מאמר שיטה

מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה

DOI:

10.3791/60728

⸱

17 במאי 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסמיכות תיוג (PL) טכניקות באמצעות הנדסה ascorbate peroxidase (איפקס) או esהמאנוכיה קולי ביוטין ליגאז בירה (המכונה bioid) השתמשו בהצלחה לזיהוי של אינטראקציות חלבון חלבון (ppis) בתאי מיונקים. עם זאת, דרישות של תחמוצת מימן רעילים (H2O2) ב איפקס מבוסס PL, זמן דגירה ארוך יותר עם ביוטין (16 – 24 שעות), וטמפרטורת דגירה גבוהה יותר (37 ° c) ב bioid מבוססי PL מגביל באופן חמור את היישומים שלהם בצמחים. האובייקט המבוסס על TurboID שתואר לאחרונה מטפל במגבלות רבות של BioID ו-איפקס. TurboID מאפשר תיוג הקירבה מהירה של חלבונים רק 10 דקות תחת טמפרטורת החדר (RT) תנאים. למרות שכלי השירות של TurboID הוכח במודלים בעלי חיים, לאחרונה הראו כי מבוססי TurboID PL מבצעת טוב יותר בצמחים לעומת BioID עבור תיוג של חלבונים העומדים בפני חלבון של ריבית. מסופק כאן הוא פרוטוקול צעד אחר צעד לזיהוי של שותפים אינטראקציה חלבונים באמצעות מסוף N-terminal מספר/interleukin 1 (טיר) התחום של מבני נוקלאוטיד-מחייב לוקמיה עשיר (NLR) חלבון משפחה כמודל. השיטה מתארת בנייה וקטורית, הסתננות של ביטויים של חלבונים, טיפול ביוטין, חילוץ חלבונים והתפלה, כימות והעשרה של חלבונים ביולוגיים על ידי טיהור אהדה. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד חלבונים אחרים של עניין טבק ומינים צמחים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PPIs הבסיס לתהליכים סלולריים שונים. שיטות מסורתיות לזיהוי PPIs כוללים שמרים-two-היברידית (Y2H) הקרנה immunoprecipitation בשילוב עם ספקטרומטר מסה (IP-MS)1. עם זאת, שניהם סובלים מכמה חסרונות. לדוגמה, הקרנת Y2H מחייבת זמינות של ספריית Y2H של מפעל היעד או של מינים של בעלי חיים. בניית ספריות אלה היא אינטנסיבית ויקרה. יתר על כן, הגישה Y2H מבוצעת הטרוולוגי תא יחיד איקריוטית האורגניזם שמרים, אשר עשוי לא לייצג את הסטטוס הסלולר של תאים איקריוטית גבוה יותר.

לעומת זאת, ה-IP-MS מראה יעילות נמוכה ב לכידת ארעי או חלש PPIs, וזה גם לא מתאים לאותם חלבונים עם שפע נמוך או הידרופוטטי גבוה. חלבונים חשובים רבים המעורבים במסלולים איתות הצמח כגון kinases כמו קולטן (RLKs) או משפחת NLR של קולטנים החיסונית מבוטאים ברמות נמוכות ולעתים קרובות אינטראקציה עם חלבונים אחרים באופן מתמיד. לכן, היא מגבילה מאוד את ההבנה של מנגנונים המשמשים לוויסות החלבונים הללו.

לאחרונה, הסמיכות תיוג (PL) שיטות מבוסס על הנדסה ascorbate peroxidase (פיסגה) ו מוטציה esהמאשכיה coli ביוטין ליגאז בירהR118G (המכונה bioid) פותחו ומנוצל למחקר של ppis2,3,4. העיקרון של PL הוא כי חלבון היעד של עניין הוא התמזגו עם אנזים, אשר מזרז את היווצרות של יציב משך biotinyl-amp (ביו-amp). אלה bio-AMP חינם משתחררים על ידי אנזימים PL לפזר לסביבה של חלבון היעד, המאפשר ביולציה של חלבונים האבובית על אמינים העיקרי בתוך רדיוס מוערך של 10 ננומטר5.

לגישה זו יש יתרונות משמעותיים על הגישות המסורתיות של Y2H ו-IP-MS, כגון היכולת ללכוד PPIs ארעי או חלש. יתר על כן, PL מאפשר תיוג של חלבונים האבותאיים של חלבון היעד בסביבות הסלולר הילידים שלהם. לאנזימי PL שונים יש חסרונות ייחודיים בעת החלתם על מערכות שונות. לדוגמה, למרות שהפיסגה מציעה הרבה יותר קינטיקה בהשוואה ל-BioID, והיא מיושמת בהצלחה במערכות היונקים, הדרישה של תחמוצת מימן רעילה (H2O2) בגישה זו הופכת את הדבר לאינו מתאים למחקרים מסוימים בצמחים.

לעומת זאת, BioID-מבוססי PL מונע שימוש ב-H2O רעיל 2,אבל שיעור התיוג הוא איטי (המחייב 18 – 24 H כדי להשלים biotinylation), ובכך עושה לכידת של ppis ארעי פחות יעיל. יתר על כן, טמפרטורת דגירה גבוהה יותר (37 ° c) נדרש עבור PL יעיל על ידי BioID מציג לחץ חיצוני על אורגניזמים מסוימים, כגון צמחים4. לכן, הפריסה המוגבלת של ביואיד מבוססי PL בצמחים (כלומר, הפרוטופזיס אורז, arabidopsis, ו N. benthamiana) דווחו6,7,8,9. האנזים ה-TurboID שתואר לאחרונה מתגבר על הליקויים של איפקס וביואיד מבוססי PL. TurboID הראה פעילות גבוהה המאפשרת הישג של PL בתוך 10 דקות ב-RT10. PL מבוססי TurboID הוחל בהצלחה בתאים מיונקים, זבובים, ותולעים10. לאחרונה, אנחנו וקבוצות מחקר אחרים באופן עצמאי אופטימיזציה המורחבת השימוש turboid מבוסס PL עבור לימוד ppis במערכות צמחים שונות, כולל נ. בנדיאמיאנה וצמחים arabidopsis שורשים עגבניות שעירים11,12,13,14. מנתח השוואתי עולה כי turboid מבצע טוב יותר עבור PL בצמחים לעומת bioid11,14. היא גם הוכיחה את החוסן של מבוססי turboid PL ב רצפה על ידי זיהוי מספר אינטראקציות הרומן עם הקולטן nlr11, חלבון שהשותפים אינטראקציה שלהם בדרך כלל קשה להשיג באמצעות שיטות מסורתיות.

פרוטוקול זה ממחיש את הקוד המבוסס על turboid ב-רצפה על ידי תיאור הזיהוי של חלבונים אינטראקציה של התחום N-terminal טיר של קולטן החיסון nlr ב -N. benthamiana צמחים. ניתן להרחיב את השיטה לכל חלבונים מעניינים ב- N. benthamiana. חשוב מכך, הוא מספק התייחסות חשובה לחקירת PPIs במינים צמחיים אחרים כגון Arabidopsis, עגבניה, ועוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: מבט כולל על השיטה מוצג באיור 1.

1. הכנת חומרים צמחיים

  1. הגדל N. benthamiana זרעים באדמה רטובה בצפיפות גבוהה ולשמור אותם בחדר האקלים עם אור 16 h (כ 75 μm/מטר2) ו-8 h photoperiod כהה ב 23 – 25 ° c.
  2. כשבוע לאחר מכן, בזהירות להעביר כל שתיל צעיר כדי 4 ' x 4 ' סירים ולשמור את השתילים באותו חדר.
  3. לשמור על הצמחים בחדר במשך כ 4 שבועות עד שהם גדלים לשלב עלה של 4 – 8 לצורך הסתננות הגידול15.

2. בניית מfusions TurboID

  1. השתמש בטכניקת שיבוט מולקולרית סטנדרטי כדי ליצור פיוז'ן של חלבון היעד עם TurboID (PCR TurboID מ-Addgene ה#107177). כאן, השתמשנו בתחום של N-terminal טיר של קולטן החיסון NLR כמו חלבון היעד של עניין ובנוי טיר התמזגו TurboID תחת השליטה של כרובית וירוס פסיפס 35 s יזם (p35S:: טיר-TurboID).
    הערה: פיוז ' ן של האנזים TurboID הטרמינוס או הסופית של חלבון היעד יהיה תלוי בחלבון הריבית. בדרך כלל, עבור חלבון cytoplasmic, הן טרמיני צריך להיות מקובל, כל עוד היתוך TurboID לא משפיע על הפונקציה של חלבון היעד. עם זאת, עבור חלבון קרום מקומי, הטופולוגיה חלבון צריך להיות מאופיין מראש לפני קביעת איזו הטרמינוס הוא הטוב ביותר עבור היתוך TurboID.
  2. בנו את הסיטרין של TurboID-התמזגו תחת אותו יזם שישמש לשליטה בניתוח פרוטמית כמותי.
    הערה: חשוב לבנות בקרת TurboID לזיהוי האבובית העומד בפני חלבון היעד. בקרת המיזוג של TurboID צריכה להראות רמת ביטוי דומה לזו של חלבון היעד של TurboID-התמזגו. זה יכול להיות מדעית נקבע על ידי התאמת ריכוז Agrobacterium במהלך אגרוחדירה. בנוסף, חשוב כי חלבון הבקרה יש דפוס לוקליזציה subcellular דומה לזה של חלבון היעד של הריבית.

3. אגרוהסתננות

  1. טרנספורמציה של הפלמידים לאגרובאכטריום
    1. הוסף 0.5 μg של הפלמידים שנוצרו משלבים 2.1 ו 2.2 כדי 50 μL של Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 תאים מוכשרים, הכין כמתואר בעבר16.
      הערה: זנים Agrobacterium אחרים, כגון GV2260, ניתן להשתמש גם.
    2. . מודקון על קרח במשך 30 דקות
    3. הלם חום באמבט מים ב 42 ° c עבור 60 s.
    4. הוסף 400 μL של LB בינונית (10 גרם/L טריטונים, 5 g/L לחלץ שמרים, ו 10 g/L הפקודה; pH = 7.0) כדי Agrobacterium ו הדגירה ב 28 ° צ' עבור 90 דקות.
    5. לוחית את כל התוכן בצינור על LB אגר שיושלם עם אנטיביוטיקה המתאים כדי לבחור את הפלביניים, כמו גם עבור Agrobacterium (עבור GV3101:50 Mg/l gentamicin ו 50 Mg/l גריסופלובין).
    6. לוחות הדגירה ב 28 ° צ' עבור 36 – 48 h עד מושבות הפרט גלויים.
  2. לבחור רצף מושבות מספר בודדים על צלחת מחדש LB אגר עם אנטיביוטיקה (ראה שלב 3.1.5) ולצמוח ב 28 ° c לילה.
    הערה: יותר אופטימלי לבצע את ה-PCR של המושבה כדי לאשר את נוכחותו של המבנה הבינארי הספציפי באגרואכטריום. בניסיון שלנו, מעל 95% של המושבות מכילים את המבנים הבינאריים הציג.
  3. האיחסן 3 מ ל של LB בינונית פלוס המתאים אנטיביוטיקה (ראה שלב 3.1.4) עם מושבת Agrobacterium מחסה את המבנה של עניין, ו דגירה על ידי טלטול לילה ב 28 ° צ' עד OD600 של התרבות agrobacterium מגיע 2.0.
  4. צנטריפוגה את התאים ב 3,000 x g ו להשעות אותם כדי OD600 = 1.0 במאגר אגרוחדירה (10 מ"מ mgcl2, 10 מ"מ MES [PH = 5.6], 250 μm acetosyringone).
    הערה: למרות שהוא אופטימלי כדי לעבור את האינומנט עבור 2 h ב RT לפני אגרוחדירה, בניסיון שלנו עם GV3101 זן, לא היה הבדל גדול בין הביטוי חלבון היעד עם vs. ללא דגירה.
  5. השתמש ב-mL מזרק ללא שימוש 1 כדי לחדור את האינוציות באפידרמיס (האבציר) של N. benthamiana בוגרת לחלוטין.
    הערה: כדי להכין כמות מספקת של חומרי עלה לשלוש משכפל ביולוגי: עלה שלם מסתנן בדרך כלל, שלושה עלים מוחדרו לכל צמח, ושלושה עד ארבעה מפעלים משמשים לכל מבנה. עבור כל עלה, 1.5 – 2.0 מ ל של agrobacteria הושעה מחדש הוא מספיק.
  6. לאחר 36 h לאחר הסתננות (hpi), לחדור 200 μm ביוטין (ב 10 מ"מ mgcl2 פתרון) לתוך העלים חדרו מראש עם מבנים turboid.
  7. שמרו על המפעל לתוספת של 3 – 12 שעות לפני איסוף רקמת העלה כמתואר בסעיף 4.
    הערה: הסיבה לבחירת 36 hpi עבור הסתננות ביוטין היא ביטוי החלבון היעד פסגות בתקופה זו על פי מחקרים קודמים11. מומלץ לקבוע את הזמן הנדרש לביטוי אופטימלי של חלבון היעד של הריבית. זמן הדגירה הפוסט-biotin הסתננות תלוי בעיצוב ניסיוני וחלבון היעד תחת לימוד. בדרך כלל, 3 – 12 h של טיפול ביוטין מאפשר תיוג של רוב החלבונים האבותיים לחלבון היעד על ידי turboid fusions.

4. אוסף דוגמאות עלים

הערה: לעיבוד הבאים של דגימות עלה, ללבוש כפפות סטרילי כדי למנוע זיהום קרטין של דגימות. כל הריאגנטים צריך גם להיות נטול קרטין ככל האפשר.

  1. חותכים את העלים חדרו בבסיס של הפטוטרת, להסיר את הווריד העלה, ואז להקפיא את רקמת העלה בחנקן נוזלי.
  2. לטחון את רקמת העלה באמצעות מכתש ומלט ולאחסן את אבקת העלים בתוך 15 מ"ל או 50 mL בצינורות הבז ב-80 ° c לשימוש הבאים.
    הערה: קחו שלוש עד ארבע פיסות עלים לכל אחד משלושת המשכפלת הביולוגיים מצמחים שונים. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. לפני השלבים הבאים, מומלץ להעריך את ביטוי החלבון ואת biotinylation של חלבון היעד על ידי ניתוחי כתמי חיסוני. בלוטים מערביים טיפוסיים מוצגים באיור 2.

5. הפקת חלבון מוחלט של עלה

  1. העברת כ 0.35 גרם של אבקת עלים לצינור 2 מ ל. הכן שתי שפופרות לכל אחת מהדוגמאות.
    התראה: לחבוש כפפות בעת נגיעה כל אובייקט מקורר על ידי חנקן נוזלי.
  2. הוסף 700 μL של מאגר הליזה ריפה (50 mM טריס-HCl [pH = 7.5], 500 מ"מ היום, 1 מ"מ EDTA, 1% NP40 [v/v], 0.1% SDS [w/v], 0.5% נתרן ביטול המרה [w/v], 1 מ"מ DTT, 1 מחשב לוח של קוקטייל פרוטאז מעכבי) כדי 0.35 g של אבקת עלים.
  3. מערבולת הצינורות עבור 10 דקות.
  4. תשאיר את הדגימות על. הקרח במשך 30 דקות
  5. מערבבים את התוכן כל 4 – 5 דקות על ידי הפיכת הצינורות הפוכים מספר פעמים.

6. הסרת ביוטין חינם על ידי התפלה

הערה: סעיף זה לוקח כ 50 דקות.

  1. באמצעות השפה ההתפלה.
    1. הסר את החותם בתחתית העמודה התפלה והשם את העמודה בשפופרת 50 mL.
    2. הסר את פתרון האחסון על-ידי צנטריפוגה ב-1000 x g ו-4 ° צ' עבור 2 דקות וודא שהמכסה מתיר.
    3. שים את העמודה התפלה בצינור 50 mL. משקל העמודה 3x עם 5 מ ל של מאגר הליזה ריפה, בכל פעם תפרידו ב 1000 x g ו 4 ° צ' עבור 2 דקות ו מחיקת flowthrough.
    4. העבר את עמודת ההתפלה לתוך צינור 50 mL חדש ואחסן זמנית ב-4 ° צ' לשימוש הבא.
  2. לסובב את הצינורות משלב 5.4 בשעה 16,500 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות ולהעביר את supernatant משתי הצינורות לתוך צינור חדש 2 mL.
  3. הוסף 1,500 μL של תמצית חלבון לחלק העליון של שרף של עמודת התפלה מעורפלת (משלב 6.1.4). כאשר תמצית חלבון נכנס שרף, להוסיף עוד 100 μL של מאגר הליזה ריפה.
    הערה: למרות ש-1,400 μL של מאגר הליזה ריפה שימש להפקת חלבון מן העלים, אמצעי האחסון הכולל לאחר הפקת החלבון והתפלה הוגדלה תמיד במידה מסוימת יחסית לאמצעי האחסון המקורי. לכן, שילוב של דגימות מכל קבוצה כמתואר בשלבים 5.1 ו 5.4 יכול לגרום לפחות 1,500 μL של תמצית חלבון לכל מדגם.
  4. צנטריפוגה ב 1000 x g ו 4 ° צ' עבור 2 דקות ולהשאיר את הדגימות התפלה על הקרח זמנית.

7. קוונפיקציה של תמציות חלבון התפלה באמצעות שיטת ברדפורד

  1. הכינו 50 μL של כל פתרון BSA מעבר צבע: 0 מ"ג/mL, 0.2 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.8 mg/mL ו-1 מ"ג/mL.
  2. לדלל את תמצית חלבון התפלה ידי ערבוב 5 μL לדוגמה עם 45 μL של ddH2O.
  3. הכינו 1x ברדפורד עוצרת ידי דילול ברדפורד 5x העוצר (100 מ ג של Coomassie כחול מבריק G250, 47 mL של מתנול, 100 mL של 85% חומצה זרחתית, 53 mL של ddH2O).
  4. הוסף 50 μL של כל פתרון BSA מעבר צבע ו 50 μL של תמצית חלבון מדולל ל 2.5 mL של ברדפורד 1x העוצר.
  5. דגירה ב RT עבור 10 דקות.
  6. הוסף 200 μL של הפתרון של כל מדגם לאחת היטב של צלחת אליסה (שלוש משכפל טכני לכל מדגם).
  7. למדוד את OD595 באמצעות קורא מיקרופלייט.
  8. ציירו את העקומה הסטנדרטית בהתאם לערך של פתרון BSA במעבר הצבע וחשב את הריכוז של דגימות החלבון המהתפלה. בדרך כלל, ריכוז החלבון הכולל שהושג מ 0.7 גרם של העלים נע בין 3 – 6 מ"ג/mL.
  9. הכינו 6 – 8 מ ג של תמצית חלבון התפלה לטיהור האהדה הבאים.

8. העשרת חלבונים ביולוגיים

  1. קח 200 μL של חרוזים מגנטיים streptavidn-C1 מעלה לתוך שפופרת 2 מ ל.
  2. השפה streptavidn-C1-מעלה מעלה מעלה חרוזים מגנטיים עם 1 מ ל של מאגר הליזה ריפה עבור 1 דקות ב RT.
  3. לאחר כל כביסה, השתמשו במתלה המגנטי כדי להסיר את החרוזים במשך 3 דקות והסירו בעדינות את הפתרון באמצעות ליטוף.
  4. חזור על שלבים 8.2 ו-8.3.
  5. העבר את תמצית החלבון התפלה לחרוזים מגנטיים streptavidn-C1 מצובטים.
  6. מודקת את הצינורית ב-4 ° צ' בשביל 12 מעלות (או לילה) על מסובבי לאהדה-לטהר את החלבונים הביוטיתיים.
  7. לכוד את החרוזים על מתלה מגנטי עבור 4 דקות ב RT עד החרוזים לאסוף בצד אחד של הצינור, ואז להסיר בעדינות את supernatant על ידי פיפטה.
  8. הוסף 1.7 mL של מאגר לשטוף I (2% SDS במים) לצינור ולשמור אותו על המסובבי ב RT עבור 8 דקות. חזור על שלב 8.3.
  9. הוסף 1.7 mL של מאגר לשטוף II (50 מ"מ HEPES: pH = 7.5, 500 mM הנאל, 1 מ"מ EDTA, 0.1% deoxycholic חומצה [w/v], 1% טריטון X-100) לצינור ולשמור אותו על המסובבי ב RT עבור 8 דקות. חזור על שלב 8.3.
  10. הוסף 1.7 mL של מאגר לשטוף III (10 מ"מ טריס-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 מ"מ EDTA, 0.1% deoxycholic חומצה [w/v], 1% NP40 [v/v]) לצינור ולשמור אותו על המסובבי ב RT עבור 8 דקות. חזור על השלב 8.3.
  11. הוסף 1.7 mL של 50 mM טריס-HCl (pH = 7.5) כדי להסיר את אבקת הניקוי, ואז לחזור על שלב 8.3.
  12. להעביר את החרוזים לצינור חדש 1.5 mL, ולחזור על שלבים 8.11 ו 8.3.
  13. לשטוף את החרוזים 6x עבור 5 דקות כל אחד עם 50 mM אמוניום ביקרבונט מאגר ב RT.
  14. הוסף 1 mL של 50 mM אמוניום ביקרבונט מאגר החרוזים מגנטי מערבבים היטב.
  15. הסר 100 μL של חרוזים לניתוח כתמי החיסוני כדי לאשר את העשרת החלבונים הביוטילביים. באיור 3מוצגת אבן חשופה מערבית טיפוסית.
  16. הקפא את שאר דגימות החלבון ואחסן ב-80 ° c או שלח אותם מיד עבור ניתוח LC-MS/MS על קרח יבש.
    הערה: תוצאות MS טיפוסיות מוצגות בפרסום קודם (Zhang ואח '. 2019; איור 2, נתונים משלימים 1 ונתונים משלימים 2)11. ערכות הנתונים כולה זמינות ב-MassIVE (שנמצאה ב< http://massive.ucsd.edu >) באמצעות המזהה: MSV000083018 ו-MSV000083019.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתוני המייצג, הממחישים את התוצאות הצפויות בהתבסס על הפרוטוקול המתואר, מותאמים מ-Zhang ואח '11. איור 1 מסכם את ההליכים לביצוע מסמך מבוסס turboid ב- N. benthamiana. איור 2 מראה את ביטוי החלבון ואת הביוטלציה בתוך החדר. איור 3 מראה כי החלבונים הביוטיביים בעלי החדר החדרו מועשרים ביעילות לניתוח הספקטרומטר ההמוני העוקב. יש לציין, כי לאחר העשרת החלבונים הביוטילביים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidn...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר הביוטין של ה-turboid ליגאז נוצר על-ידי האבולוציה המבוססת על תצוגה מבוססת על-ידי שמרים של ה-bioid10. יש לו יתרונות רבים על פני אנזימים PL אחרים. TurboID מאפשר יישום של PL למערכות מודל אחרות, כולל זבובים ותולעים, שטמפרטורת הצמיחה האופטימלית שלהם היא כ -25 ° c10. למרות הגישה PL כבר בשימוש נרחב במערכות בעלי חיים, היישום שלה בצמחים הוא מוגבל. הפרוטוקול המתואר כאן מספק הליך צעד-אחר-צעד להקמת המידע המבוסס על TurboID ב- N. benthamiana, צמח מודל שנעשה בו שימוש נרחב במח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים הלאומית המדע הטרנסגניים תוכנית טכנולוגיה (2019ZX08010-003 ל Y.Z.), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31872637 לY.Z.), ואת קרנות המחקר הבסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (2019ZX08010 ל Y.Z.), ו-NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, ו

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
721 ספקטרופוטומטרמטאש, תוצרת סיןQ/SXFZ6למדידת OD600
אמוניום ביקרבונטסיגמאA6141-500G
ביוטיןסיגמאB4639-1G50 מ"מ
צנטריפוגהאפנדורף5702
צנטריפוגהאפנדורףצנטריפוגה 5417R
cOmplete מעכב פרוטאז קוקטיילרוש11697489001
חומצה דאוקסיקוליתסיגמאD2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001לטיהור זיקה
EDTASigmaE6758-500G
ELISA plateCorning Costar3590
HEPESSigmaH3375-1KG
חומצה הידרוכלורית (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF ממברנהMilliporeIPVH00010לניתוח כתמים מערביים
תמיסת ליתיום כלוריד (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
בקירור במהירות נמוכה צנטריפוגהזונקיה, תוצרת סיןKDC-2046להתפלת
מגנזיום כלוריד, הקסהידרט (MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
מתלה מגנטיInvitrogen123.21Dלספיחת חרוזים
Multiskan FC מיקרופלייט פוטומטרתרמו פישר מדעיN07710למדידת OD595
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
חולדה אנטי-HARoche11867423001
מערבל סיבוביKylin-Bell Lab InstrumentWH-986עבור
חממת הלםLabotery, תוצרת סיןZQPZ-228
נתרן כלורי (NaCl)פישר סיינטיפיקS271-3
נתרן דאוקסיכולאטסיגמאD2510-100G
נתרן דודציל סולפט (SDS)SigmaL4390-1KG
Streptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
בסיס TrizmaSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
חממת מעיל מים חממהכחולה, תוצרת סיןGHP-9080לדגירה
AgrobacteriumZeba Spin Desalting ColumnThermo Fisher Scientific89893להסרת ביוטין
מלאי צנטריפוגה IP

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212(2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326(2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252(2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864(2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468(2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TurboIDNLRNicotiana benthamianaWestern Blot

מאמרים קשורים