הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של שאינם אנושיים הלבלב של איון צריכת החמצן

4.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60696

⸱

18 בדצמבר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 2Agilent Technologies, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 4Department of Veterans Affairs Tennessee Valley, 5Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים את המדידה המדויקת והניתנת לכימות של צריכת החמצן באיונים שאינם אנושיים הלבלב. שיטות הטעינה של איון וציפוי המיקרופלטה מספקות מסגרת למדידת יעילות של נשימה בסוגים אחרים של הספרואידים מתורבתים.

תקציר

המדידה של צריכת החמצן באשכולות ספרואיד של תאים, כגון איולי לשעבר vivo הלבלב, היסטורית היה מאתגר. אנו להדגים את המדידה של צריכת חמצן של איון באמצעות 96-ובכן מיקרופלייט המיועדים למדידת צריכת החמצן ב spheroids. בתוך מעשה זה, מיקרולוחיות ספרואיד מצופות בדבק תא ורקמה ביום שלפני השיטת הפעולה. אנו מנצלים נפח קטן של הפתרון דבק כדי לעודד הדבקות איון רק בתחתית הבאר. ביום השימוש, 15 איונים נטענים ישירות לבסיס של כל הבאר באמצעות טכניקה המבטיחה מיקום אופטימלי של איונים ומדידה מדויקת של צריכת החמצן. היבטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלי מאובטים באופן פרמקולוגית באיונים לא אנושיים, כולל נשימה תלוית ATP, נשימה מירבית ודליפת פרוטון. שיטה זו מאפשרת לתוצאות עקביות, הניתן לשימוש באמצעות מספר קטן של איונים לכל טוב. זה יכול תיאורטית להיות מיושם על כל הרוהרואידים תרבותי בגודל דומה.

מבוא

על מנת לשמור על רמות הגלוקוז בדם נורמלי, התא β הלבלב חייב לחוש את הגבהים בגלוקוז ולהפריש אינסולין בהתאם. צימוד הפרשת האינסולין עם רמות הגלוקוז קשור ישירות לחילוף החומרים של הגלוקוז ולייצור ATP דרך זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. כך, המיטו, לשחק תפקיד קריטי הפרשות הגירוי צימוד1. הערכת β-מיטוכונדריאלי-תא יכולה לחשוף פגמים המובילים לפגיעה באינסולין. הפרשה של גלוקגון על ידי תאים הלבלב α הוא גם קשור הדוק פונקציה מיטוכונדריאלי2. למרות מונצח קווי התא הוכיחו שימושי עבור סוגים מסוימים של assays הפיזיולוגיה של תאים אלה אינה מדויקת באופן מדויק הפונקציה איון שלם, כפי שמודגם על ידי פוטנציאל של הפרשת אינסולין על ידי גלוקגון3,4 ואת עיכוב הפרשת גלוקגון על ידי אינסולין/סומטוסטטין5,6 ב איים שלמים. זה מדגים את הצורך מדידת צריכת החמצן באמצעות איים שלמים, שלם.

טכניקות עבור המדידה של תא מוריקה של התא איון התפתחו לאורך זמן, מהשימוש של צבעי פלורסנט רגישים חמצן7 כדי חיישנים במצב מוצק כי מדידת ישירות צריכת החמצן8. תוכנן בתחילה עבור monolayer, תאים חסיד, בדרך כלל מערכות השימוש בתרבות התא הוכיחו להיות לא יעילים עבור איולי הלבלב. כמו האיים לא לדבוק באופן טבעי הבארות, הם נוטים להיות נדחף לפריפריה של התרבות היטב וכתוצאה מכך מדידה לא מדויקת של צריכת החמצן9. כדי להילחם בבעיה זו, לוחיות 24-היטב מיוחדות עם דיכאון מרכזי שיכול להכיל איונים פותחו9. עם זאת, הצלחת 24-באר מערכת היה מוגבל על ידי מספר גדול של איונים נדרש (50-80 לכל טוב) ואת מספר התנאים שניתן היה לבדוק בו10. ההתפתחות האחרונה של 96-מיקרולוחיות היטב תוכנן במיוחד עבור ניתוח השטף החילוץ ב spheroids יש להתגבר על המחסומים האלה, המאפשר את המדידה של איון הגז מוריקה עם 20 או פחות איים לכל טוב10.

כאן, אנו להדגים את השימוש במערכת זו כדי למדוד צריכת חמצן באיים מ מקוק יפני (macaca פאסכאטה), מודל בעל חיים עם ביולוגיה איון דומה לבני אדם11,12. , בפרוטוקול זה. מנתחים 15 מקוק בבאר בידינו, 15 איונים לכל התוצרת הגבוהה בסיסית צריכת החמצן הבסיסית מאשר פחות איונים, עם הפעלה חזקה ודיכוי של נשימה בתגובה טיפול תרופתי. אנו מדגישים את הצעדים להכנה לצורך התמדה, שיטה אפקטיבית להעלאת האיונים העקביים במרכז הבאר, ואתגרים משותפים בעת ביצוע הצורך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מחסנית מיקרופלייט וסנסור ביום הקודם להפעלת השיטת המחשב

איונים היו מבודדים מקופי-התוכי היפני בן השלוש, כפי שתיאר בעבר13. שיטה זו דומה מאוד לזה ששימש לבידוד איונים אנושיים מתורמים של גופה, אבל שונה מעכברים, שבו pancreata מנופחים לעתים קרובות עם פתרון הקולגן בעוד החיה נמצאת תחת הרגעה לפני הסרת איברים. אחזור איון נערך בהתאם להנחיות של הוועדה לטיפול בעלי חיים מוסדיים (IACUC) של המרכז לחקר הפרימטים הלאומית של אורגון (ONPRC) ואורגון בריאות ומדע האוניברסיטה ואושרו על ידי ה-ONPRC IACUC. ה-ONPRC מבוסס על חוק הרווחה והתקנות הנתמכות על-ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית ומדיניות שירות בריאות הציבור על טיפול הומאני ושימוש בבעלי חיים מעבדתיים בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות.

  1. הכנת מיקרולוחית ספרואיד
    1. הכינו 3 מ ל של תמיסה של 0.1 מ' מביקרבונט נתרן. המסנן מעקר את הפתרון. אנו משתמשים במסנן 0.45 יקרומטר (טבלת חומרים).
    2. במכסה של תרבות התא, הוסף 200 μL של הדבקה של תא ורקמה (טבלת חומרים) עד 2.8 מ ל של 0.1 מ' נתרן ביקרבונט. לאחר מכן, להוסיף 20 μL של פתרון זה לחלק התחתון של כל טוב של 96-היטב מיקרולוחית ספרואיד (טבלת חומרים). ודא כי בועות האוויר יוסרו מקצה pipet ורק את החלק התחתון של הצלחת מכוסה. ציפוי המיקרולוח מונע איונים מלהתקדם בצידי הבארות כאשר התרופות מתווספות ומעורבות בבאר במהלך התהליך.
      הערה: יש צורך לשים מעיל כמו בארות רבות כפי שישמשו עבור איונים כאשר הצורך מופעל. אם רק מספר בארות ישמשו, ניתן לשנות את הפתרון הדביק את התאים למטה בהתאם. הדבק התאי המשמש בתוך השימוש הוא פתרון חלבון מגובש שהופק מהמוסזל הימי. לחילופין, אימונולוגיה בארות יכול להיות מצופה עם 20 μl של 100 μg/mL פולי-D-ליזין.
    3. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, החממה לא שיתוף2 למשך שעה אחת.
    4. , בסביבה סטרילית. מחצי את התמיסה של דבק התא מלוחית הרישוי לשטוף כל היטב פעמיים עם 400 μL של 37 ° צ' מים סטרילי באמצעות pipet רב-ערוצי. . הרשו לאוויר להתייבש
    5. לאחר 30-40 דקות, יש לכסות את הצלחת ולאחסן לילה ב -4 ° c.
  2. הידרציה של מחסנית החיישן
    1. בסביבה סטרילית, פתח את חבילת מחסנית החיישן (טבלת חומרים) והסר את התוכן. מניחים את מחסנית חיישן הפוך ליד לוחית השירות.
    2. למלא כל היטב את צלחת השירות עם 200 μL המים סטרילי ולהקטין את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת השירות. המקום מורכב מחסנית חיישן ולוחית כלי השירות ב 37 ° c, חממה שאינה CO2 בלילה.
  3. הכנת כהנמלה
    1. מחלקים 25 מ ל של כלינמלה (שולחן חומרים) לתוך צינורית חרוט 50 mL. מניחים את הצינור ב-37 ° c, חממה שאינה בעלת2 לילה.

2. פרוטוקול הכנה למדיה, טעינת איונים והעמסת מחסנית החיישן ביום העריכה

  1. הכנת מדיה
    1. כדי 48.5 mL של מדיה בסיס (DMEM מינימלי, ראה טבלה של חומרים), להוסיף 500 μl כל אחד של נתרן פירובט 1 מ"מ ו 2 מילימטר גלוטמין. בנוסף, להוסיף 496 μL של 200 mg/ml גלוקוז (הריכוז הסופי של גלוקוז במדיה הוא 5.5 mM).
      הערה: הריכוז גלוקוז בסיסית נשמר קבוע עבור ניסויים אלה. עם זאת, גלוקוז יכול לשמש גם כדי לעורר נשימה בנוסף המניפולציות הפרמקולוגית תיאר מכה10.
    2. ודא כי ה-pH הוא 7.4 +/-0.1, התאמה במידת הצורך.
  2. הכנת מחסנית חיישן
    1. לקחת מחסנית חיישן מתוך החממה, להסיר מכסה מחסנית חיישן, ולרוקן את המים מבארות. מקום 200 mL של מחמם טרום מחומם לתוך כל טוב להחליף מכסה מחסנית חיישן.
    2. הניחו את מחסנית החיישן בחממה במשך כשעה אחת (עד לצורך).
  3. הכנת תרופות לצורך שיטת מצוקה מיטוכונדריאלי
    1. פתח את ערכת בדיקת הלחץ (טבלת חומרים) ולהסיר את התוכן. להפוך את המלאי ואת פתרונות העבודה עבור Oligomycin, פחמן ציאניד-4-(trifluoromethoxy) פנילהידרלזון (FCCP), ו Rotenone/Antimycin A (AA) כדלקמן.
      1. Oligomycin: להוסיף 630 μL של מדיה התאספו לצינור כדי להפוך 100 מניות μM. אז, לדלל 45 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז היציאה (הסוף היטב ריכוז לאחר ההזרקה יהיה 4.5 μM)
      2. FCCP: להוסיף 720 μL של הרכבה מדיה לצינור כדי להפוך 100 μM מניות. לדלל עד 10 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז היציאה (הריכוז האחרון היטב יהיה 1 μM)
        הערה: bsa ו/או fbs אין להוסיף למדיה, כמו זה יכול להשפיע על הפעולה של מיטוכונדריאלי uncouplers14.
      3. Rotenone/AA: להוסיף 540 μL של הרכבה מדיה לצינור כדי להפוך 50 μM מניות. לדלל עד 25 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז הנמל (ריכוז היטב הסופי יהיה 2.5 μM)
        הערה: הריכוזים הנ ל יצרו תוצאות עקביות בידינו. FCCP נוספים הובילו לעלייה נוספת בנשימה. עם זאת, ריכוזי התרופה עשוי להיות צורך להתאים בהתאם לגודל איון, ובמיוחד עם איונים ממינים שונים או שאינם מסוג spheroids. להתייחסות, הקוטר הממוצע של איון הפרימטים שאינם אנושיים הוא כ 150 יקרומטר15.
  4. הכנת לוחית ספרואיד והעברה של איונים
    1. יד לבחור איונים הלבלב לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ ממנה תרבות תא המכיל מדיה התאספו כדי להשיג ליד 100% טוהר.
      הערה: איואיי צריכים להופיע מעוגלים, עם פריפריה מוגדרת בבירור, ולהופיע צפוף יותר מאשר מזהמים רקמות אקסוקרינית. להימנע מאיונים שנראים פגומים או בלויים. בניסוי זה, גודל איון לא נמדד ישירות, למרות שניסינו לבחור איים של בגודל שווה ערך עבור כל טוב ומדגם.
    2. לטעון כל באר של אימונולוגיה מיקרולוחית עם 175 μl של הרכבה מדיה באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
    3. באמצעות P20 מערכת הצינורות מוגדר 15 μL, משחים 15 איים ממנה לתרבות התא. איונים צריכים להיות גלויים. בעצת הפיפטה לעין העירומה
    4. כדי להעביר איים למיקרואיד microplate, מתיחת צנרת נמוכה יותר לתחתית הבאר, בקושי להרים, והפיפטה לאט החוצה נפח קטן מאוד (~ 5 μL). תאשר שכל האיונים. הותירו את קצה הצינורות כל טוב צריך לקבל 15 איים. מדי פעם לבדוק מיקרואיד מיקרו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי איונים הם בתחתית של כל הבאר ולא תקוע לצדדים.
      הערה: להימנע מטעינת בארות הפינה עם איונים. חמצן ו-pH השטף מתוך פלסטיק יכול להתרחש במהלך התהליך, וזה מחמיר את ארבע בארות הפינה.
    5. לאחר כל האיים הועברו המיקרואיד אימונולוגיה, הדגירה המיקרוצלחת ב 37 ° c, לא שיתוף2 בחממה תוך השלמת השלבים הבאים.
  5. טעינת מחסנית החיישן והפעלת המנה
    1. הסר מחסנית חיישן מהאינקובטור. יציאות A-C עבור כל טוב חייב להיות טעון עם סמים או מדיה. בארות המכילות איונים וארבע הבארות הפינתיות צריכות להיות עמוסות בסמים. אין לטעון בארות שאינן פינתיות ללא איונים במדיה. ניתן להשאיר את Port D ריק. טען יציאה A (למעלה משמאל של כל חיישן) עם 20 μL של oligomycin או מדיה. טען יציאה B (מימין למעלה) עם 22 μL של FCCP או מדיה. טען יציאה C (למטה משמאל) עם 25 μL של Rotenone/AA או מדיה.
    2. תוכנית שיטת מנתח השטף בלתי מ, עבור 30 דקות הבסיסית הנשימה זמן (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה), 42 דקות מדידה תקופת המדידה (7 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה), 30 דקות FCCP (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מדידה), ו 30 דקות Rotenone/AA (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה).
    3. הפעל את הטיפול ועקוב אחר ההוראות על המסך עבור כיול החיישן והוספת המיקרו-לוחית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לטעון איים לתוך microplate, 15 איונים צריכים להיות משופחת ב 15 μL של מדיה, כפי שמוצג באיור 1א. איונים באופן טבעי להתיישב לקראת החלק התחתון של הטיפ pipet בתוך כמה שניות. לאחר מכן, הקצה התחתון מופחת לתחתית הבאר. הטיפ הוא מוסר מעט מאוד, וכמות קטנה (כ 5 μL) הוא ממוקם החוצה יחד עם איונים. טכניקה זו גורמת למיקום עקבי של איון בחלק התחתון של מיקרופלייט היטב (איור 1B) מתן אפשרות למדידות מדויקות של צרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר של צריכת חמצן של איון כבר הושפע בעבר על ידי הצורה כדורית של איונים, חוסר הדבקות שלהם משטחי התרבות, ואת מספר איונים נדרש לכל טוב. בפרוטוקול זה, אנו להדגיש את היעילות של 96-היטב מיקרו-לוחית ספרואיד עבור מדידת צריכת החמצן של איון על מספר קטן של איונים ולהדגים טכניקה לטיפול וטעינת איונים שהוא אפשרי מבחינה טכנית ומייצרת עקבית תוצאות.

כדי איונים לדבוק בחלק התחתון של המיקרו לוחית ולהיות מודאג במהלך ערבוב שלבים לאורך הזמן, 96-היטב אימונולוגיה מצופה בפתרון דבק תא יום לפני הצורך. אמנם זה מועיל בדר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים רוצים להכיר את הליבה של תפוקה גבוהה של ואנדרבילט ההקרנה לשימוש המתקנים שלהם, Agilent Biotechnologies, ד ר. פול Kievit (אורגון בריאות ומדע האוניברסיטה) עבור הפרימטים שאינם אנושיים, ו אריק דונהיו (אוניברסיטת ואנדרבילט) לסיוע עם איור 1. J.M.E. של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס T32GM007347. מ היה נתמך על ידי NIH/NIDDK (R24DK090964-06) ואת המחלקה לעניינים ותיקי (BX003744).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית תאים, בסגנון 60 מ"מ X 15 מ"מקורנינג430166
תא תא ודבק רקמותקורנינג354240
צינור חרוטי, 50 מ"לפלקון352070
דקסטרוז נטול מיםפישר סיינטיפיקBP350-1לתמיסת גלוקוז, 200 מ"ג/מ"ל, פילטר סטרילי
מאגרים חד פעמיים (סטריליים), 25 מ"לVistalab3054-1033להעמסת צינור רב ערוצי
EZFlow סטרילי 0.45 μ מסנן מזרק m PES, 13 מ"מFoxx Life Sciences371-3115-OEM
L-גלוטמיןGibco25030-081200 מ"מ (100x)
קצות פיפטה רב-ערוציתThermoFisher Scientific94410810
פיפטה רב ערוצית, 15-1250 μ LThermoFisher Scientific4672100BTפיפטות
P20, P200 ו-P1000Eppendorf2231000602
pH ProbeHanna InstrumentsHI2210-01
קצות פיפטה, 20 μ L, 200 ו-mu; L, 1000 μ Lאולימפוס24-404, 24-412, 24-430
סוסון ים XF בסיס מדיהAgilent103334-100
ערכת בדיקת מאמץ של סוסון ים XF תא מיטוAgilent103015-100כוללת אוליגומיצין, FCCP ורוטנון/אנטימיצין
A מנתח סוסון ים XFe96AgilentS7800Bכולל תחנת הכנה עם 37 ° C חממה ללא CO2
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak MiniAgilent102905-100כולל מחסנית חיישן, מיקרופלטה ספרואידית וקליברנט
נתרן ביקרבונטפישר סיינטיפיקBP328-500
נתרן פירובטGibco11360-070100 מ"מ (100x)
מזרק מיקרוסקופ סטריאואולימפוסSZX9
(סטרילי), 5 מ"לBD309603לסינון סטרילי
מים (סטריליים)SigmaW3500-500 מ"ל
מומלצות

מקורות

  1. Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
  2. Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
  3. Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420(1970).
  4. Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
  5. Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139(2019).
  6. Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
  7. Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
  8. Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).
  9. Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023(2012).
  10. Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
  11. Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
  12. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  13. Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
  14. Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
  15. Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
  16. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  17. Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אייlets של פרימטים שאינם אדםמדידת צריכת חמצןבדיקת מיקרו-פלטה לספרואידיםניתוח נשימה מיטוכונדריאליתטכניקת היצמדות של אייलेट्सמנתח שטף חוץ-תאיOligomycin FCCP Rotenoneפרוטוקול זריעת אייलेट्सטיפול באייलेट्स ראשונייםהערכת תפקוד מיטוכונדריאלי
ניתוח של שאינם אנושיים הלבלב של איון צריכת החמצן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.