השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

Hirofumi Nishizono; Mohamed Darwish; Hideki Uosaki; Nanami Masuyama; Motoaki Seki; Hiroyuki Abe; Nozomu Yachie; Ryohei Yasuda

doi:10.3791/60808

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60808

⸱

2 באפריל 2020

Hirofumi Nishizono^*¹^,²^,³ , Mohamed Darwish^*⁴^,⁵ , Hideki Uosaki⁶^,⁷ , Nanami Masuyama⁸^,⁹^,¹⁰ , Motoaki Seki⁸^,¹¹ , Hiroyuki Abe³ , Nozomu Yachie⁸^,⁹^,¹⁰^,¹²^,¹³ , Ryohei Yasuda¹

¹Max Planck Florida Institute for Neuroscience, ²Life Science Research Center, University of Toyama, ³Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, ⁴Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, ⁵Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, ⁶Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, ⁷Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, ⁸Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, ⁹Institute for Advanced Biosciences, Keio University, ¹⁰Graduate School of Media and Governance, Keio University, ¹¹Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, ¹²Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, ¹³College of Arts and Sciences, University of Tokyo

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

תקציר

השימוש בעכברים שעברו שינוי גנטי (GM) הפך לקריטי להבנת תפקוד הגנים ופענוח המנגנונים הבסיסיים של מחלות אנושיות. CRISPR/Cas9 מערכת מאפשרת לחוקרים לשנות את הגנום עם יעילות חסרת תקדים, נאמנות, ופשטות. רתימת טכנולוגיה זו, חוקרים מחפשים פרוטוקול מהיר, יעיל, קל ליצירת עכברים GM. כאן אנו מציגים שיטה משופרת עבור הקפאת הסתייגות של עוברי תא אחד המוביל לשיעור התפתחותי גבוה יותר של העוברים הקפאת ההקפאה. על ידי שילוב זה עם תנאי אלקטרופורציה אופטימיזציה, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של הסתרה ועכברים לנקוש עם יעילות גבוהה ושיעורי פסיפס נמוך בתוך זמן קצר. יתר על כן, אנו מראים צעד אחר צעד הסבר על הפרוטוקול הממוטב שלנו, כיסוי CRISPR הכנה מגיב, הפריה חוץ גופית, הקפאה והפשרה של עוברי תא אחד, אלקטרופורציה של ריאגנטים CRISPR, העכבר הדור, ו-הקלדה של המייסדים. באמצעות פרוטוקול זה, החוקרים צריכים להיות מסוגלים להכין עכברים GM עם קלות, מהירות ויעילות ללא תחרות.

מבוא

האשכולות מקובצים באופן קבוע במרווחים קצר palindromic חוזר (CRISPR)/קריספר-חלבון משויך 9 (Cas9) מערכת היא פריצת דרך מדעית המספקת שינוי ממוקד חסר תקדים בגנום¹. מערכת CRISPR/Cas9 מורכב Cas9 חלבון מדריך RNA (gRNA) עם שני מרכיבים מולקולריים: מטרה ספציפית CRISPR RNA (crRNA) ו-מפעיל הפעלת CRISPR RNA (tracrRNA)² . GRNA מפנה את חלבון Cas9 למיקום מסוים בגנום, 20 נוקלאוטידים משלימים crRNA, ובצמוד המוטיב הסמוך מוטיב (פאם). חלבון Cas9 נקשר לרצף היעד וגורם הפסקות כפול הגדיל (dsbs) כי הם תוקנו על-ידי מועדים שגיאה שאינם הומוולוגיים סוף הצטרפות (nhej) או בנאמנות גבוהה הומולוגיה תיקון מכוון (HDR)³^,