מאמר שיטה

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

DOI:

10.3791/60808

⸱

2 באפריל 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בעכברים שעברו שינוי גנטי (GM) הפך לקריטי להבנת תפקוד הגנים ופענוח המנגנונים הבסיסיים של מחלות אנושיות. CRISPR/Cas9 מערכת מאפשרת לחוקרים לשנות את הגנום עם יעילות חסרת תקדים, נאמנות, ופשטות. רתימת טכנולוגיה זו, חוקרים מחפשים פרוטוקול מהיר, יעיל, קל ליצירת עכברים GM. כאן אנו מציגים שיטה משופרת עבור הקפאת הסתייגות של עוברי תא אחד המוביל לשיעור התפתחותי גבוה יותר של העוברים הקפאת ההקפאה. על ידי שילוב זה עם תנאי אלקטרופורציה אופטימיזציה, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של הסתרה ועכברים לנקוש עם יעילות גבוהה ושיעורי פסיפס נמוך בתוך זמן קצר. יתר על כן, אנו מראים צעד אחר צעד הסבר על הפרוטוקול הממוטב שלנו, כיסוי CRISPR הכנה מגיב, הפריה חוץ גופית, הקפאה והפשרה של עוברי תא אחד, אלקטרופורציה של ריאגנטים CRISPR, העכבר הדור, ו-הקלדה של המייסדים. באמצעות פרוטוקול זה, החוקרים צריכים להיות מסוגלים להכין עכברים GM עם קלות, מהירות ויעילות ללא תחרות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האשכולות מקובצים באופן קבוע במרווחים קצר palindromic חוזר (CRISPR)/קריספר-חלבון משויך 9 (Cas9) מערכת היא פריצת דרך מדעית המספקת שינוי ממוקד חסר תקדים בגנום1. מערכת CRISPR/Cas9 מורכב Cas9 חלבון מדריך RNA (gRNA) עם שני מרכיבים מולקולריים: מטרה ספציפית CRISPR RNA (crRNA) ו-מפעיל הפעלת CRISPR RNA (tracrRNA)2 . GRNA מפנה את חלבון Cas9 למיקום מסוים בגנום, 20 נוקלאוטידים משלימים crRNA, ובצמוד המוטיב הסמוך מוטיב (פאם). חלבון Cas9 נקשר לרצף היעד וגורם הפסקות כפול הגדיל (dsbs) כי הם תוקנו על-ידי מועדים שגיאה שאינם הומוולוגיים סוף הצטרפות (nhej) או בנאמנות גבוהה הומולוגיה תיקון מכוון (HDR)3,4,5. NHEJ מוביל הוספות או/ו מחיקות (indels), ולכן לאובדן גנטי של הפונקציה כאשר רצף קידוד ממוקד. HDR מוביל לעריכת הגנום מדויק בנוכחות תבנית תיקון המכיל רצפים הומולוגיה3,4,5. NHEJ ו HDR כבר לרתום כדי ליצור נוקאאוט ועכברים לנקוש, בהתאמה.

בעוד מערכת CRISPR/Cas9 האיץ במידה ניכרת את הדור של עכברים GM עם יעילות ונאמנות מצטיינים, מדענים המחילים שיטות אלה נתקלים לעתים קרובות אתגרים טכניים. ראשית, פרוטוקולים קונבנציונליים דורשים מיקרוהזרקה להצגת כלי העריכה של crispr לתוך הבאוקלינוס של ביצים מופרות6,7. טכניקה זו גוזלת זמן ובדרך כלל דורש הכשרה נרחבת. כך, מספר קבוצות החליפו מיקרוהזרקה באמצעות אלקטרופורציה8,9,10,11,12,13. עם זאת, בפרוטוקולים אלקטרופורציה מוקדם שימשו עוברים טריים עבור אלקטרופורציה. זה גרם בעיה נוספת, כי הכנת עוברים טריים לפני כל ניסוי הוא קשה14.

לאחרונה אנחנו ואחרים שילבו את השימוש של עוברי הקפאת העוברים ואלקטרופורציה עבור עריכת הגנום, אשר מקל על הדור של GM עכברים15,16. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ללא כישורי מניפולציה מתקדמים העובר ליצור במהירות מודלים של בעלי חיים של מחלות אדם עם יעילות גבוהה. הפרוטוקול גם מפחית באופן משמעותי את האתגרים המעשיים ביצירת עכברים GM, כגון טרוגניות גנטית במייסדים16. כדי להתגבר על הפסיפס, אנו מבצעים את אלקטרופורציה של ריאגנטים CRISPR בתוך 1 h לאחר העובר החוצה כדי להבטיח כי העריכה מתרחשת לפני השכפול הראשון של הגנום. שיפור נוסף כולל את השימוש בחלבון Cas9 במקום Cas9 mRNA להפחתת פסיפס בלתי רצוי17. יתר על כן, פיתחנו שיטה אופטימלית עבור החלפת תא אחד העובר באופן המגביר את השיעור ההתפתחותי של שני תאים בשלב16: שימוש בסרום של שור העוברי (fbs) משפרת בצורה דרמטית את ההישרדות של הקפאת הקפאה oocytes לאחר הפריה, אולי על ידי18אותו מנגנון שעושה הקפאה מופרית בלתי מופרות יותר

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור הדור של עכברי מג באמצעות עוברים הקפאת ההקפאה, כולל שיטה ששונתה עבור הקפאה של עוברי תא אחד C57BL/6J. זה כולל 1) עיצוב gRNA, קריספלאר הכנה מגיב והרכבה; 2) הפריה חוץ גופית, הקפאה, והתרסה של עוברי תא אחד; 3) אלקטרופורציה של הריאגנטים של CRISPR לתוך עוברים המופשרים; 4) העברה העובר לתוך תעלת ההטלה של עכברים pseudopregnant נשיים; ו-5) בדיקות הגנוזות ורצף של חיות מייסד F0.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל טיפול בעלי חיים והליכים שבוצעו במחקר זה נעשו על פי הכללים והתקנות של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפרוטוקול הניסיוני אושר על ידי ועדת הטיפול בעלי חיים של בעלי חיים מעבדה של אוניברסיטת טויאמה, אוניברסיטת טוקיו, אוניברסיטת Jichi, ו מקס פלאנק פלורידה המכון למדעי המוח. מידע על כל הריאגנטים מופיע בטבלה של חומרים.

1. העיצוב הריאגנטים של CRISPR

  1. עיצוב crRNA
    1. בקר CRISPR ישיר19 (https://crispr.dbcls.jp/) כדי לתכנן crRNAs ספציפיים עם מופחת אתרים מחוץ ליעד.
      הערה: ישנם כלים רבים אחרים שימושיים לעצב את crRNA20 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/).
    2. הכנס את רצף נוקלאוטיד היעד ובצע את השינויים הבאים:
      הדרישה לרצף פם = NGG
      בדיקה ספציפיות = הגנום (Mus מוסקולוס), GRCm38/mm10 (דצמבר, 2011)
      הערה: כדוגמה, כדי ליצור עכברים מTyrosinase (Tyr), התמקד ב -2 (ברצף נוקלאוטיד מ-9476-9692).
    3. לחץ על עיצוב, ועל להיטים מסוימים מאוד, סמן את הצג את המטרה הספציפית ביותר בלבד.
    4. כדי להפחית את ההשפעות הפוטנציאליות מחוץ ליעד, בחר את רצף היעד עם הערך הנמוך ביותר בעמודות של "12 מר + פם" ו-"8 מר + פאם".
      הערה: בעמודות אלה, ("1") מציין שלרצף יש התאמה מושלמת אחת בלבד לאתר היעד המיועד ולמספרים הגדולים מאלה המציינים את נוכחותם של אתרים פוטנציאליים מחוץ ליעד.
    5. להזמין את האוקליונודים המתקבלים מחברות סינתזה crRNA (Supplimentary Table 1).
      הערה: עבור הגן של אקסון 2 tyr, נעשה שימוש ברצף היעד הבא: ggaccacטאאכאטק, עם + tgg כרצף פם (איור 2a).
  2. Oligodeoxynucleotide סטרנד יחיד (ssODN) עיצוב לניסויים בעריכת HDR-תיווך (כלומר, להקיש-in הדור עכברים).
    1. עיצוב האורך ssODN להיות סביב 80 – 180 bp כולל 30 – 60 נוקלאוטיד (nt) הומולוגיה זרועות משני הצדדים.
      הערה: ssodn של 75-85 nt באורך, כולל הזרוע 30-35 nt הומולוגיה ומשלימה את grna, הראה גבוה דפיקה-in עריכת יעילות21.
    2. הכנס את השינוי המיועד ומוטציה שקטה ברצף פם או, אם לא אפשרי, על 5 ′ בסיס השכנה של פאם לחסום את חיתוך מחדש לאחר עריכת הגנום.
      הערה: ה-crRNA ו-ssODN המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה השלמה 1.

2. הפריה חוץ-גופית, הקפאת העובר והקפאה

  1. הפריה חוץ גופית
    1. Superovulate C57BL/6J עכברים נקבה (4 או 8-בן שבועות) על ידי הזרקת IP עם הריון גונדוטרופין מארה בהריון (PMSG) ואחריו הזרקה עם 7.5 IU כוריוני האדם גונדוטרופין (hCG) לאחר 48 h.
      הערה: מספר הovulated אוציטים יכול להיות מוגבר על-ידי כ-3x באמצעות אולטרה-ביוץ22.
    2. הסר את האפידיתמים מינית בוגרת C57BL/6J עכברים גברים (3 – 5 חודשים).
      הערה: ניתן לאסוף מזרע מבלי להקריב את העכברים הזכרים.
    3. לחלץ קרישי דם של זרע עם המחט מבתר ו-דגירה אותם ב-200 μL שחרור של נוזל תובל אדם (HTF) ב-CO2 חממה עבור 1.5 h עבור מדרכיכים.
    4. לאסוף את מכלולי קומולוס-oocyte (COCs) מתוך ההטלה 16 – 18 h לאחר הזרקת hCG ו הדגירה אותם בירידה טריים 200 μL של המדיום HTF מכוסה פרפין נוזל ב-CO2 חממה (5% CO2, 37 ° c) עבור לא יותר מ 2 h.
      הערה: עדיף להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם תחת הרדמה כי המתת החסד באמצעות שאיפת2 משפיע על הפריה חוץ גופית ו העובר התפתחות23.
    5. הוסף 1 – 5 μL של השעיית זרע מן הגבול של בינונית דגירה ל-200 μL של שחרור HTF בינונית המכילה COCs ו-דגירה אותם ב-CO2 חממה עבור 3 h.
    6. לשטוף את oocytes עם אשלגן-בינוני אופטימיזציה בינונית (KSOM) 3x כדי להסיר את הזרע הנותרים תאים קומולוס.
    7. בדוק את היווצרות התאים ואת הציון של עוברי תא אחד באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
  2. הקפאה של עוברי תא אחד
    1. מודנת תאים אחד העוברים בירידה μL 200 של HTF המכיל 20% FBS (לא מכוסה פרפין נוזל) עבור 10 דקות בחממה CO2 .
    2. העבר 20 – 100 עוברים אל 50 μL של 1 M diמתיל סולפוקסיד (DMSO) פתרון24.
    3. העברה 5 μL של פתרון המכיל 100 עוברים לתחתית הקריוצינור וקריר עבור 5 דקות ב 0 ° צ' באמצעות מצנן או על קרח.
    4. הוסף 45 μL של DAP213 (2 מסולפוקסיד diמתיל, 1 מרחאמיד, ו 3 M פרופילן גליקול) הפתרון לאט לאורך הקיר הצינור, כיסוי הצינורות, ולשמור על 5 דקות בתוך שאיפה או על קרח ב 0 ° c.
      הערה: אין להדק את כובעים חזק מדי כדי להסיר אותם בקלות במהלך הפשרה לדוגמה.
    5. אחסן צינורות במהירות בחנקן נוזלי.
  3. העובר הפשרה
    1. פתח את המכסה של הקריוצינור, להשליך את החנקן הנוזלי הנותרים, ולהוסיף 900 μL של 0.25 M הפתרון מחומם מראש ל 37 ° c.
      הערה: הפתרון ה0.25 של הג חייב להיות מחומם ל-37 ° c מראש משום שהשימוש בתמיסה קרה מקטין את הכדאיות העובר לאחר הפשרה.
    2. Pipet במהירות 10x ולהעביר את התוכן של הקריוצינור לתוך צלחת פלסטיק.
      הערה: יש לבצע את הליטוף בזהירות, כך ששום בועות לא נוצרות ופוגעות בעוברים.
    3. שטוף מורפולוגית נורמלית מופרית 2x ב-KSOM בינונית מכוסה פרפין נוזלי ולשמור אותם ב-CO2 חממה עד אלקטרופורציה.

3. הרכבה ואלקטרופורציה של מריאגנטים קריספיר

הערה: עבור electroporation, השתמשנו לוחית פלטינה האלקטרודה (גובה: 0.5 מ"מ, אורך: 10 מ"מ, רוחב: 3 מ"מ, פער: 1 מ"מ) ו-one-צעד electroporation מסוג אחד שתוארו קודם לכן8 (טבלת חומרים). ניתן להשתמש גם בשני שלבים מסוג אלקטרופורטור (רשימת חומרים).

  1. הכנה והרכבה של ריאגנטים קריספלאר
    1. הזמנת CRISPR ריאגנטים (כלומר, crRNA, tracrRNA, ו Cas9 חלבון) ו ssODN אם ביצוע ניסויים בעריכת HDR-תיווך (טבלת חומרים ושולחן משלים 1).
    2. הכינו את פתרון הריפוי כדלקמן.
      1. להכין 1 μg/μL crRNA ו 1 μg/μL tracrRNA בפתרון בינוני מינימלי בינונית Essential (טבלת חומרים), ולהוסיף 6 μl של כל פתרון כדי 42 μl של מאגר חינם nuclease.
      2. מודיית את התערובת בתנור יבש ב 95 ° c עבור 3 דקות וקריר ב RT עבור 5 דקות.
      3. הכינו 1 μg/μL HiFi Cas9 חלבון מדולל ב-Opti-גברתי ולהוסיף 6 μL לתערובת הקודמת עבור נפח כולל של 60 μL.
      4. ביצוע ניסויים בעריכת HDR-תיווך, הוסף 6 μL של 1 μg/μL ssODN. מכיוון שאמצעי האחסון הסופי צריך להיות 60 μL, השתמש 36 μL של מים ללא החכירה בשלב 3.1.2.1.
        הערה: הריכוז הסופי של crRNA, tracrRNA, Cas9 חלבון, ו ssODN יהיה 100 ng/μL.
      5. העברת עד 100 עוברים עד 25 μL של התערובת הסופית (RNP מורכבים) בזכוכית אחת שקופית חור ו-מארג אותם ב 37 ° צ' עבור 10 דקות.
  2. אלקטרופורציה
    1. למלא את פער האלקטרודה עם 6 μL של התערובת החדשה של ריאגנטים CRISPR ולהוסיף 20 – 25 עוברים לתערובת.
      הערה: חשוב להימנע מכל קשר בין העוברים לבין האלקטרודה האלקטרופורציה, העלולה לגרום נזק לעוברים במהלך פולסים חשמליים.
    2. בצע את האלקטרופורציה בתנאים הבאים עבור אלקטרופוראטור סוג של צעד אחד:
      מתח: 25 V, כיוון הפעימה (Pd) +
      ON: 3 אלפיות הזאת, OFF: 97 ms
      חזרה על: 5x
      הערה: האלקטרופורציה צריכה להתבצע לא יותר מ 1 h לאחר הפשרה כדי להבטיח עריכת הגנום מתרחשת לפני שכפול ה-DNA הראשון כדי למנוע פסיפס.
    3. עבור אלקטרופוראטור מסוג שני שלבים, הגדר את התנאים כדלקמן:
      דופק poring = 40V, Pd +
      ב = 1 או 2.5 אלפיות הראשונה; דופק מרווח = 50 ms
      חזרה על: 4x, דעיכה 10%

      דופק העברה = 5 או 7V; משטרת ניו-אורלינס
      ב: 50 ms; דופק מרווח = 50 ms.
      חזרה על = 5x; דעיכה = 40%.
      הערה: חשוב לכוונן את אמצעי האחסון כדי לשמור על העכבה בטווח הספציפי שצוין על-ידי היצרן.
    4. לשטוף את העוברים 3x עם שונה Krebs-צלצול ביקרבונט מאגר 2 (M2) בינוני ואחריו שני שוטף עם טיפה של מדיום KSOM מכוסה פרפין נוזל.
    5. מודטה את העוברים שטף (ב-KSOM בינונית) ב חממה2 לילה להשתלה נוספת.

4. העברת עובר

  1. . הכן pseudopregnant עכברים נשיים החבר icr נקבה עכברים (3 – 6 חודשים) עם עכברים גברים עיקור יום אחד לפני העברת העובר (ET).
    הערה: יש לבדוק את העכברים בבוקר שלמחרת לצורך חיבור שלילי. העכברים בעלי תקע נחשבים לpseudopregnant וניתן להשתמש בהם עבור ET.
  2. כאשר אתם מחפשים מיזוג אוויר ומאוורר, במרווחים חלופיים של 2 – 3 מ"מ לתוך נימי זכוכית כסמן להשתלה מוצלחת.
  3. הציגו 20 – 24 עוברים לתוך ירידה של 200 μL של KSOM (בלי פרפין נוזל) ולצייר 10 – 12 עוברים לתוך נימי הזכוכית עבור השרשה בכל צינור ההטלה.
  4. ליכלו את העכברים הנשיים על ידי isofליקאן (אינהלציה) או הזרקת IP של פתרון המשלב medetomidine/midazolam/butorphanol (0.3 mg/kg, 4.0 mg/ק"ג, ו 5.0 מ"ג/ק"ג בהתאמה). הצב את העכבר הורדם על צידו הגייתי במשטח חימום. להגן על העיניים של העכבר מורדם עם ג'ל לחות.
  5. להתגלח לאורך החלק התחתון של קו האמצע ולחטא את האזור עם יוד povidone ואחריו עם 70% אתנול.
  6. הפוך חתך ארוך של 1 ס מ במקביל לקו האמצע.
  7. תוציא את תעלת ההטלה ומניחים. על העטוף בפלסטיק סטרילי שמור את זה לח באמצעות תמיסת מלח סטרילית חם.
  8. הנח את צינור ההטלה מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקופי.
  9. הפוך חור לתוך הקיר של תעלת ההטלה בין שפך ו ampulla כמה מילימטרים במעלה של ampulla על ידי מספריים microspring.
  10. הכניסו את קצה נימי הזכוכית המכילים את העוברים לתוך החור ומפוצצים בעדינות את פיו של בעל הנימים כדי לגרש את העוברים עד שבועת האוויר תהיה גלויה באמפוללה.
    הערה: העברה בין 10-12 עוברים לכל ההטלה.
  11. משוך את נימי הזכוכית מהקיר ההטלה ודחף את איבר הרבייה בעדינות חזרה לחלל הגוף.
  12. חזור על התהליך הקודם כדי להחדיר את העוברים לתעלת ההטלה האחרת.
  13. לאחר השלמת הליך ה-ET, תפר את הצפק בתבנית תפר פשוטה ומקוטע (50, נספג, תפר סינתטי קלוע) ולאחר מכן העור בתבנית מופסקת פשוטה או בתבנית תפר משנית שהופסקה (60 שאינם נספגים, תפרים מונוסינתטיים).
  14. לשמור על העכבר חם על צלחת התחממות 37 ° c עד שהוא מתאושש מן ההרדמה.
  15. נטר את בריאותו של בעל החיים מדי יום למשך 7 ימים לאחר הניתוח.

5. ניתוח הקלדה ורצף הגנוזות

  1. הפקת דנ א גנומית
    הערה: השתמשנו בערכות ה-DNA של רקמת הרקמה לחלץ את ה-DNA גנומית מרקמת האוזן לאחר ההמלצות של היצרן.
    1. להוסיף 180 μL של מאגר T1 ו 25 μL של הפתרון פרוטאינאז K למדגם ומערבבים על ידי vortexing עבור 10 s.
    2. מודטה ב 56 ° צ' עבור 2 h או עד להשלמת הפירוק מתקבל. מערבולת עבור 10 s כל 30 דקות של הדגירה.
    3. הוסף 200 μL של מאגר B3, מערבולת במרץ עבור 30 s, ו-דגירה ב 70 ° צ' עבור 10 דקות.
    4. הוסף 210 μL של 100% אתנול למדגם מערבולת במרץ.
    5. עבור כל דוגמה, מקם עמודת רקמה אחת בתוך צינור אוסף והחל את המדגם על העמודה.
    6. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, למחוק את הפרח דרך, ולמקם את העמודה בחזרה לתוך צינור האוסף.
    7. הוסף 500 μL של מאגר BW כדי לשטוף את המדגם (1 לשטוף), צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, למחוק את הפרח דרך ולמקם את העמודה בחזרה לתוך צינור האוסף.
    8. הוסף 600 μL של מאגר B5 לעמודה (לשטוף 2), צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, למחוק את הפרח דרך, ולמקם את העמודה בחזרה לתוך צינור האוסף.
    9. צנטריפוגה את העמודה עבור 1 דקות ב 11,000 x g כדי לייבש את קרום סיליקה ולמקם את העמודה נוקלאוטיספין הרקמה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
    10. הוסף 100 μL של מאגר BE, דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות, ואז צנטריפוגה 1 דקות ב 11,000 x g.
  2. הגברה וטיהור של הPCR
    1. עיצוב התחל באמצעות אתר primer3 plus (https://primer3plus.com/) על מנת להגביר את רצף הלחץ של 400-500 המקיף את מקום היעד.
    2. עצב פרוטוקול PCR חדש ובדוק אותה באמצעות התוכנית.
    3. טהר את מוצר ה-PCR כדי להסיר את האנזימים הלא רצויים, נוקלאוטידים, התחל ורכיבי המאגר. ניתן להשתמש בשיטת טיהור סטנדרטית כדלקמן.
      1. הוסף 50 μL של פנול כדי 50 μL של מוצרי ה-PCR ומערבבים על ידי vortexing.
      2. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g והעבר את השכבה השקופה העליונה לשפופרת חדשה.
      3. הוסף 120 μL של 99.5% אתנול ו 20 μL של 5 מטרים אמוניום אצטט ו מערבולת עבור 30 s.
      4. לשמור על RT עבור 10 דקות ו צנטריפוגה ב 11,000 x g עבור 10 דקות.
      5. להיפטר supernatant ולשטוף את הגלולה DNA עם 1 mL של 70% אתנול.
      6. יבש את הגלולה ב RT עבור 10 דקות ולפזר 10 μL של RNase מים חופשיים.
        הערה: ערכות הטיהור המבוססות על העמוד PCR ממליצים משום שפנול רעיל לבני אדם.
  3. רצף שטנגר
    1. הפעל ניתוח כימות DNA (ראה טבלת חומרים) כדי לכמת את ה-PCR הטהור amplicon.
    2. שלח את מוצרי ה-PCR ואת הרצף (ים) לספק שירות ברצף.
    3. ניתוח הרצף באמצעות אתרי האינטרנט המקוונים הזמינים.
      הערה: במחקר זה, חד-מזהה25 (http:/crispid. gbiomed.) שימש לניתוח רצף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוקנת שלנו עבור הקפאה של עוברי תא אחד, כולל הדגירה של HTF המכיל 20% FBS עבור 10 דקות ואחריו הקפאה ב 1 מסוג DMSO ו DAP213 פתרון, שיפור הקצב ההתפתחותי של העוברים הקפאת המופשנים לשלב שני תאים (איור 1, p = 0.009, סטודנט של t-test). העוברים הקפאה שימשו לייצור עכברים GM ותנאי אלקטרופורציה היו ממוטבים: חמש חוזר על 25 וולט עם 3 הפולסים ms ו 97 ms מרווחי זמן באמצעות אלקטרופורציה כפי שמתואר בסעיף פרוטוקול. תחולתה של הפרוטוקול נבדק על ידי דור של הלבקן Tyrosinase gene (Tyr) בעכברים (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר מאפשר דור של עכברים GM עם יעילות גבוהה ושיעורי פסיפס נמוך (שולחן 1). זה מאפשר לחוקרים ללא מניפולציה מתקדמת מיומנויות העובר כדי ליצור עכברים מוטציה בקלות כי זה מנצל את ההתקדמות האחרונה ושימושי ביותר הן הנדסת הרבייה והגנום עריכת טכנולוגיות: crispr/Cas9 ribonucleoprotein (rnp) ו אלקטרופורציה לתוך הקפאת עוברים המופשלים. ההתקדמות הזאת הקלה ומואצת את הדור של עכברים GM. כפי שמתואר באיור 3, זה לוקח ~ 4 שבועות כדי ליצור את העכברים GM. לעומת פרוטוקולים אחרים באמצעות ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילויים פיננסיים רלוונטיים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מבקשים להודות לחיטומי סוראדה. ואליזבת גרסיה לטיפול בחיות עבודה זו היתה נתמכת על ידי KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 ו 16H06276) ו Hokugin מחקר גרנט (ל ח), ו Jichi רפואי האוניברסיטה הצעירה פרס החוקר הצעיר (כדי H.U.). קרן מלגות אוטסקה טושימי נתמכת md

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25 מ' סוכרוזARK משאב ושות', בע"מ (קומאמוטו, יפן)סוכרוז
1 מ' DMSOARK Resource Co., Ltd. (קומאמוטו, יפן)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (טוקיו, יפן)Vetorphale 5mg
Cas9 חלבון: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (קורלוויל, IA)1081060
עכברי C57BL/6Jיפן SLC (הממאצו, יפן)N/A
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (קומאמוטו, יפן)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (סנט לואיס, מיזורי)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (טוקיו, יפן)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (קומאמוטו, יפן)HTF
עכברי ICRיפן SLC (המאמאטסו, יפן)N/A
IsofluranePetterson Vet Supply, Inc. (גרילי, קולורדו)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (קומאמוטו, יפן)KSOM
LN2 תעשיות תרשים טנקים(Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (קומאמוטו, יפן)M2
MedetomidineNippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. (קוריאמה, יפן)1124401A1060
מיקרוסקופNikon Co. (טוקיו, יפן)SMZ745T
MidazolamSandoz K.K. (טוקיו, יפן)1124401A1060
מאגר נטול נוקלאזIntegrated DNA Technologies, Inc. (קורלוויל, IA)1072570
ערכתמיצוי DNA נוקלאוספיןTakara Bio Inc (Kusatsu, יפן)740952 .5
זכוכית שקופית חור אחדMatsunami Glass Ind., Ltd. (קישיוואדה, יפן)S339929
סוג צעד אחד ElectroporatorBEX Co., Ltd. (טוקיו, יפן)CUY21EDIT II
פרפין נוזליNACALAI TESQUE Inc. (קיוטו, יפן)SP 26137-85
אלקטרודה צלחת פלטינהBEX Co., Ltd. (טוקיו, יפן)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (טוקיו, יפן)SEROTROPIN 1000
Povidone iodideProfessional Disposables International, Inc. (אורנג'בורג, ניו יורק)C12400
סרום מופחת מדיום חיוני מינימלי: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (סנט לואיס, מיזורי)22600134
אלקטרופורטור מסוג דו-שלביNepa Gene Co., Ltd. ( איצ'יקאווה, יפן)NEPA21

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355(2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
  9. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382(2014).
  11. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315(2015).
  12. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  13. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  14. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474(2018).
  15. Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
  16. Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
  17. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  18. Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
  19. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  20. Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6 (3), 63(2019).
  21. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811(2019).
  22. Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
  23. Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
  24. Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
  25. Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973(2016).
  26. Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
  27. Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
  28. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
  29. Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
  30. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  31. Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  32. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  33. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  34. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  35. Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR Cas9CryopreservationKnockoutKnock InMosaicism

מאמרים קשורים