילייםפישרברנד22-456-885זה מסופק כדוגמה. כל כדורי צמר גפן סטריליים יספיקו.
מוטות ערבוב עם שוטר גומי; קוטר 5 מ"מ, אורך 6 אינץ'United Scientific SuppliesGRPL06זה מסופק כדוגמה. כל מוטות ערבוב זכוכית דומים יעבדו גם כן.
T24ATCCHTB-4קו תאים של סרטן שלפוחית השתן האנושית.
Tegaderm חבישה שקופה בסגנון מסגרת מקורי 2 3/8 אינץ' x 2 3/4 אינץ'Moore Medical21272
כלי תרבית רקמות, קוטר 10 ס"מקורנינג353803זה מסופק כאקסample. ניתן להשתמש בכל צלחת דומה וסטרילית בגודל 10 ס"מ. אין צורך בטיפול בתרבית רקמות.
צינורות מעבדה שקופים של Tygon - קיר 1/4 x 3/8 x 1/16 (50 רגל)TygonAACUN017זה מסופק כאקסample. כל צינור בגודל דומה יעבוד גם כן.
LDEV 354248

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
  2. Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
  3. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
  4. Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
  5. Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
  6. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  7. Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  8. Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935(2015).
  9. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
  10. Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
  11. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  12. Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12(2017).
  13. Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
  14. Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26(2016).
  15. Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815(2011).
  16. Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
  17. Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686(2017).
  18. Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004(2019).
  19. Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28(2018).
  20. Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339(2014).
  21. Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
  22. Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201(2017).
  23. Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
  24. Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991(2017).
  25. Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
  26. Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
  27. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  28. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CAM

מאמרים קשורים