Method Article

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

DOI:

10.3791/60686

⸱

February 21st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים הקלטה בזמן אמת של יחסים מינון-תגובה מלאה עבור agonist-המושרה GPCR הפעלה משכבת תא אחת גדל על מיקרואלקטרודה אחת באמצעות תווית ללא מדידות עכבה. ערכת המינון החדשה מגדילה באופן משמעותי את התפוקה ללא הפסד ברזולוציית הזמן.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבוסס על תווית חינם מבוססי בחני משמשים יותר ויותר לפני באופן פולשני ליגולי מחקר המושרה gpcr בניסויים בתרבות התא. הגישה מספקת ניטור התא בזמן אמת עם רזולוציית הזמן תלויי התקן עד כמה עשרות אלפיות הראשונה והוא אוטומטי מאוד. עם זאת, כאשר מספרים לדוגמה לקבל גבוה (כגון, מחקרים מינון עבור ליגניות שונות), את העלות של מערכי האלקטרודה החד, כמו גם את רזולוציית הזמן הזמין עבור הקלטות היטב-by-היטב עשוי להיות מגביל. לכן, אנו כאן הצגת פרוטוקול אגוניסט טורי התוספת אשר יש את הפוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את הפלט של gpcr-התווית חינם. באמצעות פרוטוקול התוספת הטורית אגוניסט, אגוניסט gpcr נוסף ברצף בריכוזים גוברת לשכבת תא אחת ברציפות ניטור העכבה של המדגם (מצב אגוניסט). עם גישה טורית זו, כעת ניתן ליצור עקומת מינון מלא של תגובה עבור אגוניסט gpcr מתוך שכבת תא אחת בלבד. פרוטוקול התוספת הטורית של האגוניסט חל על סוגי צימוד מסוג GPCR שונים, Gq g/0 או g והוא תואם לרמות ביטוי רקומביננטי ואנדוגני של הקולטן תחת המחקר. חסימת הקולטן על ידי האנטוניסטים GPCR הוא הניתן גם (מצב היריב).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דו ח זה מציג תיאור מפורט של פרוטוקול התוספת הטורית שפותחה עבור כימות החלבון המושרה G-חלבונים בשילוב קולטן (GPCR) הפעלה בתאים מגודלים על ידי תווית ללא מדידות עכבה. מצמידים בחלבון G (GPCRs) מעורבים בהמון תפקודים פיזיולוגיים ומחלות אנושיות1. בגלל זה והנגישות הטובה שלהם במשטח התאים, GPCRs הן אחת ממטרות הסמים החשובות ביותר. הערכה זו משתקפת במספר מוערך של ~ 700 תרופות שאושרו על-ידי GPCRs, שוות ערך ל-~ 35% שיתוף בכל התרופות המשווקים2.

התפתחות התרופות החדשות כוללת שני תהליכים מרכזיים: (i) האפיון ההזדהות והפונקציונלי של מולקולות היעד הביולוגי ו-(ii) גילוי של חומרי הובלה חדשים והתפתחותם לתרופות בניהול. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שזריעת תאים במערכים אלקטרודה

הערה: בחירת פריסת האלקטרודה היא החלפה בין רגישות לבין מספר התאים בלמידה. ככל שאלקטרודה קטנה יותר, המדידה רגישה יותר, אך קטנה יותר היא מספר התאים הנמצאים במחקר. עבור תאים המראים תנודות עכבה חזקות לאורך זמן בתנאים בסיסיים, מעדיפים אלקטרודות גדולות או מקבילות.

  1. מחמם מראש את כל הפתרונות הדרושים לפסיית התא הסטנדרטי ולזריעה באמבט מים ב37 ° c. עבור בחני אומר עם האדם U-373 MG תאים שלוקח: מלוחים מואגור פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיום, 0.05% (w/v) טריפסין, מדיום תרבות התא (מדיום מינימלי של הנשר (emem) שיושלם עם 5% (v/v) סרום עגל עוברי (fcs), 2 מ"מ L-גלוטמין ו 100 μg/mL פניצילין/סטרפטומיצין).
  2. שטפו את שכ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ערכה טיפוסית להכנת פתרונות אגוניסט שונים מוצג לניסוי באמצעות 8-היטב מערכי אלקטרודה עם היסטמין כמו אגוניסט בטבלאות 1-4. טבלה 1 ו- table 2 להציג כרכים וריכוזים עבור ניסוי באמצעות מצב חיבור 1 (cf., איור 1), בעוד טבלה 3 וטבלה 4 להציג אמצעי אחסון וריכוזים עבור ניסוי לאחר מצב התוספת 2 (cf., איור 1). נתונים חושבו באמצעות משוואה (1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור מדידות עכבה ללא תווית כדי לקבוע את הקשר המינון-תגובה של agonist המושרה הפעלת GPCR בהעדר או נוכחות של יריבים ספציפיים לאותו קולטן. הוכחת המושג של שיטה זו הוצגה בפרסום האחרון12. לידיעתנו שלנו הוא המחקר הראשון המתאר את הקמתה של עקומת מינון מלא-תגובה של אגוניסט-בתיווך GPCR הפעלה באמצעות שכבת תא אחת בתוך מבחנה. הגישה באופן בלתי נמנע דורשת שימוש בגישות לניטור תאים ללא תוויות ולא יחולו על מספר נקודות קצה.

הפרוטוקול הוכח על הדוגמה של U-373 בתאי MG, אש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לברברה Goricnick ו-Nadja Hinterreiter על עזרתם בהכנת תאים והכנת פתרונות ניסיוניים. המחברים מכירים בהכרת תודה את התמיכה הפיננסית של קבוצת ההדרכה למחקר 1910 "כימיה מרפא של בררני GPCR ליגנדס" הממומן על ידי קרן המחקר הגרמני (DFG) תחת מספר 222125149. JAS מודה במיוחד על מלגה שניתנה על ידי תוכנית השוויון המגדרית הבווארית.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bü לשכת הספירה שלמרינפלד (Lauda-Kö nigshofen, גרמניה)640210
צלוחיות תרבית תאים 25 ס"מ2Greiner bio-one (Frickenhausen, גרמניה)690175
חממת תאים (Heraeus Function Line BB15)Thermo Scientific (דרמשטדט, גרמניה)\
צנטריפוגה (Heraeus 1S-R)Thermo Scientific (דרמשטדט, גרמניה)\
Diphenhydramine hydrochlorideסיגמא אולדריץ' (טאופקירכן, גרמניה)D3630
Eagle's Minimum Essential Medium עם 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז ו-2.2 גרם/ליטר NaHCO3Sigma Aldrich (Taufkirchen, גרמניה)D5671
מכשיר עכבה (ECIS Zθ)Applied BioPhysics Inc. (טרויה, ניו יורק, ארה"ב)\
מערכי אלקטרודות 8 בארות (8W1E PET)Applied BioPhysics Inc. (טרויה, ניו יורק, ארה"ב)\בסיס PET עם 0.049 מ"מ2< / sup> אלקטרודה עובדת ו ~ 50 מ"מ 2< / sup> אלקטרודה נגדית (זהב)
מערכי אלקטרודות 96 בארות (96W1E+ PET)Applied BioPhysics Inc. (טרויה, ניו יורק, ארה"ב)\PET בסיס עם שתי אלקטרודות (זהב) עם שטח אלקטרודה כולל של 0.256 מ"מ2
סרום עגל עוברי (FCS)ביוכרום (ברלין, גרמניה)S0615
היסטמין דיהידרוכלורידקארל רוט (קרלסרוהה, גרמניה)4017.1
קולט אדים זרימה למינרית (Herasafe, KS 12)Thermo Scientific (דרמשטדט, גרמניה)51022515ארון בטיחות Class II
L-15 בינוניתרמו סיינטיפיק של לייבוביץ (דרמשטדט, גרמניה)21083-027
L-גלוטמיןסיגמא אולדריץ' (טאופקירכן, גרמניה)G7513
מיקרופיפטה גדולה (100 - 1000 ומיקרו; L)ברנדט (ורטהיים, גרמניה)704780
מיקרופיפטה גדולה (20 - 200 ומיקרו; L)ברנדט (ורטהיים, גרמניה)704778
מיקרוסקופ (ניגודיות פאזה, ניקון דיאפוט)ניקון (Dü סלדורף, גרמניה)
פניצילין/סטרפטומיציןסיגמא אולדריץ' (טאופקירכן, גרמניה)P0781
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)סיגמא אולדריץ' (טאופקירכן, גרמניה)D8537
פיפטה,גריינר ביו-וואן סרולוגי (פריקנהאוזן, גרמניה)607 180
פיפטור (accu-jet pro)ברנדט (ורטהיים, גרמניה)26300
TrypsinSigma Aldrich (Taufkirchen, גרמניה)T4174ב-PBS עם צינור EDTA של 1 מ"מ
15 מ"לגריינר ביו-וואן (פריקנהאוזן, גרמניה)188 271
שפופרת, 50 מ"לגריינר ביו-וואן (פריקנהאוזן, גרמניה)210 261
תאי U-373 MGATCC (רוקוויל, מרילנד, ארה"ב)אמבט מים ATCC HTB-17
(TW21)ג'ולאבו (Seelbachגרמניה)\
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free Impedance AssaysGPCR AssaysSerial Agonist AdditionDose Response CurveImpedance MonitoringHistamine ConcentrationFour Parameter Logistic ModelReceptor BlockingGPCR AntagonistsCell Seeding

Related Articles