מאמר שיטה

הפגנת קשר ליניארי בין גורם גידול של כלי דם אנדותל והורמון מחלגיזציה בתמציות קליפת הכליה

DOI:

10.3791/60785

⸱

22 בינואר 2020

 ,  , 
1Zietchick Research Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הוא פרוטוקול לניצול הכנה לתמצית כליה קליפת הכליה ונורמליזציה חלבון מוחלט כדי להדגים את הקורלציה בין גורם הצמיחה של כלי הדם והורמון החלמיזציה בכליות היונקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גורם הגדילה של כלי הדם (מסייע) לשלוט באנגיוגנזה ובחדירות כלי הדם בכליה. הפרעות כליות, כגון כלייתית סוכרתית, משויכות לדיסתקנה של הכליות. הגורמים השולטים ב-, בתנאים הפיזיולוגיים בכליות, אינם מובנים היטב. הורמון מחלפף (LH), הורמון פרו-אנגיוגנטי, מסייע לווסת את הביטוי הפיזיולוגי באברי הרבייה. בהינתן כי קולטני LH נמצאים בכליה, אנחנו, במכון מחקר זיגצ'יק, שיערו כאן כי LH גם מסייע לווסת את הביטוי בכליה כמו גם. כדי לספק ראיות, כיוונו להראות כי רמות LH מסוגלים לנבא רמות של היונקים בכליה. רוב החקירות הקשורות לנושא הכרוך בכליות השתמשו ביונקים בעלי סדר נמוך יותר כמודלים (כלומר, מכרסמים וארנבים). כדי לתרגם את העבודה הזאת לגוף האנושי, הוחלט לבחון את הקשר בין המערכת הבין הגדולה לבין ה-LH לבין יונקים בעלי סדר גבוה יותר (קרי, מודלים של שור ופורצין). פרוטוקול זה משתמש בחלבון מוחלט. מקליפת הכליה המפתחות להצלחת שיטה זו כוללים רכש של כליות מחיות מטבחיים מיד לאחר המוות, כמו גם נורמליזציה של רמות אנליטה (בתמצית הכליה) על ידי חלבון מוחלט. מחקר זה ממחיש בהצלחה קשר ליניארי משמעותי בין LH ו-ובהן כליות השור ו חזירי. התוצאות מתוכונות. בשני זנים שונים המחקר מספק הוכחות תומכות כי השימוש בתמציות כליות מפרות וחזירים הם משאב מעולה, חסכוני, ושופע לחקר הפיזיולוגיה של הכליות, במיוחד עבור בחינת הקורלציה בין מנתחי ה-, והאנליטים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גורם הצמיחה של כלי הדם a ("וכדומה"), מסייע לווסת אנגיוגנזה וחדירות כלי הדם בכליות ובאיברים אחרים1,2 (להלן, המכונה "הנקרא" מכונה "כולי"). רמות הטיפול בכליה הן תחת שליטה הומאטית. כאשר רמות הכליות מוגברות או מדוכאים, הכליה עלולה להיות תקלה. לדוגמה, בתוך 3 שבועות לאחר הלידה, עכברים עם הטרוזיזטיות מיוחדות לפיתוח של ה-"ולפתח" אנדוקיזיס וכלי-דם (כלומר, נגעים כליות הנתפסים באקלמפסיה האנושית), וכישלון כליות בשלב הסופי מתרחש בהטרוזיטים אלה בגיל 3 חודשים. Podocyte הומוזיטים מסוימים מתים מפני הידרופס ואי ספיקת כליות בתוך יום אחד של לידה3,4.

מצד שני, ביטוי יתר של כליות הכליות גורם פרוטאינוריה ו-היפרפרפיה של הכליה3,4. לדוגמה, ארנבים טרנסגניים המבטאים את התצוגה המתקדמת של התערוכה מתקדמת באמצעות שיעורי סינון מוגברים בשלבים המוקדמים של נפרופתיה, ואחריו שיעורי סינון מופחת בשלבים מאוחרים יותר3. סוכרת כליירופאתי, הגורם העיקרי של מחלת הכליה בשלב הסופי אצל מבוגרים סוכרתית, הוא מקושר באופן משמעותי עם התקנה ברמה2,5. הרבה תשומת לב שולמו לתפקיד של היפוקסיה בגרימת ביטוי ה-, בתנאים פתולוגיים5. עם זאת, הגורמים השולטים במצב הפיזיולוגי (הן בכליה והן באיברים אחרים) אינם מובנים היטב2,6. זיהוי גורמים אלה (למעט חמצן) המעורבים ברגולציה הפיזיולוגית והפתולוגית היא משימה חשובה.

הורמון מחלפף (LH), הורמון פרו-אנגיוגנטי, מסייע לווסת את הביטוי הפיזיולוגי באברי הרבייה כגון השחלה והטנות7,8. מחקרים קודמים סיפקו ראיות כי LH גם עוזר לווסת את הגוף באיברים שאינם רבייה, כגון העיניים6,9,10. קולטנים LH מצויים לשד הקליפה של הכליה11,12. של הערה, כליה תאים אפיתל הכרישים, כמו גם את הקולטן LH, אקספרס וואפ11,12,13,14. לוקחים את שני התצפיות האלה יחד, אנו שיערו כי LH גם עוזר לווסת את הביטוי והוא בכליה13,14. כדי לספק ראיות של הקשר LH/מערכת זו, הפרוטוקול המוצג שואפת להראות כי רמות LH מסוגלים לנבא רמות של הכליה. מספר רב של חקירות קודמות הקשורות בכליות השתמשו במודלים היונקים הנמוכים ביותר (כלומר, מכרסמים וארנבים)2. כדי לתרגם את העבודה הזאת לגוף האנושי, המחקר בוחן את היחסים בין ומעלה LH ביותר יונקים בסדר גבוה (כאן, שור מודלים חזירי). כדי לבצע מטרה זו, חלבון מוחלט ליפוסט היה מוכן באזור קליפת המוח של שור וכליות חזירי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה לא נעשה שימוש בחיות או ניסויים.

1. טיפול ברקמה

  1. להשיג כליות של שור ופורצין את כל הכליות מיד לאחר שטבח מתוך מטבחיים. . הובלה על קרח למעבדה
  2. עם הגעתם למעבדה, לשטוף כליות עם 50 מ ל של מלוחים קר הקרח-פוספט מואגור (PBS). חזור על שלב זה 2x כדי להסיר דם לחלוטין.
  3. לשמור על הכליות על קרח (או בקירור) עד חילוץ נוסף.

2. חיתוך הכליות

  1. השתמשו במספריים סטריליים, מלקחיים, סכין ומנות פטרי כדי לנתח את הכליות ולבלו את החלק הנדרש ברקמה.
  2. הכן מאגר לפירוק של ריפה לפני ניתוח בכליות. התמוססות 5 מ"מ, 0.5 M EDTA, 1 טריס M (pH = 8.0), NP-40 (מזהה + GEPAL CA-630), 10% נתרן deoxycholate, ו 10% SDS במים כפולים מזוקקים, ואז לערבב ביסודיות. להכניס למקרר את מאגר הליזה של ריפה כאשר לא בשימוש.
  3. בעדינות לחתוך את הכליה לחצי (משונן מישור) וחותכים פיסת רקמה (50-70 מ"מ2) מאזור הקליפה במרכז הכליה (שקילה 80-100 mg על ידי משקל רטוב).
  4. מטפחת את בלוק הרקמה לחתיכות קטנות בסכין כדי לסייע לתהליך המגון.
  5. לאחר להפוך את הרקמות, להעביר אותם צינור microfuge עם 1 מ ל של מאגר החילוץ הקרח קר 1x ריפה. הניחו את הצינורות בקרח עד לחילוץ נוסף.

3. רקמת הומוגון

  1. סמן את הצינורות הmicrofuge עם פרטים ספציפיים לדוגמה עבור אוסף הרקמה הסופרנטית.
  2. שימוש במכשיר כף יד עם בדיקה סטרילית, ולאחר מכן המגון את הרקמות עבור 1-2 דקות בתנאים קרים (דגימות על דלי קרח) עד שאין גושים של רקמות גלויים.
  3. נושא הרקמה תמציות מיד עבור צנטריפוגה ב צנטריפוגה בקירור ב 9,600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  4. להסיר את הצינורות מהצנטריפוגה ולמקם אותם על דלי קרח.
  5. לאסוף את supernatant לתוך microfuge צינור חדש בתווית ולאחסן על הקרח. . להשליך את הגלולה
  6. הכינו מחזורי הפרדה נפרדים של סופרנטנים עבור LH ו-ובדיקות מקושרות-אנזים הקשורות לאנזימים (אליסה) וניתוח חלבון מוחלט, בהתאמה, כדי למנוע הקפאת ההפשרה.

4. שור ו Porcine LH השיטת אליסה

  1. אחסן את כל רכיבי שיטת ה-אליסה כלולים במערכת הורמון החלבית הזמינה מסחרית (LH) (ראה טבלת חומרים) ב-2-8 ° c. זה כולל את הנוגדן, HRP-המשלים, שיטת הפעולה (96 היטב), ככייל, מאגר לשטוף (20x להתרכז), מצע A, מצע B, ולעצור פתרון. הכן את כל הריאגנטים כפי שמומלץ על ידי הוראות היצרן.
  2. לפני תחילת השיטת, הביאו את כל הריאגנטים ואת הצלחת לטמפרטורת החדר (RT). השתמש במספר הדרוש של בארות לצורך השימוש באותו מספר, חותם ושמור על הבארות שאינן בשימוש ב-4 ° צ' עד לשימוש.
  3. דלל את מאגר הכביסה (15 מ ל של 20x להתרכז) עד 300 mL עם מים כפולים מזוקקים
  4. הגדר את הבארות הריקות ללא כל פתרון.
  5. הוסף 50 μL של תקן או מדגם לכל טוב (n = 2), ולאחר מכן להוסיף עוד 50 μL של חזרת peroxidase (hrp)-המשלים לכל טוב. מיד להוסיף עוד 50 μL של פתרון נוגדן לכל טוב. לאטום את הצלחת, לערבב היטב, ו הדגירה 1 h ב 37 ° c.
  6. לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (200 μL/טוב) ולחזור 4x.
  7. הוסף 50 μL של מצע A ו-50 μL של מצע B לכל באר, ומערבבים היטב על ידי הקשה על הצלחת בצד בעדינות. אטום את הצלחת ואת הדגירה של 15 דקות ב 37 ° c בחושך במשך 15 דקות.
  8. הוסף 50 μL של פתרון להפסיק כל טוב, להקיש בעדינות על הצלחת, ולקרוא את הצלחת באמצעות הספקטרוסקופיה להגדיר 450 אורך גל ננומטר.
  9. לנרמל את השור ו חזירי רמות לחלבון מוחלט (ראה סעיף 6).

5. שור ופורצין-שיטת אליסה

  1. אחסן את כל רכיבי הזמינות של אליסה הכלולים במקדם הגדילה המסחרי והזמין של כלי הדם (ראה לוח חומרים) ב-2-8 ° c. זה כולל את הנוגדן, HRP-המשלים, שיטת הפעולה (96 היטב), ככייל, מאגר לשטוף (20x להתרכז), מצע A, מצע B, ולעצור פתרון. הכן את כל הריאגנטים כפי שמומלץ על ידי הוראות היצרן.
  2. לפני שמתחילים את האפשרות, להביא את כל הריאגנטים ואת הצלחת לשאת את לוחית. השתמש במספר הדרוש של בארות לצורך הצורך, לחתום ולשמור על הבארות שאינן בשימוש ב-4 ° צ' עד לשימוש.
  3. דלל את מאגר הכביסה (15 מ ל של 20x להתרכז) עד 300 mL עם מים כפולים מזוקקים
  4. הוסף 100 μL של התקן או מדגם לכל טוב (n = 2). לאטום את הצלחת, לערבב היטב, ו דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
  5. להסיר את הנוזל בכל באר ולהוסיף 100 μL של זיהוי מגיב A לכל טוב, לאטום את הצלחת, ו הדגירה עבור 1 h ב 37 ° c.
  6. לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (400 μL/טוב) ולחזור 4x.
  7. הוסף 100 μL של זיהוי מגיב B לכל טוב ומערבבים היטב על ידי הקשה על הצלחת בצד בעדינות. אטום את הצלחת והטה את הצלחת 1 h ב 37 ° c.
  8. לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (400 μL/טוב) ולחזור 4x.
  9. הוסף 90 μL של פתרון המצע לכל טוב, הקש בעדינות על הצלחת, ו-דגירה עבור 1 h ב 37 ° c.
  10. הוסף 50 μL של פתרון להפסיק כל טוב, להקיש בעדינות על הצלחת, ולקרוא את הצלחת באמצעות הספקטרוסקופיה להגדיר 450 אורך גל ננומטר.
  11. לנרמל את השור ואת מפלס הפרוטאין-A רמות לחלבון מוחלט (סעיף 6).

6. שערוך חלבון סה

  1. הערכת חלבון מוחלט של השור ואת תמציות כליות חזירי על ידי תקן באמצעות סרום שור סטנדרטי (bsa) באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) על פי המלצות היצרן.

7. אנליזה סטטיסטית

  1. לחשב את הממוצע, חציון, ואת סטיית התקן של כל האנליטה.
  2. בדוק את הסטייה של התפלגות המדגם מהרגיל ניצול קולמוגורוב-סמירנוף מבחן להחליט, על פי השימוש, בין פרמטרית לעומת. בדיקות סטטיסטיות לא פרמטרית. אם הנתונים מופצים בדרך כלל, לאחר מכן לבצע בדיקה סטטיסטית באמצעות בדיקות פרמטרית.
  3. בנסיבות מתאימות (כגון התפלגות נתונים נורמלית), לנצל מודלים רגרסיה כדי לבחון את הקשר הליניארי בין LH ו-והוא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות ממוצע וחציון של LH ו-ומסוג בעלי חיים מופיעים על ידי סקס מוצגים בטבלה 1. לאחר אימות נורמליות של נתונים על ידי Kolmogorov-סמירנוף בדיקות של נורמליות, מודלים רגרסיה לינארית היו מנוצלים כדי לבחון את הקשר בין LH ו-מודל. LH נמצאה להיות מנבא חזק ומשמעותי של ובהן הכליות שור ו חזירי (מודל כליות של שור: n = 7, R2 = 0.86, p = 0.002; חזירי מודל הכליה: n = 7; R2 = 0.66, p = 0.025).

הקשר הליניארי LH...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לרכישת כליות מהמטבחיים מיד לאחר מוות בעלי חיים הוא המפתח להצלחה במתודולוגיה זו. זהו היתרון העיקרי של ניצול איברים מפרות וחזירים במקום גופות אדם. בדרך כלל יש לפחות עיכוב של 12-24 h מזמן המוות עד שאיברי הגוף האנושיים מושגו. בגלל ההרכב הכימי של איברי הגוף משתנה באופן משמעותי בתוך 2 h לאחר המוות15,16, מחקרים בכליות האדם האנושי לא יכול לשקף את הנסיבות בחיים האמיתיים. למרות שהפרוטוקול מדגיש במידה ניכרת את חשיבות הרכישה המיידית והמיקום של איברי בעלי חיים על הקרח לאחר הח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכון מחקר זיגצ'יק (ZRI) הוא מכון מחקר פרטי (למטרות רווח), וד ר תמי מובסאס (מייסד ומנהל ZRI) יש בקשות לפטנטים ופטנטים מאומתים לשימוש באנטטרופין היריבים בטיפול במחלות עינית וסוכרת. מלבד להיות עובד (ביוכימאי) ב ZRI, ד ר א. מותוסר אין קונפליקטים פיננסיים אחרים לדווח. א. אריבלאגן (מתמחה בקיץ ב ZRI, סטודנט לתואר ראשון באוניברסיטת מישיגן) אין קונפליקטים פיננסיים אחרים לדווח.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לקבוצת המטבחיים (Blissfield, MI) לאספקת הכליות של השור והכיצין. לא היה צורך במימון מענק למחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בקר LH ELISAMyBiosource, סן דייגו, קליפורניה.
Bovine VEGF-A ELISA KITMyBiosource, סן דייגו, קליפורניה.
ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCAThermoFisher Scientific Inc, קולומבוס, אוהיו.23235
ערכת חזיר LH ELISAMyBiosource, סן דייגו, קליפורניה.
חזיר VEGF-A אליסהריי ביוטק, נורקרוס, ג'ורג'יה.ELP-VEGFA-1
RIPA מאגר ליזה ומיצויThermoFisher Scientific Inc, קולומבוס, אוהיו.89901
MBS700951 MBS2887434 MBS009739

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
  2. Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
  3. Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
  4. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  5. Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
  6. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
  7. Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
  8. Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).
  9. Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
  10. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
  11. Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
  12. Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
  13. Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
  14. Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
  15. Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
  16. Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
  17. Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
  18. Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
  19. Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
  20. Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
  21. Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978(2012).
  22. Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ELISA

מאמרים קשורים