קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיברוזיס של הלב בתגובה לפציעה היא תגובה פיזיולוגית לריפוי הפצע. המאמצים נעשו כדי ללמוד ולמקד את סוגי בפיברוהפיצוץ המרכך פיברוזיס. עם זאת, מחקר פיברולפיצוץ כבר הפריע בשל חוסר של סמנים מקובלים בגידולים המקובלים לזהות שקט כמו גם הפעלת פיברופיצוצים. פיברותקיעות הם אוכלוסיית תאים הטרוגניים, מה שמקשה עליהם לבודד ולאפיין. הפרוטוקול המוצג מתאר שלוש שיטות שונות להעשיר את הגידולים השונים והמייופיברוונים מלבבות העכבר הפצועים. באמצעות פרוטוקול רגיל ואמין כדי לבודד הפיברוכדורים יאפשר לימוד תפקידם הומאוסטזיס כמו גם פיברוזיס אפנון.
מבוא
פיברותקיעות לב, תאים של מוצא mesenchymal, לשחק תפקיד משמעותי בשמירה על הולכה חשמלית וכוחות מכניים בלב בנוסף תחזוקה של אדריכלות לב במהלך הומאוסטזיס1. בעקבות פציעה, תאים אלה מופעלים, להרחיב, ולייצר מטריצה החילוץ (ECM) חלבונים2. מחקרים רבים קדם קליניים חשפו פיברומופיצוצים כמו הרגולטורים הסלולר קריטי השומרים על השלמות המבנית של הלב הפצוע3 , כמו גם התאים העיקריים אפקטור אחראי על ייצור לא מסומנת והפקדת חלבונים ecm, וכתוצאה מכך היווצרות צלקת נוקשה אי ספיקת לב4. פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מה שהופך אותו מאתגר לנתח את הפונקציה שלהם מתמנת מפני מאפיינים מסתגלת pro-פיברוטיק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה מקיים בקפדנות את ההמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט אישרה את הפרוטוקול (מספר פרוטוקול: M1600076-01).
1. ניתוח לב
- הכנה לפתרון
- מאגר KHB
- באמצעות מהומה בר, לאט לפזר 9.4 g של מאגר Krebs-Henseleit (KHB) אבקה ב 900 mL של מים DDI.
הערה: המאגר יקצר אם הוא מעורבב מהר מדי או במשך זמן רב מדי. מאגר KHB חייב להיות קר במהלך בידוד פיברוהפיצוץ. - הוסף 2.9 mM CaCl2 ו 24 מ"מ נחקו3. כוונן את ה-pH ל-7.2 – 7.3 ודלל לנפח של 1 ל' עם dH2O.
- שימוש במסנן סטרילי (0.22 μm), מא....
- באמצעות מהומה בר, לאט לפזר 9.4 g של מאגר Krebs-Henseleit (KHB) אבקה ב 900 mL של מים DDI.
- מאגר KHB
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מערכת זרימה להפגנת בידוד מיופיברופיצוץ באמצעות עכברים αSMA-GFP
לבבות שלא נפגעו הראו לא ניתן לגילוי בתאי הαSMA-gfp במודל העכבר העיתונאי; מכאן, הם שימשו להקמת שער לאות הרקע של הערוץ GFP לאחר פיצוי (איור 2). αSMA+ תאים ממוינים בהתבסס על נוכחות של ביטוי gfp מן החדר השמאלי פצועים 10 ימים אחרי MI. אחוז קטן של אנדותל (GFP +/cd31 + תאים; SD = 3.8% ± 0.0164; n = 5) והמטפיאה (GFP +/cd45 + תאים; SD = 3.18% ± 0.0112; n = 5) התאים הביעו גם GFP בליבם הפגוע αSMA-GF.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מזוהה על ידי קבוצה מגוונת של סמנים. סמני החלבון ששימשו לזיהוי פיברוהטיים הם discoidin לקולטן תחום 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, קולגן אני ו III, ו Thy115,16,17,18,19,20. בעוד vimentin נעשה שימוש כדי לזהות השקט השקטים ביותר, חלבון פיברוביסט, חלבונים ספציפיים αSMA, ו-קרום הגוף הוכחו לז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים רוצים להודות ד ר איבו Kalajzic עבור העכברים αSMA-GFP. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות (NIH) תחת הפרס מספר R01GM118300 (האס), המכון הלאומי להדמיה ביו-רפואית וביוהנדסה של NIH תחת הפרס מספר R21EB019509 (P.P.Y.), ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני תחת הפרס מספר 17SDG33630187 (אס). מנתח זרימה cy, בוצעו ב-VUMC זרימה Cy, משאב משותף אשר נתמך על ידי מרכז הסרטן של ואנדרבילט Ingram (P30 CA68485) ואת מחלת העיכול ואנדרבילט מרכז המחקר (DK058404).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <ריאגנטים חזקים> | |||
| אצטון | |||
| אנטי פטרייתי (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| בקר סריום אלבומין (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| סידן כלוריד | |||
| ציטראט בופר | |||
| תערובת קולגנאז (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI מים | |||
| מי | |||
| DMEM-F12 עם טכנולוגיות L-גלוטמין ו-HEPES | Life | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | ||
| Phosphate-Buffered Sas (dPBS) ללא Ca2+ ו-Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| חוסם אתנול | |||
| FC 70% (מטוהר אנטי עכבר CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Life Technologies | 16000044 | |
| 10% סרום | |||
| תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) עם Ca2+ ו-Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit אבקת חיץ | Sigma | K3753 | |
| מיקופלזמה מניעתית (פלסמוצין) | Invivogen | ant-mpp | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | תרמו פישר 15140122 | ||
| 1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS) | |||
| 10x מאגר ליזה של תאי דם אדומים | Miltenyi | 130-094-183 | |
| מדיה | הרכבה באיטיות | ||
| נתרן אזיד | |||
| נתרן ביקרבונט | |||
| TGF ובטא; | |||
| כתם כחול טריפן (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| קולגן | |||
| <חזק>נוגדנים | |||
| 7AAD (מלאי: תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל ב-DMSO) | בדיקות מולקולריות | דילול A1310 | = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | דילול = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | דילול = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | דילול = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD | 553076 | דילול = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α 1 | MD Bioproducts | 203002 | דילול = 1:1000; RRID = |
| צבע רפאים סגול 510 (ניסוח: 1 uL/בדיקה ב-DMSO) | דילול Tonbo Biosciences | 13-0870 | = 1:1000; RRID = |
| עיזים נגד עכבר Alexa Fluor 488 | בדיקות מולקולריות | A11029 | דילול = 1:200; RRID = AB_138404 |
| עז נגד ארנב-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | דילול = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| עיזים נגד ארנבות-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | דילול = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| עיזים נגד חולדות Alexa Fluor 488 | בדיקות מולקולריות | A11006 | דילול = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| עיזים נגד חולדות Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | = 1:200; RRID = AB_141778 |
| פריוסטין | סנטה קרוז | SC67233 | דילול = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| דילול Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | = 1:200; RRID = AB_261856 |
| &אלפא;-אקטין שריר חלק (αSMA) | דילול סיגמא אולדריץ' | A2547 | = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| חלבון ספציפי לפיברובלסטים 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | דילול = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 חרוזים מגנטיים | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 חרוזים מגנטיים | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| תאים נגד הזנה-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | דילול = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| חרוזים נגד APC | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| עכברוש IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | דילול = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| חמור נגד חולדות Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | דילול = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | דילול = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| <חזק>חומרים אחרים | |||
| 0.22 ומיקרו; m פילטר | תרמו מדעי | 723-2520 | |
| 10 ס"מ צלחת תרבית תאים | קורנינג | 430167 | |
| 10 מ"ל | פיפט פישרברנד | 13-678-11E | |
| 40 ומיקרו; m מסננת תאים | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 מ"ל Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי | Falcon | 352070 | |
| 6 בארות צלחת | קורנינג | 3506 | |
| צינורות ציטומטריה זרימה | Falcon | 352058 | |
| מלקחיים | |||
| נדנדה | |||
| להב קצה יחיד | PAL | 62-0177 | |
| מספריים כירורגיים | |||
| GFP-αSMA מדווח עכברים | |||
| MACS מפריד שדה | |||
| MACS הפרדת עמודה | |||
| כיסויי | |||
| Qaigen Rneasy מיני ערכת | Qaigen | 74104 | |
| אמביון RNAqueous מיקרו בידוד מוחלט ערכת | אמביון | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48 בארות צלחת | |||
| 30G מחט | |||
| 3 מכונת ציטומטריה זרימת לייזר (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 זרימת לייזר מכונת ציטומטריה (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquisition Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
מקורות
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Rese....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
