מאמר שיטה

תיקון דיוק גבוה של שינויים כרומטית תלת-ממדיים בגיל הדמיה ביולוגית סופר ברזולוציה באמצעות כרומעגנון

DOI:

10.3791/60800

⸱

16 ביוני 2020

 ,  ,  ,  , 
1Advanced ICT Research Institute Kobe, National Institute of Information and Communications Technology, 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3Micron Advanced Bioimaging Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיקון של שינויים כרומטית בתלת מימדי (3D) תמונות מיקרוסקופית קרינה פלואורסצנטית חיוני עבור ניתוח נתונים כמותיים. פרוטוקול זה פותח כדי למדוד ולתקן שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות באמצעות רכישת תמונות התייחסות מתאים ועיבוד עם תוכנת קוד פתוח, כרומעגנון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ קרינה מרובת צבעים כמותיים מסתמך על התאמה מרחבית זהירה של ערוצי צבע הנרכשים באורכי גל שונים. בשל סטייה כרומטית ויישור לא מושלם של מצלמות, תמונות שנרכשו בכל ערוץ יכול להיות הוזז, מוגדל, כמו גם מסובב ביחס זה לזה בכל אחד מתוך שלושת הממדים. עם שיטת כיול קלאסית, שינויים כרומטית נמדדים על ידי חרוזים ססגוניות מוצמד למשטח של שמיכות, ומספר תוכנות זמינים כדי למדוד את המשמרות כרומטית מדגימות כיול כגון. עם זאת, סטייה כרומטית יכולה להשתנות עם עומק, לשנות עם תנאי תצפית ולהיגרם על ידי המדגם הביולוגי עצמו, ובכך לקבוע את ההגדרה של כמות אמיתית של משמרת כרומטית במדגם של עניין ומעבר לנפח. תיקון משמרות כרומטית בדיוק גבוה רלוונטי במיוחד עבור מיקרוסקופ סופר ברזולוציה שבו רק שינויים כרומטית קלים יכול להשפיע על ניתוחים כמותיים ולשנות את הפרשנות של תמונות צבעוניות. פיתחנו תוכנת קוד פתוח כרומעגנון וליווי שיטות למדוד ולתקן משמרות כרומטית תלת-ממדית בדגימות ביולוגיות. כאן אנו מספקים פרוטוקול יישום מפורט הכולל דרישות מיוחדות עבור הכנה לדוגמה, רכישת נתונים, ועיבוד תוכנה כדי למדוד שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות של עניין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה מרובת צבעים היא אחד ההיבטים הבסיסיים של מיקרוסקופ פלואורסצנטית ביולוגי, במקרים שבהם הקשר המרחבי של מולקולות או מבנים שונים הוא עניין רציני. סטייה כרומטית, סטייה אופטית של אור צבעוני הנגרמת על ידי פיזור, משנה את המיקום לכאורה של אובייקטים צבעוניים של עניין. באופן דומה, מיקרוסקופים מצויד מצלמות מרובות המוקדש לרכישת כל צבע יש משמרות כרומטית מורכבות יותר עקב הבדלים אלמנטים אופטיים יישור לא מושלם בין הערוצים. כך, שינויים כרומטית כאלה עלול להוביל למסקנה כוזבת אלא אם תוקנה במפורש על ידי המשתמש. למרות משמרות כרומטית לא היה בעיה גדולה כל עוד הרזולוציה של מיקרוסקופ מוגבל על ידי מגבלת הרזולוציה הקלאסית, הפיתוח האחרון של מיקרוסקופ סופר ברזולוציה1 התבקש את הצורך תיקון מדויק יותר של משמרות כרומטית.

זה היה מנהג נפוץ למדוד שינויים כרומטית של מערכות מיקרוסקופ באמצעות כיול מרובת צבעים מחליק שקופית2. מבוסס חרוז שיטת כיול מתאים למדידת משמרות כרומטית מן האופטיקה כולו של המיקרוסקופ לכיוון פני השטח של coverslip2. עם זאת, שיטה זו אינה יכולה למדוד משמרות כרומטית בדגימות העניין הביולוגי. חשוב לציין כי דגימות ביולוגיות רבות הן תלת ממדיות (3D), ואת השינויים כרומטית של דגימות כאלה שונים מאלה על פני השטח של הcoverslip. יתר על כן, שינויים כרומטית2שינוי עם תנאיהדמיה 2,3. יש לנו למדוד את המשמרות כרומטית בדגימות ביולוגיות 3D ומצא כי חוסר ודאות של שינויים כרומטית היה לעתים קרובות כמו 350 ננומטר על ידי השיטה הקלאסית multicolor-חרוז כיול3. לכן, יש למדוד שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות בעומק העניין ומתחת לתנאי הדימות שבשימוש.

כאן, אנו מתארים הליכים למדוד שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות לתקן את המשמרות האלה באמצעות התוכנה שלנו, כרומעגנון3. כדי למדוד שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות, השיטה שלנו משתמשת בשני סוגים של ערכות נתונים, תמונת "יעד" ותמונה "הפניה". התמונה "המטרה" היא תמונה מרובת צבעים של עניין, למשל, תמונות מוכתם DNA, מעטפת גרעינית, ו microtubules. לעתים קרובות אי אפשר למדוד שינויים כרומטית בתמונה כזו. לכן, אנחנו צריכים תמונה "התייחסות" כי הוא מוקדש למדוד את המשמרות כרומטית במדגם. ההגדרה היחידה של תמונת "הפניה" היא תמונה מרובת צבעים של אותו אובייקט. במובן זה, תמונת חרוזים עם ריבוי צבעים היא גם סוג של תמונת ייחוס. כאן, אנו מתארים שלושה סוגים שונים של תמונת ייחוס המשמשים למדידת שינויים כרומטית בדגימות הביולוגי: "תמונות התייחסות מוצלב", "תמונות התייחסות לשדה בהיר" ו "כיול ביולוגי תמונות התייחסות". סוג תמונת הייחוס תלוי בסוג המיקרוסקופ הנמצא בשימוש או שדיוק התיקון הדרוש כמסוכם בטבלה 1.

Crosstalkשדה בהירכיול ביולוגי (בשקופית אחרת)כיול ביולוגי (באותה שקופית)
דיוקa +++++ +b +++
פשטות+++++++++
מיקרוסקופ ישיםשדה רחבשדה רחבכלכל
זמינות של יישור מקומי++-c -c
a: מספר "+" מציין דירוג הולך וגובר. יחיד פלוס הוא כ 50 ננומטר ושלושה פלוס הוא כ 15 ננומטר ב 3D.
b: הדיוק תלוי בכמות תנאי הדימות המשתנים שנשמרו באופן קבוע.
ג: כיול מקומי הנמדד על ידי דגימות חרוזים מרובת צבעים ניתן לשלב כמתואר בפרוטוקול סעיף 4.

טבלה 1: פרמטרים בעת בחירת סוג תמונות הייחוס.

"תמונות התייחסות מוצלב" הן בדיוק התיקון הגבוה ביותר והן פשוטות יחסית לביצוע3,4 (טבלה 1). החיסרון הוא המגבלה שלהם ביישומים מיקרוסקופית עקב חוסר יכולתו של מדידת שינויים כרומטית בנתיבי עירור. כמו כן, כדי להשיג תמונות כאלה, המיקרוסקופ צריך להיות מצויד עם מראות דיקרואיק multiband, ומסנני פליטה כי הם בשליטה עצמאית ממסנני עירור או מקורות אור. מיקרוסקופ מתאים כולל מיקרוסקופ רגיל בתחום הרחב, מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת (smlm) כגון צילום המופעל לוקליזציה מיקרוסקופ/סטוכסטי שחזור אופטי (פאלם/סטורם)5,6 ו מיקרוסקופ הרחבה7 נצפתה עם מיקרוסקופ שטח רחב. תמונת הפניה מוצלב נרכשת מדגימת היעד עצמה. זוהי תמונה של מוצלב (בליד) הפלואורסצנטית של צבע שהושג בכל הערוצים הדרושים. פליטת פלואורסצנטית תמיד מתרחב לעבר אורכי גל ארוכים יותר, ולכן הצבעים עם אורך הגל הקצר ביותר הם נרגשים להשיג פלואורסצנטית הוצלב בערוצים של אורכי גל ארוכים יותר. לדוגמה, כאשר המדגם מוכתם בכחול, ירוק ואדום, רק הצבע הכחול מתרגש, ואור הפליטה מתקבל בערוצים הכחולים, הירוקים והאדומים. בפרוטוקול זה, דנ א ויטראז עם 4 ′, 6-diamidino-2-פניילינדול (DAPI) שימש לקבלת פלואורסצנטית הוצלב.

"תמונות התייחסות בשדה בהיר" הם חלופה קלה יותר ופחות פוטוטוקסיל "תמונות התייחסות הצלבות" אבל הם הפחות מדויקים3 (טבלה 1). אלה הם תמונות שדה בהיר של דגימת היעד, שנרכשו בכל ערוצי הצבע המשמשים בתמונת היעד.

"כיול ביולוגי תמונות התייחסות" יש את היתרון של להיות רלוונטי לכל סוג של מיקרוסקופ בשל יכולתם למדוד את המשמרות כרומטית הן בנתיבי עירור ופליטה3,8 (טבלה 1). מיקרוסקופ מתאים כולל המיקרוסקופיה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופ גיליונות אור, המחסור בפליטה מאולצת (היסטד)9, מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM)10, airyscan/סורא11,12, smlm התבונן במצב הכולל של השתקפות פנימית מלאה (tirf),רזולוציה של האולימפוס (osr) תמונה של כיול ביולוגי נרכשה מדוגמת כיול שהוכנה באופן דומה כדוגמת היעד, אך עם כתמים של מבנה אחד עם צבעים מרובים. דיוק התיקון מצטיין ברזולוציה של רוב מיקרוסקופ סופר ברזולוציה והכנת דגימת כיול ביולוגית יכולה להיות פשוטה יחסית. יתרון נוסף הוא הזמינות של "ממוצע" תמונות התייחסות מרובות. לכן, למרות שהתמונות הבודדות מכילות מידע מסכן למדידת משמרות כרומטית, ניתן להגדיל את תוכן המידע באמצעות חישוב ממוצע של תמונות מרובות. הדיוק תלוי בכמה תנאי הדימות נשמרים קבועים. בהקשר זה, הביצועים הטובים ביותר מתקבלים כאשר דגימות היעד וההתייחסות הן על אותה שקופית, שימוש, למשל, 8-היטב שמיכותשולחן (טבלה 1, מימין לרוב). בפרוטוקול זה, אקטין ויטראז ' עם שלושה צבעים של phalloidin שימש כיול ביולוגי.

לאחר השגת תמונת ייחוס, אזי התזוזה הכרומטית נמדדת ותוקנה על-ידי התוכנה כרומעגנון. אין הגבלה על מספר הערוצים, Z סעיפים ומסגרות זמן כי Chromagnon יכול למדוד ולתקן את המשמרות כרומטית. כרומעגנון מודד משמרות כרומטית בשני צעדים. הצעד הראשון משיג את הפרמטרים "הגלובליים" או "affine" של התרגום בצירי X, Y, Z, הגדלה לאורך ציר X, Y, Z וסיבוב מסביב לצירי Z. דיוק החישוב של היישור הגלובלי הוא ~ 16 ננומטר ב 3D ו ~ 8 ננומטר ב 2D. השלב השני הוא ' יישור מקומי ' איטרטיבי דו-ממדי אופציונלי בתמונות מתוכננות כדי להשיג דיוק גבוה יותר. בתהליך היישור המקומי, התמונות מחולקת לאזורים מרובים ושינויים כרומטית באזורים מקומיים אלה נמדדים. לאחר מכן, האזורים מחולקים ושינויים כרומטית באזורי המשנה נמדדים בצורה מינימלית עד שמספר הפיקסלים באזור יגיע למספר המינימלי של הפיקסלים (בדרך כלל 60 x 60 פיקסלים). מפת היישור המקומית שתיווצר משולבת עם פרמטר היישור הכללי ומוחלת על תמונת היעד באמצעות טרנספורמציה גמישה. בעקבות שלב זה, דיוק החישוב משופר ל ~ 14 ננומטר ב 3D ו ~ 6 nm ב-2D. היישור המקומי אינו מתאים לתמונות של הפניית כיול ביולוגית מכיוון שהמבנה הביולוגי בהפניה שונה מזה שביעד (טבלה 1). לכן, רק יישור כללי משמש לתמונות של הפניית כיול ביולוגית.

המשמרות הכרומטית המקומיות מקורם בשני מקורות; מיקרוסקופ אינסטרומנטלי עיוות מקומי וחוסר הומוגניות מבנית ביולוגית. מאחר שמיקרוסקופ אינסטרומנטלי עיוות מקומי הוא קבוע, זה יכול להיות נמדד מתוך מדגם ססגוניות ההפניה מתקן מתוקן כפרמטר קבוע. כרומעגנון יכול לשלב את המיקרוסקופ האינסטרומנטלי מפת העיוות המקומי ואת פרמטרי היישור הגלובלי מכיול הביולוגי (שולחן 1). בשיטה זו, צפוי כי הדיוק הממוצע של הכיול הביולוגי ישתפר על-ידי משתמש נוסף של 1-2 ננומטר.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לתקן את המשמרות כרומטית של תמונות פלואורסצנטית 3D באמצעות כרומעגנוןהתוכנה שלנו, מן הקצה הנמוך הקלה ביותר בדיוק הגבוה ביותר. אנו משתמשים בנוגדנים של תאי הלה כדוגמה ונצפו אותם באמצעות תלת-ממד מיקרוסקופ שדה רחב 3D-SIM. בחלק הראשון אנו מתארים כיצד להכין דגימות יעד ודגימות כיול ביולוגיות. חלק זה של הפרוטוקול צריך להיות מותאם עבור המטרות הספציפיות של המחקר. בחלק השני, אנו מתארים את שיטות הרכישה עבור שלושה סוגים של תמונות התייחסות על ידי מיקרוסקופים. ההנחה הייתה להשיג ערוצי כחול, ירוק ואדום, אבל הרכב ערוץ צריך להיות שונה על ידי מטרות ספציפיות של המחקר ועל ידי כיוונונים של המיקרוסקופ. זה לא משנה אם המיקרוסקופ מצויד מצלמה אחת או מצלמות מרובות. בחלק השלישי, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בתוכנה שלנו כדי למדוד ולתקן שינויים כרומטית של תמונת היעד באמצעות תמונות התייחסות. לבסוף, בחלק הרביעי, אנו מתארים שיטה כדי להשלים את התמונות התייחסות כיול ביולוגי באמצעות כיול מקומי אינסטרומנטלי של המיקרוסקופ.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה לדוגמא

  1. הכנת דגימת יעד
    1. זרעי 2.5 x 105 תאים הלה על מאכל 35-mm זכוכית התחתון ולצמוח אותם 2 מ ל של גידול בינוני (מדיום הנשר שונה של בינוני עם L-גלוטמין ו-נתרן פירובט שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי [fbs]) ב 37 ° c ו-CO2 ריכוז של 5%. לחילופין, זרע 6 x 104 תאי הלה על 8-היטב שמיכות ולגדול אותם ב 0.5 mL של מדיום צמיחה ב 37 ° c ו-CO2 ריכוז של 5%. השתמש ב#1 שמיכות 0.5 (עם עובי של 0.170 מ"מ) עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה.
      הערה: השתמש 1/4 אמצעי אחסון עבור 8-היטב coverglass שמיכות עבור שלבים נוספים פרט לשלבים 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 ו 1.2.5 שבו אמצעי האחסון הוא 100 μl ללא קשר לסוג של המיכל.
    2. לאחר כ 24 שעות של דגירה, להחליף את הפתרון עם 2 מ ל של 3.7% פורמלדהיד ב מלוחים באגירה פוספט (PBS). לאחר ערבוב עדין, להמשיך לתקן תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על פלטפורמת סיבוב.
      התראה: עבודה בתוך מכסה.
    3. לשטוף תאים עם 2 מ ל של PBS, 3x כל אחד עבור 5-10 דקות על פלטפורמת סיבוב.
      הערה: בצע את התקנות המקומיות כדי להיפטר פסולת פורמלדהיד.
    4. תאים החדירות עם 2 מ ל של 0.1% טריטון X-100 ב PBS עבור 5 דקות על פלטפורמת סיבוב, ואחריו שלוש שוטף עם 2 מ ל של PBS, כל אחד עבור 5-כ 10 דקות על פלטפורמת סיבוב.
    5. התאים הדגירה ב-100 μL של 1% בסרום שור (BSA) ב-PBS עבור 1 h ב-RT על פלטפורמת סיבוב.
    6. החלף את הפתרון עם 100 μL של תערובת של נוגדנים העיקרי (אנטי באמב נוגדן רב שבטיים14 ו anti-טובולין נוגדן חד-שבטיים15) ב 1% bsa ב PBS ב-מדלל המתאים (1/500 עבור אנטי-בייס ו 1/100 עבור anti-טובולין), ו-דגירה לילה ב 4 ° c.
    7. שטוף תאים עם 2 מ ל של PBS, 3 על 5x כל אחד עבור 10 דקות על פלטפורמת סיבוב.
    8. החלף את הפתרון עם 100 μL של תערובת של נוגדנים משניים (האנטי ארנב IgG עם אלקסה Fluor 488 ואנטי עכבר IgG עם אלקסה Fluor 555) בתוך 1% BSA ב-PBS בשעה ש1/500 דילול, ו דגירה עבור 3 על 4 h ב RT.
    9. שטוף תאים עם 2 מ ל של PBS, 3 על 4x כל אחד עבור 5 דקות על פלטפורמת סיבוב.
    10. החלף את הפתרון עם 2 מ ל של 0.5 μg/mL DAPI ב-PBS להכתים דנ א עבור 30 דקות ב-RT על פלטפורמת סיבוב.
      הערה: במקום DAPI, Hoechst 33342 באותו ריכוז ניתן להשתמש גם.
    11. להחליף את הפתרון עם ~ 100 μL של הרכבה בינונית (טבלת חומרים).
  2. הכנת דגימת כיול ביולוגית
    1. הכינו תאים קבועים כמתואר בשלבים 1.1.1-1.1.4.
      הערה: רצוי, דגימות מוכנות על שמיכות שולחן כדי למקם הן את המטרה ואת ההתייחסות דגימות בתאים נפרדים על אותו coverglass (שולחן 1, הזכות ביותר). הכנה זו עדיפה כאשר הניסוי מחייב את דיוק התיקון הגבוה ביותר. כאשר המדגם צריך להיות מוכן על שמיכות רגיל, השתמש שמיכות מדויק עם וריאציה עובי נמוך ("No. 1.5 H") כדי להבטיח הצגת המילה.
    2. הכינו את התמיסה של מניות לצבוע מעלה מעלה מעלה בשנת 1.5 mL של מתנול וחנות ב-20 ° c. מערבבים phalloidin פתרון המניה ב-PBS ב הדילול הבא: 1/100 עבור phalloidin עם אלקסה Fluor 405, 1/1000 עבור phalloidin עם אלקסה Fluor 488, ו 1/200 עבור phalloidin עם אלקסה Fluor 594.
    3. להחליף את הפתרון עם 1 מ ל של תערובת phalloidin מוכן שלב 1.2.2 ו דגירה עבור 30 דקות ב RT על פלטפורמת סיבוב.
    4. שטוף תאים עם 2 מ ל של PBS, 3 על 5x כל אחד עבור 10 דקות על פלטפורמת סיבוב.
    5. החלף את הפתרון באמצעות ~ 100 μL של טעינה בינונית.
      הערה: ניתן לאחסן את דגימות הכיול ב-4 ° צ' או -20 ° c לשימוש חוזר.

2. רכישה של תמונות ייחוס

  1. תמונות הפניה מוצלב
    1. מניחים את מדגם היעד המוכן בשלב 1.1 על מיקרוסקופ שדה רחב.
    2. השג תמונה פלואורסצנטית של היעד בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים.
      הערה: לתמונות תלת-ממד, גודל השלב Z בתמונת הייחוס יכול להיות שונה מזה שבתמונה היעד, כל עוד קובץ התמונה מכיל מידע עבור גודל השלב. גודל השלב Z עבור התייחסות ותמונות יעד רצוי פחות ממחצית הרזולוציה האופטית של ציר Z, אשר מחושב על-ידי figure-protocol-1 עבור מיקרוסקופ מוגבל עקיפה, שם λ הוא אורך הגל ב-ננומטר ו- NA הוא הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית. לדוגמה, אם רזולוציית הציר היא 550 ננומטר, השתמש בצעד Z קטן מ-275 nm. אין צורך בסידרת זמן עבור תמונת הייחוס.
    3. לאחר מכן, כדי לרכוש תמונה פלואורסצנטית של ההפניה, בחר את אור העירור רק עבור DAPI, ובחר לרכוש בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים. השג את תמונת הייחוס בדיוק באותו מיקום שלב וגובה Z, במקרה של מחסנית תלת-ממדית.
      הערה: עבור אורכי גל פליטה ארוכים יותר, עוצמת התאורה המוגברת וזמן החשיפה יהיו נחוצים.
  2. תמונות הפניה לשדה בהיר
    1. מניחים את מדגם היעד המוכן בשלב 1.1 על מיקרוסקופ שדה רחב.
    2. השג תמונה פלואורסצנטית של היעד בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים.
      הערה: גודל השלב Z רצוי ממלא את קריטריון נייקוויסט כמתואר בשלב 2.1.2.
    3. השג תמונת שדה מוארת של היעד בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים בדיוק באותו מיקום השלב כמו ב2.2.2 ובגובה Z זהה במקרה של מחסנית תלת-ממדית.
  3. תמונות התייחסות לכיול הביולוגי
    1. מניחים את מדגם היעד המוכן בשלב 1.1 על מיקרוסקופ 3D-SIM.
    2. לרכוש תמונה פלואורסצנטית של היעד בתוך כחול, ירוק, ערוצי אדום על ידי 3D-SIM. לשחזר את התמונה שנפתרה.
      הערה: סוג המיקרוסקופ יכול להיות מכל סוג, כגון 3D-SIM, confocal וקד, הסטד, וכו '. גודל הצעד Z רצוי למלא את הקריטריון נייקוויסט כמתואר בשלב 2.1.2.
    3. לרכוש תמונות מרובות של הזריחה של ההפניה הכין בשלב 1.2 במיקומים שונים בשלב דומה לתמונת היעד (שלב 2.3.2) על ידי 3D-SIM. בנייה משחזרים של תמונות סופר-נפתרות...
      הערה: המספר הכולל של הפיקסלים ב-XY חייב להיות זהה בכל תמונות הייחוס. גודל השלב ב-Z חייב להיות זהה בכל תמונות הייחוס. המספר הכולל של מקטעי Z מועדף להיות זהה לזה בתמונת היעד, אך זו אינה דרישה מוחלטת. המיקום XY על הבמה עבור תמונות אלה התייחסות לא משנה כי המיקום או coverslip כבר שונה מהמיקום של המדגם היעד, יתר על כן ההבדל במשמרת כרומטית על שמיכות יחיד הוא פחות מ 15 ננומטר3. מצבי הדמיה כולל עדשה אובייקטיבית, התבוננות בטמפרטורה, שמן טבילה, גודל חריר במיקרוסקופיה, וזווית הטיה במיקרוסקופיה תאורה מאוד נוטה16, צריך כל להתאים את ההפניה עבור הביצועים הטובים ביותר. אם המיקרוסקופ משווה מצלמות מרובות לרכוש ערוצים מרובים בו זמנית, את התמונות התייחסות יש לרכוש לעתים קרובות כמו שבועי כדי לתקן את להיסחף אינסטרומנטלי.

3. תיקון משמרת כרומטית באמצעות תוכנת כרומעגנון

  1. באמצעות דפדפן אינטרנט, עבור אל https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releasesוהורד את המהדורה הבינארית החדשה ביותר של כרומעגנון.
    הערה: מהדורות בינאריות זמינות עבור Windows, Mac וחלק מהגירסאות של לינוקס.
  2. חלץ את התוכנית ולשים את קובץ ההפעלה במיקום נוח. ב-Windows או ב-Mac לחץ פעמיים על הקובץ כדי לפתוח אותו, או לבצע את הקובץ הבינארי משורת הפקודה במערכת לינוקס.
    הערה: ממשק המשתמש הגרפי כפי שהוא באיור 1 ייפתח. ייתכן שהתוכנית נמנעת מפתיחה על-ידי לחיצה כפולה בפעם הראשונה עקב סיבה ביטחונית. במקרה זה, השתמש בשיטה תלוית הפלטפורמה כדי לפתוח את התוכנית שהורדת מהאינטרנט.

figure-protocol-2
איור 1: צילום מסך של ממשק המשתמש הגרפי כרומעגנון . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. גרור ושחרר את קבצי הייחוס בתיבה ' הפניה ' (איור 1) או לחץ על קבצי הפניה (איור 1א) כדי לפתוח תיבת דו-שיח של בורר קבצים. בהתאם לתבניות הקובץ, אם התוכנית מבקשת להתקין ערכת פיתוח Java (JDK), הקש yes והמשתמש ינווט לדף ההורדה. הורד והתקן את ה-JDK עבור מערכת ההפעלה כפי שהורו. כרומעגנון צריך להיות מסוגל לקרוא את תבנית קובץ התמונה לאחר הפעלה מחדש של התוכנית.
    הערה: כרומעגנון יכול לקרוא את רוב תבניות קובץ התמונה (מרובי "tif", "czi", "nd2", "oib", "אבל", "dv", וכו '). הפורמט המקורי תמונת המיקרוסקופ הוא מועדף בשלב זה, כי מטא-נתונים יכולים להיות אבודים כאשר תבנית תמונה מומרת לקובץ tif מרובה עמודים. אם שם הערוץ מוצג כ-0, 1, 2, וכדומה, במקום אורכי גל כגון 528, 609 (איור 2א', תיבות ירוקות), ולאחר מכן כרומעגנון אינו יודע את זהות הערוצים בתמונה. במקרה זה, ודא שסדר הערוצים וגודל הפיקסל בקובץ הייחוס תואמים לאלה שבקובץ היעד. לדוגמה, אם סדר הערוצים בהפניה הוא ירוק ואדום, אז סדר הערוצים ביעד חייב להיות גם ירוק ואדום, אך לא אדום וירוק.

figure-protocol-3
איור 2: מסך לדוגמה עבור טעינת קבצים מרובים. (א) מקרה שבו כל תמונות הייחוס מתאימות לתמונות היעד המתאימות. שמות הערוצים מזוהים כראוי באמצעות אורכי גל (המסומנים על-ידי תיבה ירוקה) בקבצי התמונה המשמשים בדוגמה זו. (ב) מקרה שבו משמש תמונת הפניה יחידה לתיקון תמונות יעד מרובות. (ג) מקרה שבו ממוצעים תמונות התייחסות מרובות (המסומנות על-ידי תיבה אדומה) ותמונת הייחוס שנוצרת לאחר בממוצע, משמשת לתיקון תמונות יעד מרובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. גרור ושחרר את קבצי היעד ב "תיבת היעד" (איור 1) או לחץ על קבצי יעד (איור 1B) כדי לפתוח תיבת דו-שיח של בורר קבצים.
    הערה: אם קיימות תמונות יעד מרובות וכל אחת מהן כוללת תמונות ייחוס תואמות, תמונת הייחוס המתאימה ותמונת היעד חייבת להיות באותה שורה בתיבות ההתייחסות והיעד המתאימות (איור 2א). ניתן להשתמש בתמונת הפניה אחת גם כדי ליישר תמונות יעד מרובות (איור 2B).
  2. בדוק את תיבת הסימון שולי חיתוך אם לא מסומנת (איור 1ג).
    הערה: אם תיבת סימון זו מסומנת, נחתכים שוליים הנובעים מהיישור. בדוק אפשרות זו לשימוש כללי אך בטל את הסימון אם נדרשת השוואה ברמת הפיקסל בין תמונות לפני ואחרי היישור.
  3. בחרו תבנית תמונת פלט מרשימת הבחירה (איור 1ד).
    הערה: הפורמטים הזמינים הם ' tif ' (תבנית מבנה17 ), ' dv ', ו-' ome. tif '; תבנית ' ome. tif ' זמינה רק לאחר התקנת JDK.
  4. ציין את הסיומת עבור שם הקובץ של הפלט (איור 1E, ערך ברירת המחדל הוא ' _ALN '), המתווסף לקובץ היעד.
  5. לתמונות התייחסות מוצלב עם יחס אות לרעש גבוה, השתמש ביישור מקומי מרשימת האפשרויות של יישור מקומי (איור 1F), בחר ' הקרנה ' כדי להשתמש ביישור מקומי ובאפשרות ' ללא ' כדי להשבית אותה. השתמש בגודל חלון מינימלי של 60 (איור 1G).
    הערה: בעת שימוש ביישור מקומי, כל תמונות היעד חייבות לכלול תמונות ייחוס תואמות (איור 2א). יישור מקומי אינו מומלץ לתמונות התייחסות ביולוגית כאשר מעברים כרומטית מקומיים משתנים ממדגם אחד לשני (טבלה 1). מאותה סיבה, אין אפשרות להחיל יישור מקומי יחיד על תמונות יעד רבות (איור 2ב'). כחריג, ניתן להשתמש בו כאשר מדגם הריבית הוא רק על פני השטח של שמיכות, ואת שדה התצוגה מתמלא אובייקטים בהירים, בדיוק כמו הדגימות של הפלורסנט ססגוניות.
  6. עבור תמונות של הפניות כיול ביולוגיות מרובות, בדוק את אפשרות ההפניות הממוצעות (איור 1H) כדי למדוד פרמטר יישור בודד מהתמונה בממוצע, והפרמטר יישור יחיד יחול על כל תמונות היעד (איור 2ג). בחר ' ללא ' עבור יישור מקומי (איור 1F).
  7. לחץ על הפעל הכל (איור 1I) כדי להתחיל במדידות; פרמטרי היישור מוחלים על תמונות היעד.
    הערה: לאחר מדידת שינויים כרומטית מתוך קבצי הייחוס, התוכנית הופכת קבצים עם סיומת "כרומעגנון. csv" או "כרומעגנון. tif". סוג קובץ הפלט תלוי באם היישור המקומי נמצא בתוקף (איור 1F). אם היישור מתבצע ללא יישור מקומי, הפלט הוא "chromagnon. csv", בעוד שנעשה שימוש ביישור מקומי, הפלט הוא "כרומעגנון. tif". שמות הקבצים זהים לקובץ הייחוס למעט הסיומת שצוינה (איור 1J, ברירת המחדל היא ללא סיומת) והסיומת ("chromagnon. csv" או "כרומעגנון. tif"). ניתן למצוא תיאור מפורט של תהליך היישור בקובץ "כרומעגנון. log" שנוצר באותה תיקייה.
  8. המתן עד שהתמונה המתוקנת תופיע במציג (איור 3).
    הערה: גרירת התמונה באמצעות העכבר מזיזה את התמונה והזזת גלגל העכבר משנה את הזום. הזז את המחוון (איור 3א) כדי לשנות את המקטע Z (ו/או T כאשר ישים) לתצוגה. אם המציג איטי מדי מכדי לרענן תמונה, לחץ על טעינת נתונים שלמים לתוך לחצן הזיכרון (איור 3ב) כדי לעצור את הגישה לנתונים בדיסק הקשיח. גרירת הקצה השמאלי או הימני של תיבות צבע (איור 3ג) יכול לשלוט בערכי המינימום או המקסימום לתצוגה. לחיצה על הלחצן עבור כל אחד מהערוצים (איור 3ד) מחליפה בין הצגה או הסתרה של הערוץ הנבחר במציג. לחיצה ימנית על תיבת הצבע (איור 3D) מאפשרת למשתמשים לבחור את הצבעים לתצוגה, או לשנות את אפשרויות התצוגה של סרגל הצבע, והיא גם מאפשרת למשתמשים לציין את הערכים המינימליים והמקסימליים המדויקים לשינוי גודל התצוגה באמצעות בחירת "קנה מידה ל...". לחיצה על לחצן התצוגה האורתוגונאליות (איור 3E) מציג את התמונות של תצוגות ZY ו-xz. הזזת הקווים הצולבים משנה את המיקום כדי להציג את התצוגות הצדדיות.

figure-protocol-4
איור 3: צילום מסך של הצופה תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. כדי לבדוק אם המדידה בוצעה כהלכה, גרור ושחרר את תמונות הייחוס לתוך "תיבת הפניה" ו-"תיבת היעד". הפעל את התוכנית, ובדוק אם התמונות הן בצורה מושלמת.
    הערה: באפשרותך להשתמש בקבצי כרומטועגנון. csv או "chromagnon. tif" כהפניות כדי לדלג על מדידות. אם השינוי הכרומטי בתמונה נשאר לא מתוקן, נסה פתרונות מסוכמים בטבלה 2.
  2. כדי לגשת לפרמטרי היישור במדגם, או כאשר יש צורך לערוך את פרמטרי היישור באופן ידני, פתח את קבצי "chromagnon. csv" ישירות עם כל עורך טקסט או תוכנת גיליון אלקטרוני. כאשר הוא נערך, שמור אותו כ-"csv".
    הערה: הערכים הם בפיקסלים עבור "tz", "טיי", "tx", ובמעלות עבור "r", ובגורמי הגדלה עבור "mz", "my" ו-"mx".
    1. לחילופין, טען קובץ "כרומעגנון. csv" או "כרומעגנון. tif" לתוך תיבת ההתייחסות או היעד של כרומעגנון(איור 1), ולאחר מכן לחץ עליו פעמיים כדי לפתוח את עורך היישור (איור 4).
    2. כדי לראות כיצד ערוץ מוזז כאשר הפרמטרים נערכים, גרור ושחרר את קובץ תמונת הייחוס אל האזור התחתון (איור 4א) כדי לפתוח את התמונה בעורך. לאחר עריכת הערכים בטבלה (איור 4ב) ולחץ על מקש הכניסה/החזרה , בדוק כיצד התמונה של הערוץ המתאים זזה כאשר הערכים השתנו. לאחר העריכה, לחץ על שמירה כ. .. (איור 4ג) כדי לשמור את השינויים.

figure-protocol-5
איור 4: צילום מסך של עורך פרמטרים של יישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. כדי לבדוק את מפת היישור המקומית, טען את "כרומעגנון. tif" דרך תיבת ההתייחסות או היעד של כרומעגנון(איור 1), ולחץ עליו פעמיים כדי לפתוח את עורך היישור (איור 4). לחץ על תצוגה (איור 4ד) כדי להציג את ההסטה המקומית המצוינת באמצעות קווים שאורכם מוגדל על-ידי הפקטור שצוין ברשימת אפשרויות ההגדלה (איור 4E).
    הערה: על-ידי ציון "קובץ התמונה המקורי" (איור 4F), המשמרות ממופות יחד עם התמונה המקורית.

4. יצירת מפת יישור מקומית ספציפית למיקרוסקופ

  1. לדלל 2 μL של חרוזי פלורסנט מרובי צבעים של 200 ננומטר בקוטר 18 μL של אתנול.
  2. מערבולת הפתרון והמקום 10 μL של הפתרון חרוז במרכז הצלחת התחתונה זכוכית. הקפד להשתמש #1 כיסוי 0.5 זכוכית (עם עובי של 0.170 מ"מ) עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה.
  3. השאירו את הצלחת ב-RT בשביל 1 כדי להתייבש לחלוטין.
  4. מניחים את הצלחת על מיקרוסקופ להיות מכויל ולהתמקד חרוזי פלורסנט.
  5. השיגו תמונות דו-ממדיות או תלת-מימד עם המיקרוסקופיה לצורך כיול. השג תמונות מרובות על-ידי שינוי מיקום השלב.
  6. פתח ממשק משתמש גרפי כרומעגנון .
  7. גרור ושחרר את קבצי תמונה חרוז על "תיבת הפניה" (איור 1) או לחץ על קבצי הפניה (איור 1א) כדי לפתוח תיבת דו-שיח של בורר קבצים.
  8. בדוק את האפשרות ' הפניות ממוצעות ' (איור 1H). מרשימת הבחירה של יישור מקומי (איור 1F), בחר ' הקרנה'. השתמש בגודל חלון מינימלי של 60 (איור 1G). לחץ על הפעל הכל (איור 1I) כדי להתחיל במדידות.
    הערה: נוצר קובץ ". chromagnon. tif", שבו מאוחסן מפת היישור המקומית של המיקרוסקופ.
  9. לאחר המדידה, לחץ על פרמטרים נוספים (איור 1K). מהעיוות המקומי של תיבת כלי המיקרוסקופ , לחץ על רשימת האפשרויות ובחר באפשרות חדש. ... כדי לפתוח דו שיח גרור ושחרר את הקובץ "כרומעגנון. tif" שנוצר בשלב 4.8 לתוך התיבה שם הקובץ או לחץ על בחר לחצן קובץ כדי לפתוח תיבת דו-שיח של בורר קבצים. הזינו את שם המיקרוסקופ ולחצו על הלחצן ' אשר'.
  10. כאשר מדידת שינויים כרומטית מתוך כיול או ביולוגי תמונות התייחסות, לחץ על פרמטרים נוספים (איור 1K). מתוך העיוות המקומי של תיבת כלי המיקרוסקופ שלך , בחר את שם המיקרוסקופ שצוין בשלב 4.9. לחץ על אישור.
    הערה: הבחירה של "עיוות מקומי של כלי המיקרוסקופ שלך" לא נשמרת לאחר התוכנית היא כיבוי.
  11. המשך לתיקון כרומטי ללא יישור מקומי כמו בסעיף 3.
    הערה: ניתן גם להשתמש ביישור מקומי בנוסף לכיול המיקרוסקופ. במקרה זה, היישור המקומי מתחיל בכיול המיקרוסקופ.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמה לתיקון שינוי כרומטי באמצעות תמונת התייחסות מוצלב מוצגת באיור 5. התמונה הושגה עם מיקרוסקופ שדה רחב מצויד במצלמה אחת. פליטת פלואורסצנטית מ-DAPI שימש כהפניה (איור 5א, ב) כדי לתקן את הערוצים הכחולים, הירוקים והאדומים. התמונה כוללת 3 ערוצים של 60 Z פרוסות, כל אחד מהם מורכב 256 x 256 פיקסלים. התמונות היו לפני מדידת משמרות כרומטית. מדידת המשמרות כרומטית המקומי באמצעות כרומעגנון לקח 51 s ב-Mac עם i7 Core של אינטל (ליבות, 8-האשכולות, 2.7 GHz), 16 GB זיכרון RAM ו 1 TB אחסון flash. פרמטר היישור הוחל על תמונת היעד (איור 5C, D), אשר מכיל בדיוק את אותו מספר של voxels כתמונת הייחוס. הכנת הקובץ המיושר לקחת 3 s. כתוצאה מגזיזת הפיקסלים בקצוות במהלך תהליך היישור (תיבת הסימוןשולי חיתוך באיור 1c), מספר הvoxels הופחת לאחר יישור (איור 5b, 51 Z פרוסות, 252 x 251 פיקסלים). ה-DNA בגשר אנאפה (המצוין על ידי ראשי חץ) נתפסת באופן שגוי מחוץ למעטפה גרעינית לפני יישור (איור 5C, ברור בפאנל התחתון מראה את התצוגה xz), אבל כצפוי בתוך המעטפה לאחר יישור (איור 5c).

דוגמה לתיקון shift כרומטי באמצעות תמונת הפניה לכיול ביולוגית מוצגת באיור 6. התמונות הושגו עם מיקרוסקופ ה-SIM מצויד עם שלוש מצלמות. שלוש תמונות של תאי הלה ויטראז ' עם הפאלואידינים מצובענים לכחול, ירוק, צבע אדום היו ממוצעים (איור 6A). תמונת הייחוס כוללת 3 ערוצים של 76 Z פרוסות, כל אחד מהם מורכב 1,024 x 1,024 פיקסלים. מדידת שינויים כרומטית באמצעות כרומעגנון ללא יישור מקומי נדרש 194 s על מערכת Mac שתוארה לעיל. הפרמטר הוחל על תמונת יעד המורכבת מ -3 ערוצים של 73 Z, כל אחד מהם מורכב מ-1,024 x 1,024 פיקסלים. הדור של הקובץ המיושר לקח 25 ס. התצוגה XZ מציגה עמדות ערוץ שגויות לאורך Z, ומעט לאורך כיווני X (איור 6א, ג) אך הרישום השגוי הזה תוקן לאחר היישור (איור 6B, D).

figure-results-1
איור 5: דוגמה ליישור עם תמונת הפניה מוצלב. תאי הלה היו מוכתמים ב-DAPI עבור DNA (המוצג בארגמן), אלקסה Fluor 488 (מוצג בצהוב) עבור מעטפת גרעינית, ו אלקסה Fluor 555 (המוצג בכחול) עבור microtubules. התמונות נרכשו על ידי מיקרוסקופ שדה רחב 3D עם מצלמה אחת לפירוק. (א, ב) נציג מוצלב של תמונת ייחוס באמצעות פליטת DAPI, לפני ואחרי יישור של כרומעגנון. שלושה ערוצי צבע מוצגים כשכבות. (ג, ד) מקטע אופטי של המחסנית התלת-ממדית בשלושה ערוצים לפני ואחרי יישור. סטייה כרומטית צירית ברורה בגשר האנאפה המוצג על ידי ראשי חץ. סרגל קנה מידה בלוח A מציין 5 יקרומטר עבור כל החלוניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 6: דוגמה ליישור עם תמונת התייחסות ביולוגית לכיול התמונות נרכשו עם 3D-SIM מצויד עם שלוש מצלמות. (א, ב) תמונת הפניה מממוצע משלוש תמונות לפני (A) ואחרי (ב) יישור. תאי הלה היו מוכתמים ב phalloidin מצומנת עם אלקסה Fluor 405, 488 או 594. (ג, ד) תמונת היעד לפני (C) ואחרי (ד) יישור. תאי הלה היו מוכתמים ב-DAPI עבור DNA (המוצג בארגמן), אלקסה Fluor 488 (מוצג בצהוב) עבור מעטפת גרעינית, ו אלקסה Fluor 594 (המוצג בכחול) עבור microtubules. סרגל קנה מידה בלוח A מציין 5 יקרומטר עבור כל החלוניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליך של תיקון כרומטי הוא סחר-off בין דיוק ומאמץ. כדי לחסוך במאמצים מיותר, עדיף לדעת כמה דיוק נדרש עבור המחקר שלך. הדיוק הגבוה ביותר יכול להיות לא נדרש עבור הדמיה רגילה של השדה (חי), ולכן, התייחסות שדה בהיר תמונות מספיקות לעתים קרובות כדי לתקן את המשמרת כרומטית. באופן דומה, כאשר מצב הדימות והסביבה הוא קבוע, שימוש חוזר ונשנה של כיול ביולוגי יחסוך זמן. מצד שני, אם דרושה רישום מדויק במיוחד, יש צורך בתמונות הצלבות באיכות גבוהה או באמצעות כיול ביולוגי. לקבלת הביצועים הטובים ביותר, יש לקבל תמונות התייחסות בתנאים ובתזמונים דומים כתמונות היעד ככל האפשר. כל עוד התייחסות ותמונות יעד מתקבלים על ידי מיקרוסקופ זהה, רזולוציה גבוהה יותר מרחבית תשפר את דיוק התיקון. אם האפשרות ' פירוק ' זמינה עבור תמונות הפניה והיעד, לאחר מכן יישום זה לפני תיקון עשוי לשפר את דיוק התיקון. כמו כן, עבור הביצועים הטובים ביותר, משפט הדגימה לציר האופטי (Z) צריך להיות מתגשם הן בקובץ הייחוס והן ב-היעד לאינטרפולציה מדויקת של פיקסלים משניים (בשלב 2.1.3 פרוטוקול).

אי תיקון שינוי כרומטי מוביל למסקנות שגויות. יתרה מזאת, שימוש בכיול הלא נכון עלול אף להחמיר את המשמרות הכרומטית במקום לתקן אותם, ולכן יש להימנע מכך. סיכלנו את הגורמים האפשריים לכשלים, ואת הפתרונות המשותפים שלהם, בטבלה 2. כדי לבדוק את הסיבה לכישלון, במקום הראשון, יש לבדוק חזותית אם השינוי הכרומטי בתמונת הייחוס מתוקן במדויק (פרוטוקול שלב 3.12). רוב הכשלים הם בשל איכות תמונות הייחוס ניתן לתקן בקלות לפי התיאורים בטבלה 2. בנוגע לאיכות של תמונות ייחוס, חשוב לציין שרמת הדיוק של היישור הכללי יורדת אם השדה המלא של התצוגה אינו מלא במדגם (איור 7, טבלה 2). בהשוואה לדוגמה הטובה המוצגת באיור 7A, הדוגמה הרעה המוצגת באיור 7a מכילה רק שלוש מעטפות גרעיניות באזור השמאלי העליון, וכרומעגנון לא מיישר חלק מתמונה זו. זאת משום ששיטת היישור הגלובלית של כרומעגנון מפצלת את שדה התצוגה לארבעה אזורים (איור 7c) כדי למדוד את ההבדלים בסיבוב ובהגדלה בדיוק גבוה3. שיטה זו, אם היא מופעלת כראוי, היא הזמנה אחת מדויקת יותר מאשר שיטות לינאריות אחרות, כגון שיטות השינוי הקוטביות ושיטת השירות3. אם אחד מארבעת האזורים לא זמין, אז כרומעגנון עובר לשיטות לינאריות פחות אפקטיביות. לכן, עבור הביצועים הטובים ביותר, הדוגמאות המוצגות באיור 7B ואיור 7b אינן רצויות, וארבעת האזורים צריכים להתמלא בעצמים. משתמשים יכולים לבדוק אם כל אזור ריבועי של שדה התצוגה אינו זמין למדידה על-ידי התבוננות בקובץ יומן הרישום ("כרומעגנון. log"; ראה פרוטוקול שלב 3.10). למרבה המזל, ניתן להתגבר על בעיה זו על-ידי חישוב ממוצע של תמונות כיול ביולוגיות מרובות או שימוש ביישור מקומי עבור הצלבות או תמונות התייחסות בשדה בהיר (טבלה 2). בניגוד למקרה של כשל בתמונות התייחסות, אי התיקון של תמונות היעד קשה יותר לזיהוי. מכיוון שכשלים כאלה נובעים עקב הבדלים בתבניות קובץ, בתנאי הדמיה, בתזמונים להדמיה, בשיטות הדמיה/יישור בין תמונות ההפניה והיעד (טבלה 2), משתמשים צריכים תמיד להיות זהירים בעת שימוש בתמונות ייחוס המתקבלות בתנאים שונים/תזמונים מתמונות היעד. תמונות מסוימות לדוגמה זמינות לבדיקה (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) כדי לקבל רעיון בטון של תמונות הדוגמה הטובות והגרועות.

עיהכיפתרון
תיקון תמונת הייחוס נכשלניגודיות נמוכהבמידת האפשר, השג תמונת ניגודיות גבוהה יותר. אם נעשה שימוש בתמונת הפניה בשדה בהיר, השג מחדש את התמונה בפתרון מבוסס-מים כדי לקבל ניגודיות גבוהה יותר מהתא. לחילופין, נסה להחיל הפחתת רעש חישובית (לדוגמה, סינון גאוסיאני). בטל את היישור המקומי, שהוא רגיש יותר לרעש.
זיהום של תמונות לא קשורותהסר את המקור של התמונות שאינן קשורות במדגם במידת האפשר. לתמונות התייחסות מוצלב, בדוק את ספקטרום העירור של הצבעים המשמשים את תמונות היעד. אם הצבעים מתרגשים במהלך הרכישה של דימוי מוצלב (למשל אלקסה פלואו 568 או 594), שקול צבעים אחרים (למשל אלקסה פלואור 555). אם מדובר בשבב המצלמה יוצר הבדל ערוץ ברור, נקה את שבב המצלמה או השתמש בשיטה חישובית שטוחה.
נקודה בהירה מאוד שנעשתה ע י קרן קוסמיתלרכוש את התמונה שוב אם ניתן. לחלופין, נסה להחיל הפחתת רעש חישובית (לדוגמה, סינון חציון או גאוס).
מוצרים לפירוק (אותות מלאכותיים על הציר והקצוות הצדדיים)חתוך את המקטעים ' פיקסלים בקצוות ' או ' Z ' לאחר הפירוק. אם מגזוז צד אחד, יש לגזוז את הצד השני כדי לשמור על מרכז התמונה.
גודל הצעד של Z דליל מדייש לרכוש מחסנית Z כדי למלא את קריטריון נייקוויסט כפי שכתוב בפרוטוקול 2.1.3.
סטייה אופטיתסטייה כדורית היא הסטייה העיקרית הנגרמת על ידי משתמשים. בחר את העדשה המטרה הנכונה עבור המדגם ולהשתמש בעובי coverslip של 170 μm. אם העדשה אובייקטיבי מצויד בטבעת תיקון, להתאים אותו כדי למצוא את המיקום שבו ספירת הזריחה הגבוהה ביותר מתקבל מהמוקד. במקרה של מטרה טבילה בשמן ללא טבעת תיקון, להתאים את מדד השבירה של שמן טבילה המגביר את לספור את הזריחה בפוקוס.
שדה הראיה ללא מילוי (איור 7)במקרה של כיול ביולוגי תמונות התייחסות, ממוצע תמונות רבות. במקרה של הצלבות או תמונות התייחסות בשדה בהיר, השתמש ביישור מקומי.
באג תוכנה לא מזוההדווח על הנושא באמצעות GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
תיקון תמונת היעד נכשלמטה-נתונים של קובץ התמונה אובדיםהשתמש בתבנית קובץ המיקרוסקופ המקורי אשר מכיל מטה-נתונים מלאים, ולהימנע מהמרה לקובץ tiff מרובה עמודים לפני העיבוד. השתמש באותה הזמנת ערוצים כפי שכתוב בפרוטוקול 3.3.
שיטות יישור שגויות עבור המיקרוסקופיה הנתונהאין להחיל את שיטת היישור המקומית בשעת מדידת תמונות של הפניית כיול ביולוגית לתמונות יעד. אין להשתמש בתמונות התייחסות לטבלת הצלבות מלבד מיקרוסקופ שדות רחב.
הבדלים בתנאי הדמיהשמור על תנאי הדימות באופן קבוע בין ההפניה לבין תמונות היעד כפי שכתוב בפרוטוקול 2.3.3.
הבדלים במדגם (כולל coverslip)תמיד להשתמש באותו מדיום הרכבה, coverslip (למשל No. 1.5 H) ועומק דומה של מיקוד.
מיקרוסקופ להיסחף מאז הכיול האחרון נעשההפוך כיול לעתים קרובות כמו כל שבועיים. שמרו על הטמפרטורה קבועה, והשתמשו בטבלה צפה כדי למנוע סחף חומרה של המיקרוסקופ.

טבלה 2: פתרון בעיות עבור תיקון כרומטי.

figure-discussion-1
איור 7: דוגמאות לתמונות ייחוס. מעטפת גרעינית בתאים שמרים ביקוע המסומנים באמצעות GFP ו-mCherry. התמונות נרכשו עם המיקרוסקופיה המקובלת בשדה הרחב. שינויים כרומטית תוקנו באמצעות כרומעגנון ללא יישור מקומי באמצעות התמונות עצמן כתמונות ייחוס. לאחר מכן, התמונות לאחר מכן הראו את הפרטים. (א) דוגמה טובה לאובייקטים רבים בתחום התצוגה. (ב) דוגמה רעה לאובייקטים בפינה השמאלית העליונה בלבד. חוסר יישור ברור באזור מסוים של התמונה. (ג) דוגמה בלתי רצויה שבה אחד מחלק הארבע (מופרד באמצעות קווים מנוקדים) ריק. סרגל קנה מידה בלוח A מציין 5 יקרומטר עבור תצוגת השדה המלא ו-1.25 יקרומטר עבור התצוגה המורחב וישימה לכל החלוניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בפרוטוקול זה, תיארנו שלושה סוגי ייחוס שונים (טבלה 1). בין היתר, תמונות התייחסות מוצלב ותמונות התייחסות לכיול הביולוגי זקוקות לדיון זהיר נוסף. לתמונות התייחסות מוצלב, דגימות מוכתמות באמצעות DAPI או הואכסט 33342, ורכוב בגליצרול או במדיית הרכבה מסחרית ניתן להשתמש ביעילות כדי ליישר את הערוצים הכחולים, הירוקים והאדומים. באופן דומה, אלקסה Fluor 488 ניתן להשתמש כדי ליישר את הערוצים הירוקים והאדומים. עם זאת, השגת פלואורסצנטית הצלבות היא לעתים קרובות קשה מאז צבעים כחולים רבים מלבד DAPI ו Hoechst הם עמעם וריקבון מהר יותר מאשר צבעים ירוק ואדום ביותר. יתר על כן, ספקטרום הפליטה של צבעים מודרניים הם צרים יותר, מה שהופך את היישור של יותר משלושה ערוצים על ידי שיטה זו מאתגרת. תשומת לב צריך גם להיות משולם כמה צבעים אדומים נפוצים (למשל, אלקסה קמח 568 ו 594, אבל לא אלקסה Fluor 555) כי יכול להיות נרגש על ידי אור סגול, אשר מונעים קבלת תמונות בחדות גבוהה הוצלב של צבעים כחולים. חיסרון נוסף הוא ששיטה זו אינה יכולה למדוד את הסטייה הכרומטית של שבילי אור עירור בעירור רב-הצבעים, מכיוון שאורך גל אחד בלבד משמש לעירור (טבלה 1). כמו רוב המיקרוסקופיה המתקדמת ביותר משתמשת באופטיקה תאורה שונה, היישום של שיטה זו הוא מוגבל. ובכל זאת, דיוק התיקון הגבוה יותר הוא יתרון מספיק כדי שהוא יתואר בפרוטוקול זה. באופן כללי, תמונת הצלבות צריכה להילקח לאחר תמונת יעד כדי למנוע הלבנת או אפקטי פוטורעילים. עבור SMLM נצפתה עם מצב השדה הרחב, יש לרכוש תמונת ייחוס לפני רכישת תמונת יעד כאשר ניתן להבחין בצבעים של קרינה בזמן הדמיה.

תמונות התייחסות לכיול הביולוגי מאפשרות למשתמשים ליישר בקלות כל מספר רצוי של ערוצים בעלות הכנה לדוגמה נוספת. יתרון נוסף של תמונות התייחסות לכיול ביולוגי הוא הזמינות של "חישוב ממוצע" של הפניות מרובות המסייע למלא את כל שדות התצוגה. שיטה זו עשויה להיפגע מהבדלים בתנאי הדמיה אם דגימת הכיול מוכנה בשקופית אחרת. רוב בעיה זו ניתן לפתור אם הן מטרות והפניות מוכנים באותה שקופית באמצעות שימוש מסחרי שמיכות (טבלה 1), ותנאי דימות אחרים נשמרים קבוע כמו בשלב הפרוטוקול 2.3.3. במקרה זה, ניתן לצפות בדיוק תיקון דומה לזה של תמונות התייחסות מוצלב3. הפרוטוקול להשתמש phalloidin כפי שמוצג כאן היא אחת הדרכים הקלות ביותר להכתים מבנה סלולרי יחיד עם מספר צבעים. קיימים תרחישים אפשריים רבים להכנת דגימות כיול ביולוגיות. עבור כתמים חיסוני, מדגם ניתן לתייג עם נוגדן ראשוני אחד ואחריו כתמים עם נוגדנים משניים של צבעים מרובים. בדרך זו, ניתן לתייג מבנה יעד בודד עם צבעים מרובים. לחילופין, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine, זוהה על ידי "לחץ" מדבקות כימיה DNA חדש מסונתז בצבעים מרובים בצפיפות גבוהה, כמתואר בפירוט בעבר8. עבור תאים חיים, זה שימושי כדי להכין זן טרנסגניים מחסה שני עותקים של הגן כי הם התמזגו GFP או mCherry לסמן את אותו מבנה עם שני צבעים. אם מספר העותק של הגן הוא קריטי כפי שנצפה לעתים קרובות עבור חלבונים ממברנה, עותק אחד של הגן יכול להיות tandemly התמזגו כדי GFP ו-mCherry (איור 7). להמרה חלבונים פלורסנט, כגון mEOS218, יכול לשמש גם על ידי הארת רמה מתונה של אור סגול כדי להשיג שני מינים חלבון עם או בלי photoconvertible. בתנאי חמצן נמוך, gfp יכול לשמש גם חלבון פוטוהמרה מירוק לאדום19,20. בחירת דוגמת הכיול הנכונה תגרום לניסוי להיות חזק יותר.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה היה נתמך על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP19H03202 עד הבוקר, JP18H05528 ו JP17H03636 ל T.H., ו JP17H01444 ו JP18H05533 ל ח. י. L.S. מכיר את התמיכה על ידי ברוכים השבים פרסים אסטרטגיים 091911 ו-107457/Z/15/Z מימון הדמיה מתקדמת ב מיקרון אוקספורד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת פורמלדהיד 16%Polyscience18814-10
צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מMatTekP35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 phalloidinThermo Fisher ScientificA30104
Alexa Fluor 488 phalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 phalloidinThermo Fisher ScientificA12381
סרום בקרתרמו פישר 16170078
כיסוימטסונאמימס' 1S HT
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)תרמו פישר סיינטיפיקD1306
דולבקו' s מדיום נשר שונה עם L-Gln ונתרן פירובטNacalai Tesque08458-16
מדיום הרכבה (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1000
נוגדן חד שבטי נגד טובולין עכבר (TAT1)מתואר באסמכתא 15.
Nunc Lab-Tek II כיסוי תא (8 בארות)Thermo Fisher Scientific155409
Rabbit נוגדן פוליקלונלי אנטי-אמרין (ED1)מתנה מהירושי יוריפוג'י, אוניברסיטת גונמה, גונמה, יפן וקיצ'י ארהאטה, המרכז הלאומי לנוירולוגיה ופסיכיאטריה, טוקיו, יפן; נפטר.
נוגדן משני עם Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11034
נוגדן משני עם Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21424
נוגדן משני עם Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
TetraSpeck Microspheres, 0.2 ומיקרו; מתרמו פישר סיינטיפיקT7280

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  2. Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
  3. Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583(2018).
  4. Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
  5. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  7. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  8. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
  9. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  10. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  11. Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
  12. Müller, C. B., Enderlein, J. Image Scanning Microscopy. Physical Review Letters. 104 (19), 198101(1981).
  13. Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
  14. Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
  15. Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
  16. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  19. Sawin, K. E., Nurse, P. Photoactivation of green fluorescent protein. Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).
  20. Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

KChromagnon3D SIM

מאמרים קשורים