מאמר שיטה

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

DOI:

10.3791/60829

⸱

27 באפריל 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישת ההרכבה מלמטה-למעלה לבניית תאים סינתטיים היא כלי יעיל לבידוד ולחקירת תהליכים סלולאריים בסביבה תא מחקה. יתר על כן, הפיתוח של מערכות ביטויים ללא תא הפגינו את היכולת ליצור מחדש את ייצור החלבון, שעתוק ותהליכי תרגום (DNA → RNA ← חלבון) באופן מבוקר, רתימת ביולוגיה סינתטית. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מערכת ביטוי ללא תא, כולל הייצור של ליפוסט בקטריאלי חזק ו encapsulating זה ליפוסט בתוך כולסטרול עשיר מבוסס השומנים ענק unilamellar שלפוחיות (GUVs) (כלומר, ליפוזומים יציבים), כדי ליצור תאים סינתטיים. הפרוטוקול מתאר את השיטות להכנת הרכיבים של התאים הסינתטיים, כולל ייצור ליטים חיידקיים פעילים, ואחריו הכנה מפורטת של שלב אחר שלב של התאים הסינתטיים המבוססים על שיטת העברת אמולסיה בשמן מים. אלה מקלים על ייצור מיליוני תאים סינתטיים באופן פשוט ובמחיר נוח עם רב-תכליתיות גבוהה להפקת סוגים שונים של חלבונים. התאים הסינתטיים המתקבלים ניתן להשתמש כדי לחקור את הייצור של חלבון/RNA ופעילות בסביבה מבודדת, האבולוציה מכוונת, וגם כפלטפורמת משלוח סמים מבוקרת לייצור על פי דרישה של חלבונים טיפוליים בתוך הגוף.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים סינתטיים הם חלקיקים כמו תא מלאכותי, מחקה פונקציות אחת או מרובות של תא חי, כגון היכולת לחלק, אינטראקציה ממברנה טופס, ולסנתז חלבונים על בסיס קוד גנטי1,2,3. תאים סינתטיים התוחמים את התאים ללא חלבון סינתזה (CFPS) מערכות בעלי מודולריות גבוהים בשל יכולתם לייצר חלבונים שונים רצפי RNA לאחר שינויים בתבנית ה-DNA. הצגת חלופה אטרקטיבית לגישות הנוכחיות של ייצור החלבון, מערכות cfps מבוססות על תאי ליפוסט, רכיבים מטוהרים או רכיבים סינתטיים וכוללים את כל מכונות התמלול והתרגום הדרושות לסינתזה חלבונים כגון ריבוזומים, RNA פולימראז, חומצות אמינו ומקורות אנרגיה (למשל, 3-פוספוליגליט ואדלין טריפוספט)4,5,6,7,8,9. האנקפסולציה של מערכת CFPS בתוך שלפוחיות השומנים מאפשר ייצור פשוט ויעיל של חלבונים ללא תלות תא חי10. יתר על כן, פלטפורמה זו מאפשרת סינתזה של פפטידים שעלולים לבזות בתוך תאים טבעיים, ייצור של חלבונים רעילים לתאים חיים, ולשנות חלבונים עם חומצות אמינו לא טבעיות11,12. תאים סינתטיים שימשו כמודל למטרות מחקר החוקרים את רכיבי התא המינימלי הנדרש כדי לאפשר את החיים הסלולריים מנקודת מבט אבולוציונית1,13. תאים סינתטיים גם שימשו כדי לבנות וליישם מעגל גנטי וכמודלים עבור אבולוציה מכוונת14,15,16. מחקרים אחרים התמקדו ביכולת של תאים סינתטיים לחקות את הפעילות הביולוגית של תאים טבעיים, במטרה להחליף תאים טבעיים פגומים, כגון תאים ביתא בחולים עם סוכרת17. יתר על כן, היכולת של אלה CFPS encapsulating תאים סינתטיים כדי לייצר מגוון של חלבונים טיפוליים ממחיש את הפוטנציאל שלה להיות שולבו לשימוש קליני18.

כאן אנו מתארים מלמטה-up פרוטוקול בקנה מידה (איור 1) לייצור של רנ א ו חלבון להפקת תאים סינתטיים מבוסס על מערכת cfps מקומסת ב vesicle השומנים. זה מראה את השימוש הפוטנציאלי של פלטפורמות תאים סינתטיים כמו מערכות משלוח התרופה הרומן לייצור באתר של תרופה לחלבון טיפולית ב vivo19. מחקרים קודמים חקרו את האופטימיזציה של התגובה cfps ואת תהליכי ההכנה של התא ליפוסט4,8,20. יתר על כן, טכניקות מספר הוחלו עבור ליפוכי תא בגודל הכנה, כגון microflu, מבוססי פולימר שיטות ייצוב מבוסס droplet21,22,23, אשר גם שונים ליפוזומים ' הרכב השומנים24,25,26. בפרוטוקול המוצג, תאים סינתטיים מיוצרים באמצעות שיטת העברת אמולסיה בשמן מים ותהליך עטיפת האנקפסולציה מבוצע בטמפרטורות נמוכות (< 4 ° c)5,10,24,27,28. תנאים אלה מתון נמצאו חיוביות עבור שמירה על היושרה הביו תפקודית של המכונות המולקולריות, כלומר ריבוזומים וחלבונים27,29,30. הרכב השומנים של החלקיקים מורכב הן של כולסטרול והן 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC). הראשון נמצא בכל ממברנות התא של היונקים, והוא חיוני עבור יציבות, קשיחות וחדירות הפחתת הקרום, ואת האחרון מחקה ממגלית פוספוליפיד הרכב11,13. תמלול ותרגום מכונות מולקולריות של הסלולר מופקים BL21 (DE3) es, מאמץ קולי (E. coli) זן, אשר הופך עם pAR1219 פלמביטוי יתר T7 RNA פולימראז כדי להגדיל את העוצמה cfps וסינתזה חלבון. מערכת זו שימש כדי לייצר חלבונים אבחון וטיפולי, עם משקולות מולקולרים של עד 66 kda ב מבחנה ב vivo19,31. הפרוטוקול הבא מספק שיטה פשוטה ואפקטיבית לייצור מערכת התאים הסינתטית, שיכולה לענות על מגוון רחב של שאלות עקרוניות הקשורות לסינתזה החלבונים בטבע ויכולה לשמש גם ליישומים של משלוחי סמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: האיור המלא של פרוטוקול הייצור של התאים הסינתטיים מוצג באיור 1. על פי צורכי המשתמש, ביטוי החלבון (סעיף 3.2) והיווצרות תאים סינתטיים (סעיף 4) חלקים מהפרוטוקול יכול להתבצע גם באופן עצמאי (עם כמה עיבודים).

1. הכנת S30-T7 ליפוסט

  1. פס הצלחת ה -E. coli BL21 (DE3) חיידקים השתנה עם T7 RNA פולימראז המבטא pAR1219 פלמיד על צלחת LB-אגר שיושלם עם 50 μg/mL אמפיצילין להשיג מושבות יחיד.
  2. הכנת פתרון המתנע: אינוחסן מושבה אחת לתוך 5 מ ל של LB-מדיה שיושלם עם 50 μg/mL אמפיצילין ב 100 mL Erlenmeyer בקבוקון ולגדול לילה באמצעות החממה שייקר הרצפה ב 250 rpm ו 37 ° c. . הכן כפילויות
  3. לחישוב כל 5 מ ל המתנע בנפרד לתוך 500 mL של מדיה TB בתוספת 50 μg/mL אמפיצילין בקבוקון 2 L Erlenmeyer אייר עם הצקות ולצמוח אותו באמצעות שייקר החממה רצפה ב 250 סל"ד ו 37 ° c עד שהוא מגיע OD600 של 0.8-1. הצג באופן תקופתי באמצעות ספקטרוסקופיה.
  4. הוסף 2-3 mL של 100 mM מלאי של IPTG (כדי להגיע 0.4-0.6 mM) עבור אינדוקציה של T7 RNA פולימראז ביטוי ולהמשיך לגדל את התרבות עד שהוא מגיע OD600≈ 4.
  5. להעביר את הפתרון מכל בקבוקון Erlenmeyer אייר לתוך 2 250 mL לצינורות צנטריפוגה מעוקר.
  6. צנטריפוגה כל אחד ב 7,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את הגלולה החיידקית ב-20 ° c למשך מספר ימים לפני המעבר לשלבים הבאים.
  7. להשעות מחדש כל גלולה ב 250 mL של קר (4 ° צ') מאגר S30 lysate צנטריפוגה ב 7,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    הערה: מאגר S30 lysate משמש לשמירה על יציבות החלבון לאחר הליזה התאים מבוצעת באמצעות הומוגניצר בשלב 1.9. משלב זה קדימה, כל הצעדים עד 1.12 צריך להתבצע ברציפות ובמהירות.
    הערה: לפני שתמשיך לשלב הבא, מגניב מראש את הטיפים ומבחנות 1.5-מיליליטר שיהיה צורך לאחסן את הליפוסט
  8. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את כל כדורי יחד 15 מ ל של מאגר S30 lysate קר. לסנן את ההשעיה באמצעות פד גזה.
    הערה: 15ml של פתרון הוא בשל נפח הומוגניצר min. יש לשים לב כי הריכוז חיידקים הוא גם חשוב.
  9. הומוגון בלחץ העבודה של 15,000 psi, עם לחץ אוויר של 4 בר (שני מעברי) עבור שבירה תא. הימנע דילול הפתרון עבור ליפוסט מרוכז ופעיל יותר.
  10. הוסף 100 μL של 0.1 M DTT (זהירות) עבור 10 מ ל של ההשעיה המהומוגניים.
  11. צנטריפוגה את ההשעיה ב 24,700 x g עבור 30 דקות ב 4 ° c.
  12. בצע את הצעד הבא במהירות עבור שמירה על פעילות ליפוסט: לחלק את supernatant אחד על אחד לתוך 200 μL ali, מקורר בבקבוקונים 1.5 mL ומיד להקפיא אותם עם חנקן נוזלי. חנות at-80 ° c לשימוש נוסף.
    התראה: DTT מסווגת כגירוי ומזיקים, ולכן יש לטפל בהם בזהירות.

2. הכנת שומנים בתמיסה הנפט

  1. התמוססות POPC וכולסטרול ב כלורופורם (זהירות) בנפרד, כל אחד לריכוז סופי של 100 mg/mL. . מערבולת כל בקבוק בנפרד
    1. לשלב את הרכיבים בבקבוקון זכוכית 2mL: להוסיף 50 μL של POPC ב כלורופורם, 50 μL של כולסטרול ב כלורופורם ו 500 μL של שמן מינרלי. עבור 100 μL של תאים סינתטיים, 2 מבחנות של שומנים בשמן נדרשים.
    2. ומערבולת, ואז החום בערך 1 h ב 80 ° c במכסה כימי כדי לאדות את הכלורופורם. ודא כי התאיידות מלאה אירעה על-ידי ביצוע הזמן/תנאים שצוינו וניטור נפח הפתרון.
      הערה: ניתן לאחסן את פתרון השומנים בשמן בטמפרטורת החדר לשבועיים. לקבלת תוצאות משופרות, מומלץ להשתמש בהכנה טרייה לפני כל ניסוי. יחסי השומנים והכולסטרול ניתן לשנות על פי הרכב הממברנה הרצוי. ריכוז גבוה של כולסטרול יכול להוביל להיווצרות אגרגטים בתמיסה הסופית של התא הסינתטי.
      התראה: הכלורופורם מסווג כגירוי ומזיק, ולכן יש לטפל בהם בזהירות ובאזורים עם הפקת מנדפים.

3. ההכנות של פתרונות חיצוניים, טרום פנימיות והאכלה

  1. הכנת פתרונות מניות
    1. הכן את פתרונות המניה המפורטים בטבלה 2 תוך שימוש במים באולטרטהורים (upw).
      הערה: יש להכין פתרונות מניות מראש ולאחסן ב-20 ° c עד שימוש נוסף. מגיב 7 נוטה ליצור אגרגטים. החימום עד 37 ° c יקטין את הצבירה. צבירה קלה לא תשפיע על התגובה באופן משמעותי. מגיב 8 הפתרון הוא חלבי ו turbid.
  2. תמיסה חיצונית
    1. התמוססות גלוקוז ב-DNase/RNase-H חינם2O לריכוז הסופי של 200 מ"מ.
    2. עבור 100 μL של הפתרון הפנימי, להכין 1.6 mL של הפתרון החיצוני.
  3. פתרון טרום-פנימי
    1. הוסף ריאגנטים 1-14 על פי הסכומים והריכוז המפורטים בטבלה 2. לדוגמה, עבור נפח תא סינתטי סופי של 100 μL, הכינו 100 μL של הפתרון הפנימי.
      הערה: יש להוסיף את UPW כדי להשלים את אמצעי האחסון הנדרש הסופי. בשלב זה ניתן לאחסן את התערובת ב -4 ° c למשך מספר שעות.
  4. תמיסת הזנה
    1. מוסיפים את כל הריאגנטים בהתאם לכמויות והריכוז המפורטים בטבלה 3.
      הערה: השתמש 1:1 יחס של פתרון האכלה: הפתרון הפנימי. עבור נפח תא סינתטי הסופי של 100 μL, להכין 100 μL של פתרון האכלה. מומלץ להכין נפח עודף קטן של פתרון חיצוני, פנימי והזנה.

4. הכנת תאים סינטטיים

הערה: אמצעי האחסון הבאים מותאמים להכנה של 100 μL של תאים סינתטיים.

  1. תאים סינתטיים המייצרים חלבון
    1. בצינור 15 מ ל, מקום 12 מ ל של הפתרון החיצוני, לאט להוסיף, על גבי שכבה, של 500 μL של שומנים בפתרון הנפט. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות.
    2. כדי להשלים את הפתרון הפנימי הכנה: לערבב את מרכיבי הפתרון הפנימי על קרח כתוש לנפח הסופי של 100 μL על ידי הS30 והוסיף-T7 Lysate (מגיב 15) ו-DNA פלמיד (מגיב 16) לתערובת המאוחסנת.
    3. לשני 2 mL בקבוקון זכוכית עם 500 μL של שומנים בפתרון הנפט, להוסיף 100 μL של הפתרון הפנימי. הפיפטה עולה ויורדת במרץ לדקה ומערבולת לדקה נוספת בקומה חמש.
      1. דגירה עבור 10 דקות על קרח כתוש ולאחר מכן להוסיף לאט אמולסיה התוצאה על גבי שלב הנפט בצינור 15 מ"ל (מ 4.1.1).
    4. צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 100 x ו 4 ° צ' ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 400 x g ו 4 ° c. עד סוף הצנטריפוגה, יש לצפות בגלולה בתחתית הצינור.
      הערה: שימוש ברוטור צנטריפוגה מנופף בדלי הוא מועדף כאן לרכישת כיסוי טוב יותר של שכבה שנייה של שומנים במהלך מעבר של טיפות מים בשמן ' דרך השלב הפנימי. במקרה שאין שום גלולה הנצפה, מהירות צנטריפוגה יכול להיות מוגבר 1000 x g. אחרת, עיין בסעיף ' דיון ' המתייחס לחומרת החומרה הספציפית של הפתרון החיצוני.
    5. . להוציא את הגלולה
      1. הסר שכבת שמן עודפת.
      2. השתמש עצה פיפטה גזוז טעון עם כ 400 μL של הפתרון החיצוני כדי לחלץ את הגלולה. שחררו את הפתרון החיצוני תוך כדי העברת דרך שלב הנפט כדי לאסוף רק את הגלולה בשלב מימית.
        1. נגב את הטיפ לאחר החילוץ של הגלולה כדי למנוע העברת שאריות נפט ולהעביר את הגלולה לצינור נקי 1.5 mL.
    6. צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 1,000 x ו 4 ° c, להסיר את supernatant ו להשעות מחדש את הגלולה ב 100 μl של האכלה פתרון (1:1 היחס של הפנימי: פתרונות האכלה).
      הערה: ניתן להשתמש גם ברוטור צנטריפוגה בזווית קבועה.
    7. עבור ביטוי חלבון, הדגירה 2 שעות ב 37 ° צ' מבלי לרעוד.
      הערה: זמן דגירה אופטימלי משתנה בין חלבונים שונים.
    8. הערכת כמות החלבון המופקת באמצעות שיטה מתאימה בהתאם למאפייני החלבון המיועד.
  2. קבוצות שליטה מומלצות
    1. הפתרון הפנימי ואישור פעילות ליפוסט
      1. הכינו פתרון פנימי מלא (עם דנ א & S30-T7 lysate).
      2. מיד מודבבת את התגובה לעיל באמצעות החממה הרצפה שייקר ב 250 סל ד או thermomixer ב 1200 rpm, בטמפרטורה קבועה של 37 ° צ' עבור 2 h.
        הערה: כוונן את זמן הדגירה כדי להתאים את זמן הדגירה של תאים סינתטיים.
    2. תאים סינטטיים
      1. קבוצת שליטה שלילית: הכן את הפרוטוקול המוצג ב-4.1 עם הפתרון הפנימי ללא דנ א.
      2. שליטה חיובית: הכן את הפרוטוקול המוצג ב-4.1 עם הפתרון הפנימי המכיל קידוד T7-ביניים עבור גן עיתונאי.
        הערה: הוסף קבוצת בקרה חיובית המורכבת מגנים של כתבת, כגון sfGFP, לצד קבוצות הבדיקה כדי להבטיח את שלב היעילות של האנקפסולציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים סינתטיים על-ידי encapsulating S30-T7 CFPS מערכת מבוסס על BL21 E. coli בתוך שלפוחית השומנים. תיאור סכמטי של תהליך ההכנה הכולל תמונה של כל שלב מוצג באיור 2. הצלחת תהליך ההכנה של התא הסינתטי תלויה בביצועים המתאימים של כל שלב ומושפע מפרמטרים שונים. הפרוטוקול צריך להיות מותאם כדי להתאים את הייצור של חלבון מסוים.

פלמידים ביטוי חלבון מודל סופר תיקיית החלבון פלורסנט ירוק (sfGFP) ו Renilla לluciferase תחת T7 יזם הוכנסו לתוך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ובמחיר נוח לייצור כמויות גדולות של תאים סינתטיים המייצרים חלבונים. התשואה של תאים פעילים תלויה בביצוע קפדני ומדויק של הפרוטוקול עם דגש על מספר שלבים קריטיים. בסעיף ההכנה ליפוסט של שיטה זו, חיוני להגיע לצפיפות החיידקים המתאימה לפני הפירוק התאים כדי להשיג כמות מספקת של חלבונים בתוך הליפוסט החיידקי. שנית, תהליך הפירוק יש לבצע ב 4 ° c ו ליפוסט קפוא במהירות עם חנקן נוזלי לשמור על פעילות החלבון. יתר על כן, בפרוטוקול זה השתמשנו E. coli BL21 (DE3) תאים שהפכו עם pAR1219 פלמיד המבטא T7 RNA פולי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי ERC-STG-2015-680242.

המחברים גם מכירים בתמיכת מרכז הסרטן המשולב של הטכניון (TICC); מכון ראסל ברי לננוטכנולוגיה; המרכז הבינתחומי הראשי למדעי החיים & הנדסה; משרד הכלכלה הישראלי למענק כמאנה (52752); משרד המדע של הטכנולוגיה והחלל – משרד המדען הראשי (3-11878); הקרן הישראלית למדע (1778/13, 1421/17); האגודה הישראלית לסרטן (2015-0116); הקרן הגרמנית-ישראלית למחקר ופיתוח מדעי לגרנט הצעיר GIF (I-2328-1139.10/2012); האיחוד האירופי FP-7 IRG תוכנית עבור מענק אינטגרציה לקריירה (908049); מרכז המחקר פוספוליפיד מענק; קרן רוזנבלט לחקר הסרטן, מלגת קרן משפחת מאלון; וקרן משפחת אונגר. א. שרדר מכיר במלגות אלון וטאוב. א. אדיר מכיר במלגות שרמן וגוטוויה. ז. חן מכיר במלגת שרמן. נ. קרינסקי מכיר בתוכנית הדוקטורט לנשים ברונית אריאן דה רוטשילד מקרן רוטשילד בקיסריה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>A. ריאגנטים נדרשים לשלב 1 (הכנת ליזאט S30-T7)
E.coli BL21 (DE3) NEBC2527E.coli BL21 (DE3).
pAR1219SigmaT2076וקטור TargeTron לטרנספורמציה.
תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל AmpicillinSigmaA9518מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
10 גרם/ליטר בקטו-טריפטוןBD Bioscience 211705להכנת צלחת אגר לוריא ברטאני (LB) (1.5%).
10 גרם/ליטר נתרן כלורי (NaCl)Bio-Lab19030591
5 גרם/ליטר תמצית בקטו-שמריםBD Bioscience 212750
15 גרם/ליטר אגר אגר מטוהרMerck1.01614.5007
50 ומיקרו; גרם/מ"ל אמפיציליןסיגמאA9518
10 גרם/ליטר בקטו-טריפטוןBD Bioscience 211705להכנת מדיה של לוריא ברטאני (LB) (20 מ"ל).
10 גרם/ליטר נתרן כלורי (NaCl)Bio-Lab19030591
5 גרם/ליטר תמצית בקטו-שמריםBD Bioscience 212750
50 ומיקרו; גרם/מ"ל אמפיציליןסיגמאA9518
12 גרם/ליטר בקטו-טריפטוןBD Bioscience 211705להכנת מצע מרק נהדר (TB) (1 ליטר).
24 גרם/ליטר תמצית בקטו-שמריםBD Bioscience 212750
4% (v/v) גליצרולנטול מים Bio-Lab7120501
2.32 גרם/ליטר K2HPO4ספקטרום כימיP1383
12.54 גרם/ליטר KH2PO4ספקטרום כימיP1380
  50 ומיקרו; g/mL AmpicillinSigmaA9518
תמיסת מלאי של 100 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) INALCOINA-1758-1400מסונן באמצעות 0.2 ומיקרו; מ מסנן מזרק PVDF הידרופילי.
תמיסת מלאי של 0.1 M dithiothreitol (DTT) TCID1071מסונן באמצעות 0.2 ומיקרו; מ מסנן מזרק PVDF הידרופילי.
10 מ"מ Tris-אצטט ב-pH = 7.4סיגמאT1503S30 חוצץ ליזאט (1.5 ליטר)
14 מ"מ מגנזיום אצטטMerck1.05819.0250
60 מ"מ אשלגן אצטטקרלו ארבה470147
1 מ"מ DTTTCID1071
0.5 מ"ל/ליטר 2-מרקפטואתנולסיגמאM6250
<חזק>ציוד נדרש לשלב 1
100 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer מעוקרותThermo Scientific50-154-28462 צלוחיות
2 ליטר צלוחיות Erlenmeyer מעוקרות עם בלבולKIMAX-KIMBLE256302 צלוחיות
שייקר חממת רצפהMRCTOU-120-2חממת שייקר מעבדה 450x450 מ"מ, 400 סל"ד, 70 & deg;
C צנטריפוגהתרמו סיינטיפיקטיבית75004270(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX רוטור זווית קבועה.
אמור לאפשר לפחות 13,000 x גרם.        * מקורר מראש ל -4 מעלות צלזיוס.
הומוגנייזר בלחץ גבוהAVESTINEmulsiFlex-C3מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס.
-80oC מקפיאSO-LOWU85-18
צינורות פלסטיק מעוקרים 1.5 מ"לEppendorf30120086רצוי מקורר מראש ל-20 מעלות צלזיוס.
ספקטרופוטומטרTECANIN-MNANOInfinite M200 pro
צלחת שקופה 96 בארותThermo Scientific167008
צילינדר בוגר מעוקרקורנינג
צינורות צנטריפוגה מעוקריםEppendorf30120086רצוי מקורר מראש ל -20 מעלות צלזיוס.
קצות פיפטה מעוקריםקורנינגרצוי מקורר מראש ל -20 מעלות
דלי קרח כתושBel-ArtM18848-4001
מיכל חנקן נוזלי קטןNALGENE4150-4000
<חזק>B. ריאגנטים הנדרשים לשלב 3 (שומנים בהכנת תמיסת שמן):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)ליפואיד556400אבקת
כולסטרולסיגמאC8667אבקת
כלורופורםביו-מעבדה3082301
שמן מינרליסיגמאM5904שמן
קל<חזק>ציוד הנדרש לשלב 2
מערבל מערבולתתעשיות מדעיותSI-0256
בלוק חימוםTECHNEFDB03ADמחומם מראש ל-80&< מעלות צלזיוס/> אמור לאפשר טמפרטורה מבוקרת. 
בקבוקוני זכוכית עם צוואר בורג 2 מ"לCSI חידושים אנליטייםVT009M-1232לקנה מידה גדול יותר, השתמש בבזים של 50 מ"ל ואידה את הכלורופורם באמצעות מאייד סיבובי.
מכסה בורג 9 מ"מCSI חידושים אנליטייםC395R-09LC
strong>C. ריאגנטים הנדרשים לשלב 3 (תערובות תגובה פנימיות והזנה):
HEPESSpectrumH10891 M HEPES-KOH (pH = 8) - חוצץ pH
אשלגן הידרוקסיד (KOH)פרוטרום55290
1 M מגנזיום אצטטMerck1.05819.0250קו-פקטור ומייצב מטען שלילי.
1 M אשלגן אצטטקרלו ארבה470147מייצב מטען שלילי.
5.2 M אמוניום אצטטMerck1.01116.1000מייצב מטען שלילי.
50% (w/v) פוליאתילן גליקול 6000 (PEG)Merck8.07491.1000מגדיל את ריכוז המקרומולקולות.
0.5 M 3-פוספוגליצרט (3-PGA)SigmaP8877מקור אנרגיה משני.
50 מ"מ תערובת חומצות אמינו ISigmaLAA21-1KT.
מכיל: 50 מ"מ מכל אחת מחומצות האמינו הטבעיות הבאות - אלנין, ארגינין, אספרגין, חומצה אספרטית, ציסטאין, גלוטמין, חומצה גלוטמית, גליצין, היסטידין, איזולאוצין, לאוצין, ליזין, מתיונין, פרולין, סרין, תראונין וואלין.
50 מ"מ תערובת חומצות אמינו IISigmaLAA21-1KTתוסף חומצות אמינו.
מכיל: 50 מ"מ מכל אחת מ-3 חומצות האמינו הטבעיות הבאות - טריפטופן, פנילאלנין וטירוזין.
100 מ"מ אדנין טריפוספט (ATP)SigmaA3377נוקלאוטידים ומקור אנרגיה.
50 מ"מ גואנידין טריפוספט (GTP)SigmaG8877נוקלאוטידים ומקור אנרגיה.
100 מ"מ אורידין טריפוספט (UTP)ACROS ORGANICS226310010תוסף נוקלאוטידים.
100 מ"מ איזופרופיל ובטא;-D-1-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG)INALCOINA-1758-1400אינדוקציה לביטוי גנים.
2 מ' סוכרוזג'יי טי בייקר1933078יצירת שיפוע צפיפות.
2 M גלוקוזסיגמא16301יצירת שיפוע צפיפות.
H2O מים טהורים במיוחד (UPW)Bio-Lab2321777500DNase & RNase
חינם S30-T7 lysate__מוכן בשלב 1.                                                                                                                                              מקור התמלול & רכיבי תרגום.
חנות ב-80 מעלות; ג, להפשיר על קרח שהתרסק ממש לפני השימוש. 
מלאי של פלסמיד DNA לבחירה__מכיל את הרצף של החלבון המבוקש.
תחת מקדם T7
D. ציוד הנדרש לשלב 4 (הכנת תאים סינתטיים)
שייקר אינקובטור רצפה או ThermomixerMRCTOU-120-2אינקובטור שייקר מעבדה 450x450 מ"מ, 400 סל"ד, 70 מעלות; C
PHMT גרנט ביו PSC18Thermomixer
צנטריפוגהתרמו סיינטיפיק75004270(75003629) - TX-400 4 x 400 מ"ל רוטור דלי מתנדנד.
מתאים לצינורות בגודל 15 מ"ל.
רצוי דליים מתנדנדים.
צריך לאפשר לפחות 1000 x g.
מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס.
צנטריפוגה שולחניתThermo Scientific75002420(75003424) - רוטור 24 x 1.5/2.0 מ"ל עם ClickSeal.
מתאים לבקבוקוני Eppendorf.
מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס.
מערבל מערבולתתעשיות מדעיותSI-0256
דלי קרח כתושBel-ArtM18848-4001
בקבוקוני זכוכית 2 מ"ל צוואר בורגCSI חידושים אנליטייםVT009M-1232
צינורות פלסטיק סטריליים 15 מ"לThermo Scientific339651
צינורות פלסטיק מעוקרים 1.5 מ"לEppendorf30120086
קצות פיפטה מעוקריםקורנינגמעוקר על ידי חיטוי.
, , , צלזיוס.< תוסף חומצות אמינו

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
  2. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
  3. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  4. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  5. Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
  6. Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
  7. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  8. Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
  9. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  10. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  11. He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
  12. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  13. Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
  14. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  15. Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
  16. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
  17. Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
  18. Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
  19. Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).
  20. Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
  21. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
  22. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  23. Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
  24. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).
  25. Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
  26. Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
  27. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  28. Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
  29. Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  31. Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).
  32. Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).
  33. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  34. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  35. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).
  36. Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167(2017).
  37. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים