הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

15.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60909

⸱

12 במרץ 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

במאמר זה

סיכום

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

תקציר

פיברוזיס של הלב בתגובה לפציעה היא תגובה פיזיולוגית לריפוי הפצע. המאמצים נעשו כדי ללמוד ולמקד את סוגי בפיברוהפיצוץ המרכך פיברוזיס. עם זאת, מחקר פיברולפיצוץ כבר הפריע בשל חוסר של סמנים מקובלים בגידולים המקובלים לזהות שקט כמו גם הפעלת פיברופיצוצים. פיברותקיעות הם אוכלוסיית תאים הטרוגניים, מה שמקשה עליהם לבודד ולאפיין. הפרוטוקול המוצג מתאר שלוש שיטות שונות להעשיר את הגידולים השונים והמייופיברוונים מלבבות העכבר הפצועים. באמצעות פרוטוקול רגיל ואמין כדי לבודד הפיברוכדורים יאפשר לימוד תפקידם הומאוסטזיס כמו גם פיברוזיס אפנון.

מבוא

פיברותקיעות לב, תאים של מוצא mesenchymal, לשחק תפקיד משמעותי בשמירה על הולכה חשמלית וכוחות מכניים בלב בנוסף תחזוקה של אדריכלות לב במהלך הומאוסטזיס1. בעקבות פציעה, תאים אלה מופעלים, להרחיב, ולייצר מטריצה החילוץ (ECM) חלבונים2. מחקרים רבים קדם קליניים חשפו פיברומופיצוצים כמו הרגולטורים הסלולר קריטי השומרים על השלמות המבנית של הלב הפצוע3 , כמו גם התאים העיקריים אפקטור אחראי על ייצור לא מסומנת והפקדת חלבונים ecm, וכתוצאה מכך היווצרות צלקת נוקשה אי ספיקת לב4. פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מה שהופך אותו מאתגר לנתח את הפונקציה שלהם מתמנת מפני מאפיינים מסתגלת pro-פיברוטיק. לאחרונה, הטרוגניות תפקודית של שני תת שונים בפיברוהפיצוץ בעקבות פציעה שריר הלב הוגדרו, המציין את האפשרות של בידוד שונים סוגי הפיצוץ בפיברומות ולימוד תפקידם בפצע ריפוי5.

קבלת האוכלוסייה טהור פיברוהפיצוץ הוא חיוני בתיחום התפקיד הפונקציונלי שלהם בתיקון פיברוזיס. עם זאת, הנוכחות של סמנים מרובים פיברומסט המכירים סוגי תאים אחרים להפוך אותו מאתגר לבודד את האוכלוסייה טהור באופן משמעותי הפיברובלסט6. מספר מחקרים אלגנטיים המציאו דרכים חכמות כדי לבודד פיברוהכדורים מפני שריר הלב נפצע ופצע. השיטה הפופולרית ביותר ומבוססת היטב של העשרת הגידולים היא דרך הדבקה סלקטיבית בעקבות עיכול הרקמה האנזימטית7.

בנוסף, מיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) של פיברותקיעות מבוסס על משטח תאים אנטיגנים שתוארו בהצלחה8. במחקר, בעקבות העיכול האנזימטי, התאים המסנכטיים ממוינים כשושלת שלילית (לין: Ter119-CD45-CD31-) וgp38-חיובי (gp38+)מלבבות העכבר. Gp38+ ve תאים אושרו להיות פיברופיצוצים מבוסס על שיתוף הביטוי שלהם של col1α1 וסמנים mesenchymal אחרים. למרות שרוב העיכול הרקמות מושלם לאחר שהוא מבתר את החדר בצלחת פטרי, מחקר שנערך לאחרונה חקר את השימוש במחט האנזים הישיר של החדר השמאלי כדי לבודד מיוציטים ולא מיאלוציטים אשר כוללים פיברופיצוצים9. במקרה זה בודלו באמצעות הדבקה סלקטיבית.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד וההעשרה של הפיברותקיעות בשלוש שיטות. הראשונה היא שיטה מבוססת הכוללת הדבקה סלקטיבית של פיברומטיות בעקבות העיכול האנזימטי. השיטה השנייה משמש בעיקר בידוד פציעה המושרה אלפא שרירים המבטא מיופיברופיצוצים. השיטה השלישית כוללת רציפים, דלדול מגנטי של השעיית תאי לב אנזימים מתעכלים של תאי המטפאות ואנדותל. בעקבות דלדול, פיברותקיעות/מיופיברופיצוצים מבודדים מבוסס על נוכחות של אנטיגן MEFSK4 באמצעות חרוזים מגנטיים. לאחרונה, MEFSK4 תוארה כאנטיגן נוכח על השקט כמו גם הפעלת פיברותקיעות, מה שהופך אותו סמן מתאים לזיהוי פיברוהפיצוץ ובידוד. כמובן, לכל השיטות המתוארות כאן יש מגבלות ייחודיות. לכן מומלץ מאוד לבדוק את הטוהר של אוכלוסיית התאים המבודדים באמצעות ניתוח זרימה, כתמים, וכמותי למחצה-PCR בזמן אמת. עם זאת, ניתן להרחיב את המתודולוגיות הללו, וניתן להוסיף סמנים נוספים כדי שלא לכלול אוכלוסיות מזהם אחרות לפני ניצול הפיברוהפיצוץ ואוכלוסיות מיופיברומות לניסויים מכריעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה מקיים בקפדנות את ההמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט אישרה את הפרוטוקול (מספר פרוטוקול: M1600076-01).

1. ניתוח לב

  1. הכנה לפתרון
    1. מאגר KHB
      1. באמצעות מהומה בר, לאט לפזר 9.4 g של מאגר Krebs-Henseleit (KHB) אבקה ב 900 mL של מים DDI.
        הערה: המאגר יקצר אם הוא מעורבב מהר מדי או במשך זמן רב מדי. מאגר KHB חייב להיות קר במהלך בידוד פיברוהפיצוץ.
      2. הוסף 2.9 mM CaCl2 ו 24 מ"מ נחקו3. כוונן את ה-pH ל-7.2 – 7.3 ודלל לנפח של 1 ל' עם dH2O.
      3. שימוש במסנן סטרילי (0.22 μm), מאחסן ב-4 ° צ' עד 4 שבועות. המשיכו בקרח או בארבע מעלות צלזיוס למשך הבידוד.
    2. קולגנאז קוקטייל עיכול
      1. הכינו קוקטייל עיכול ביום של בידוד פיברובלסט. לקבוע את הנפח המתאים של קוקטייל העיכול בהתאם למספר לבבות; 5 מ ל של קוקטייל לכל 1 לב.
      2. הכנת מיזוג הקולגן (ראה טבלת חומרים) ו-DNase אני על פי הוראות היצרן.
      3. עבור 20 מ ל של קוקטייל העיכול הכולל, להוסיף 17.5 μL של DNase I, 180 μL של 1 M HEPES, ו 500 μL של הקוליטאז כדי ל50 רוקן את צינור ה-mL.
      4. הוסף נפח מספיק של הפתרון של מלח מאוזן של האנק (HBSS) עם Ca2 + ו-Mg2 + כדי להשיג נפח כולל של 20 מ ל.
    3. מאגר לליזה תא דם אדום (RBC)
      1. קבע את הנפח הכולל הדרוש בהתבסס על מספר לבבות (5 מ ל/לב). דלל את מאגר המלאי של 10 x RBC לפירוק 1x באמצעות dH2O.
    4. מדיה פיברובלסט: 10% FBS בשנת DMF-12
      1. הוסף 10% FBS כדי Dמאמ-F12 עם L-גלוטמין ו-HEPES. הוסף/י/סטרפטומיצין/מניעת הפניצילין (ראה טבלת חומרים), 2.5 μg/ml נגד פטריות, 2.5 μg/ml. חנות ב -4 ° c.
  2. ניתוח לב
    1. הכינו צלחת 6 היטב על הקרח עם 2 מ ל של KHB קר לכל טוב לאחסן לבבות במהלך הניתוח. שימוש אוטומטי מספריים ומלקחיים כירורגיים.
    2. להרוג עכברים בגיל 12 ומעלה על ידי מנת יתר של isofלוריאן, ולעקוב אחר פריקה צוואר הרחם.
    3. לחילופין, עבור הבידוד המופעל בידוד, לגרום אוטם שריר הלב ב 12 שבועות עכברים ישנים על ידי העברה עורק כלילי10. המתת חסד העכברים 8 – 10 ימים לאחר הפציעה.
    4. תרסיס גוף עם 70% אתנול ו המזרח כך הצד הגחוני פונה לניסויים. להצמיד או לרסן תוספות כדי למנוע הפרעות.
    5. חותכים את עור הבטן ואת השריר פתוח אבל להימנע פירסינג בכבד. חותכים אנכית לכיוון עצם החזה, ופותחים בזהירות את החזה תוך הימנעות פירסינג של הלב. המשיכו לחתוך את הצלעות. כדי לחשוף את הלב
    6. באמצעות מלקחיים, להרים בעדינות את הלב מתוך החזה, לחתוך את כל הריאות או רקמות עודף המצורפת אל מחוץ ללב. להסיר את החדר ואת המקום בבאר אחת של 6 צלחת היטב עם KHB קר. המשך לנתח את הלבבות באופן זה עד שכל הדגימות מבודדות.
  3. דיסוציאציה של לב אנזימטית
    1. באמצעות מלקחיים, לסחוט שוב ושוב מתפרעים את הלב ב-KHB כדי להסיר עודף דם. העבר את הלב לצלחת נקייה של 10 ס מ2 . באמצעות להב בודד קצה, במהירות להחיש את הלב לחתיכות קטנות.
    2. להוסיף 1 מ ל של הקולגן העיכול קוקטייל ולהמשיך מועט עד חתיכות קטנות מספיק כדי להעביר עם 1 mL מיקרופיפטה. להעביר חתיכות לצינור 50 mL עם מיקרופיפטה 1 mL. לשטוף את הצלחת 2x עם 2 מ ל של הקולגן העיכול קוקטייל.
      הערה: גזירת חלק מעצת הפיפטה יכולה לסייע באיסוף פיסות לב גדולות יותר שעלולות להיתקע בקצה הפיפטה.
    3. מיכל הצינור החרוט ב 37 ° c במשך 30 דקות עם נדנדה או עצבנות. . צינור מאובטח לפי הצורך השהה מחדש 10x עם 5 מ ל מחית מחמד עד שהתוכן הינו הומוגניים, והוא משלב את צינורית החרוט ב-37 ° צ' במשך 15 דקות עם סיבוב או עצבנות.
    4. השהה מחדש 10x עם מחית 10 mL עד הומוגנית. פריים 40 יקרומטר מסננת תא על ידי הרטבת את המסנן עם 1 – 2 מ ל של מאגר khb על גבי צינור חדש 50 mL חרוט. הוסף 25 מ ל של מאגר khb כדי השעיית העיכול, השעיה מחדש, ולסנן דרך מסננת תא מ40 יקרומטר. שנה את המסנן בהתאם לצורך.
      הערה: כאשר סינון מאט, הקשה בקלות על צינור או באמצעות מיקרופיפטה 1 mL כדי לצייר השעיה מהצד התחתון של מסנן יכול לעזור ההשעיה תא לעבור דרך מסננת התאים חסומים חלקית 40 יקרומטר.
    5. צנטריפוגה ב 400 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה במאגר להסרת 1 x rbc (5 מ ל/לב). דגירה עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    6. צנטריפוגה ב 400 x g ו RT עבור 10 דקות. הסר supernatant ולאחר מכן לשטוף על ידי השעיית גלולה 1 מ ל של מאגר khb.
    7. הוסף 9 מ ל של מאגר khb ומסנן דרך מסננת תא מ40 יקרומטר לתוך צינור חדש 50 mL. צנטריפוגה ב 400 x g ו RT עבור 10 דקות.
    8. הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש 1 מ ל של מדיה בפיברובלסט או PBS, וקבע את מספר הטלפון. ניתן לבודד את הפיברותקיעות בשלוש השיטות השונות המתוארות להלן.

2. בידוד של פיברותקיעות מתא יחיד הבולם

  1. בידוד פיברובלסט: ציפוי משלים (איור 1)
    1. הכינו צלחת 6-היטב על-ידי הוספת 2 מ ל של מדיה פיברולפיצוץ לבאר ומתערבל את הצלחת לכסות את התחתון היטב.
    2. השהה תאים מחדש ב-1 מ ל של מדיה בכל לב. צלחת 1 מ ל של השעיית תא בצורה כזו שהלב (תיאורטית) מצופה בטוב. לדוגמה, שישה לבבות יהיה מושהה מחדש 6 מ ל של מדיה, ולאחר מכן מצופה שש בארות עם 1 mL של השעיית תא לכל טוב.
    3. צלחת מערבולת כדי לפזר תאים באופן שווה. הוסיפו מדיה נוספת של 1 – 2 מ ל לכל היותר עבור נפח כולל של עד 5 מ"ל לכל טוב, ו-מודטה ב 37 ° c עבור 4 h.
    4. פיברותקיעות תהיה מופרדת על ידי הדבקה סלקטיבית לאחר 4 שעות. הסר תאים שאינם מחוברים ומתים על-ידי הסרת מדיה. שטוף תאים מחוברים עם 2 מ ל של PBS ולהוסיף 2 – 4 מ"ל מדיה סטרילית הפיצוץ החיטוי לכל טוב. מודטה ב 37 ° c עד שוטפת. שנה את המדיה כל יומיים עד 4 ימים.
  2. בידוד פיברובלסט: FACS באמצעות מודל העכבר הכתבת GFP (איור 1)
    1. מאגר FACS
      1. להכין 15 מ ל של 5% סרום בפרה עוברית (FBS) ב dPBS ללא Ca2 + ו-Mg2 +. החנות בקרח או ב -4 ° c.
    2. פתרון חוסמי FC
      1. הכינו 0.5 μL חוסם FC (מטוהרים נגד עכבר CD16/CD32) ב 25 μL של FACS (1:50 דילול). 25 μL של פתרון חוסמי FC נדרש לכל מדגם. החנות בקרח או ב -4 ° c.
    3. הכנה לדוגמה ומכתים נוגדנים
      הערה: הנוגדן יכול להיות מוכן מראש, אבל זה עלול לסכן אור או טמפרטורה חשיפה.
      1. הכינו 7AAD מ או צבע רפאים סגול 510 כי הוא 2x הדילול הנדרש מאגר FACS. ראו שולחן 1 לנוגדנים ולדילול.
      2. השהה מחדש 500,000 תאים מבודדים טריים ב 25 μL של פתרון חוסם FC כדי למנוע איגוד ספציפי של אזור הנוגדן FC לקולטן FC. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
      3. הוסף 7AAD מ או צבע רפאים סגול 510 נוגדן לנפח הסופי של 25 μL של השעיית תא. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך.
      4. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
      5. השהה מחדש את הגלולה בזרימה המומלצת cy, try לדוגמה נפח של מאגר FACS (300 μL) והעברה לצינור הצינורית cy, לזרום.
    4. מיון תאים עם הפעלה פלואורסצנטית (FACS)
      הערה: עכברים מכתב GFP-αSMA היו תרומה של ד ר איבו קאלאג'זץ '11. עכבר זה מבטא GFP תחת תא אלפא שריר חלק (αSMA) מקדם. αSMA שימש כסמן של הפיברוכדורים המופעל (מיופיברופיצוצים)12.
      1. עבור פיברובלסט המופעל (αSMA ביטוי מיופיברופיצוץ) בידוד, לגרום אוטם שריר הלב בתוך 12 השבוע בן GFP-αSMA עכברים על ידי הארכה עורק כלילי. להקריב את העכברים 8 – 10 ימים לאחר הפציעה.
      2. בעקבות השעיה תא יחיד מן הלבבות עכברים פצועים, למיין αSMA+ ve פיברופיצוצים עבור חלבון פלורסנט ירוק (gfp). השתמש בפיברופיצוצים לא מוכתמות כדי להגדיר את אות הרקע בפיצוי שלאחר התשלום בערוץ GFP.
      3. שער לחיות GFP+ ve תאים על ידי המשך 7aad מ-ve/gfp+ תאים או צבע רפאים סגול 510-ve/GFP+ Ve תאים ולמיין gfp המבטא αSMA+ ve מיופיברופיצוצים. לאסוף את התאים בתקשורת פיברובלסט.
  3. בידוד פיברובלסט: בידוד מגנטי מבוסס חרוז של פיברותקיעות (איור 1)
    1. מאגר שיווציה
      הערה: הכינו תמיד מאגר טרי לבודדים.
      1. להכין 0.5% BSA ו 2 מ"מ EDTA ב-PBS. דגה את המאגר על ידי ערבוב הפתרון תוך הצמדת ואקום למכסה של המיכל.
        הערה: הערבוב מסיר גזים עודפים מהפתרון שהוסר לאחר מכן דרך הוואקום, כך שבועות לא סותמים את עמודת ההפרדה בעת השימוש.
    2. תיוג מגנטי: CD45+ תאי המטפאות
      1. צנטריפוגה תאים מבודדים מן עכברים לבבות ב 500 x g עבור 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
      2. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של מאגר שיווציה. לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
      3. צנטריפוגה את ההשעיה התא כמו מעל והשהה מחדש את הגלולה תא ב 90 μL מאגר משקל לכל 1 x 107 כולל תאים. הוסף 10 μL של CD45+ חרוזים מגנטיים לכל 1 x 107 כולל תאים. מערבבים היטב ומשלבים לפחות 15 דקות ב -4 ° c.
      4. לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ ל מאגר משקל עבור 1 x 107 סך הכל תאים, אז צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
      5. הסר supernatant, לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר לשחזר עד 1 x 107 כולל תאים ב 2 מ ' של מאגר שיווציה. אם יותר מ-10שבעה תאים קיימים, קנה מידה ליניארי של המאגר. העבר תאים באמצעות מסנן של 40 יקרומטר כדי למנוע צבירות של תאים מסתימת מטריצת עמודת ההפרדה.
    3. הפרדה מגנטית: CD45+ תאי המטפאות
      1. מקם את עמודת ההפרדה בשדה המגנטי של מפריד מתאים ועמודה מתאימה עם לפחות 3 מ ל של PBS.
      2. לאסוף תאים ללא תווית ב flowthrough (FT), ולשטוף את העמודה 3x עם 3 מ ל של מאגר שיווציה. איסוף שוטף עם FT. הסר את העמודה ממפריד. מקם את העמודה בשפופרת חרוט של 15 מ ל.
      3. לרוקן את התווית CD45+ תאים על ידי ליטוף 5 מ ל של מאגר שיווציה על העמודה ואת צולל בחוזקה את התאים עם בוכנה שסופקו עם העמודה.
      4. משחרר הצנטריפוגה, כמו גם FT/לשטוף שברים ב 500 x g. לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
    4. תיוג והפרדה מגנטיים: CD31+ תאים אנדותל
      1. לחזור על הפרוטוקול עבור CD45+ מגנטי תיוג והפרדה (סעיפים 2.3.2 – 2.3.3), למעט להשתמש בחרוזים CD31+ מגנטי כדי לדגירה עם FT ולשטוף חלקים מCD45+ בידוד.
    5. תיוג והפרדה מגנטיים: MEFSK4+ פיברותקיעות
      1. הפרוטוקול חזור על CD45+ תיוג מגנטי באמצעות הנוגדן MEFSK4 anti-משתמש-APC במקום חרוזים מגנטיים. צנטריפוגה את FT ולשטוף חלקים מן CD31+ בידוד ב 500 × g עבור 5 דקות, ואז להסיר supernatant. השהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של מאגר שיווציה, וספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
      2. הוסף 10 μL של MEFSK4 anti-מאכיל-APC עבור 1 x 107 תאים. מודטה לפחות 15 דקות ב -4 ° c.
      3. לשטוף את התאים MEFSK4 נוגדן על ידי הוספת 5 מ ל של מאגר equilibration לכל 1 x 107 כולל תאים, ואז צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
      4. הסר supernatant ולהשעות מחדש בחרוזים נגד APC, באמצעות אותו כמות של MEFSK4 anti-מאכיל-APC בשימוש. מודקון על הקרח במשך 15 דקות ב -4 ° c.
      5. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות. הסר supernatant, להשעות מחדש ב 2 מ ל של מאגר שיווציה לכל 1 x 107 כולל תאים, ולהמשיך עם הפרדה מגנטית כפי שתוארה בעבר (סעיף 2.3.3). מגנטוסטי מופרדים MEFSK4+ ve/CD45-ve/cda 31-ve פיברותקיעות יכול לשמש ניתוח טוהר ויישומים אחרים במורד הזרם.

3. בדיקת טוהר ופונקציונליות של אוכלוסיית פיברובלסט מבודדים

  1. ניתוח טוהר של אוכלוסיית FACS: αSMA-GFP ניתוח תאים (איור 2)
    1. השהה מחדש תאים מבודדים טריים ב -25 μL של הפתרון של חוסם Fc כדי למנוע את האיגוד הלא ספציפי של נוגדנים. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
    2. אופציונלי: להוסיף 25 μL של 7AAD מ או צבע רפאים סגול 510 להשעיה התא. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך.
    3. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
    4. השהה מחדש את הגלולה ב-50 μL של מאגר FACS. הוסף CD31-PE, CD45-APC, ו AN2/NG2 נוגדנים ישירות ההשעיה התא. דגירה עבור 15 דקות על הקרח (שולחן 1).
    5. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
    6. הוסף חמור נגד חולדה AlexaFluor 405 נוגדן משני לתאים המסומנים עם נוגדן ראשוני מצועם. מודקון למשך 30 דקות על הקרח.
    7. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
    8. השהה מחדש את הגלולה בזרימה המומלצת cy, try לדוגמה נפח של מאגר FACS (300 μL) והעברה לצינור שכותרתו הזרמת cy, לצורך ניתוח זרימה.
      הערה: ניתוח FACS כדי לאפיין את הביטוי של אנטיגן MEFSK4 על פיברותקיעות מבודדים מתואר בסעיף 3.3.
  2. ניתוח טוהר פיברובלסט: אימונולואונציה (איור 3א)
    1. זרעים 30,000 הגידול הראשוני (P0-P1) לכל גם על שמיכות ממוקם ב 24 צלחת ותרבות עד 80% confluent. או להתרכז מיון CD45+ ו CD31+ תאים (30,000 תאים לכל טוב) על שמיכות על ידי ציטוספין ב 400 x × g (שיטה המשמשת להפקיד תאים ישירות ובאופן שווה על גבי coverslip ב 24 צלחת הבאר).
    2. תקן תאים עם אצטון קר עבור 15 דקות. שטוף 3x פעמים עם PBS.
    3. לחסום שקופיות ב 10% סרום עז. דגירה שקופיות עם נוגדנים העיקרי לילה (טבלה 2).
    4. לשטוף שקופיות 3 x ב-PBS. מודיית נוגדנים משניים עבור 2 h (שולחן 2).
    5. שקופיות מפני כתמים ו-mount עם טיפה אחת של DAPI במדיה הרכבה איטית בעמעום.
  3. ניתוח טוהר של אוכלוסיית FACS: MEFSK4 בודק (איור 3ב)
    1. השהה מחדש תאים מבודדים טריים ב-25 μL של הפתרון של חוסם FC כדי למנוע את האיגוד הלא ספציפי של נוגדנים. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
    2. אופציונלי: להוסיף 25 μL של 7AAD מ או צבע רפאים סגול 510 להשעיה התא. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך.
    3. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
    4. השהה מחדש את הגלולה ב-50 μL של מאגר FACS. להוסיף נוגדן MEFSK4 ישירות השעיית התא. דגירה עבור 15 דקות על הקרח (שולחן 1).
    5. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
    6. הוסף עכברוש IgG-APC לתאים (שולחן 1). מודקון למשך 30 דקות על הקרח.
    7. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
    8. השהה מחדש את הגלולה בזרימה המומלצת cy, try לדוגמה נפח של מאגר FACS (300 μL) והעברה לזרם cy, להזרים צינור לניתוח זרימה.
  4. ניתוח של טוהר פיברובלסט: בזמן אמת כמותי (איור 3ג)
    1. רנ א בידוד ו-PCR כמותי בזמן אמת
    2. בעקבות העשרת הפיברוטידים, בידוד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA (ראו טבלת חומרים). בצע את הוראות היצרן.
    3. השלם סינתזה DNA הראשון באמצעות ערכת סינתזה cDNA (ראה טבלת חומרים), בעקבות הוראות היצרן.
    4. בצע כמותי למחצה בזמן אמת-PCR5.
  5. ניתוח הפונקציונליות של פיברובלסט: שיטת קולגן ג'ל (איור 4)
    1. תמיסת קולגן
      1. הכינו 20 מ"מ HEPES ו 44 mM נחקו3 ב-dmem. הוסף 1.67 מ"ג מסוג 1 קולגן העכברוש ל 1 מ ל של DMEM עם HEPES ו-נחקו3.
    2. מTGFβ בתוספת הזיכרון
      1. הכינו 10% FBS בתוספת אנטיביוטיקה ואנטי פטרייתי. הוסף TGFβ לריכוז הסופי של 1 ng/mL.
    3. תא/קולגן תערובת וציפוי
      1. להכין השעיה התא (P3-P5) ולקבוע נפח נדרש כדי להשיג 3.3 x 105 תאים.
      2. הוסף נפח ההשעיה עם 3.3 x 105 תאים מספיק קולגן פתרון כדי להשיג 1 mL נפח כולל.
        הערה: קולגן סוג עכברוש 1 ריכוז צריך כעת להיות 1.5 mg/mL.
      3. ב 48 צלחת הבאר, זרעים 300 μL של תא-קולגן ערבוב לכל טוב (~ 1 x 105 תאים/טוב). מודקון ב 37 ° צ' במשך 15 – 20 דקות עד gelled.
      4. השתמשו במחט של 30 גר' כדי לסייע בהפרדת ג'ל מהקירות. הוסף 600 μL של TGFβ ו-FBS שנוספו DMEM לכל טוב. לוחיות תמונה על סורק רפלקטיבי. בשעה 24 h ו 48 h
        הערה: כל הניסויים Immunofluorescence בוצעו על מכונת הזרימה cy, מצויד בשלושה לייזרים (405 nm, 488 nm, ו 640 nm). הנתונים נרכשו באמצעות זרימת נתונים לרכישת תוכנה (רשימת חומרים). ניתוח נתונים נוסף בוצע באמצעות תוכנה לניתוח נתוני זרימה. AlexaFluor 405 ו צבע רפאים ויולט 510 היו נרגשים עם לייזר ננומטר 405 ונאסף באמצעות BP 450/50 ומסנן BP 525/50, בהתאמה. GFP ו-PE התרגשו על ידי לייזר 488 ננומטר ונאסף באמצעות 530/30 BP ו 575/26 מסנני BP, בהתאמה. או APC או AlexaFluor 647 היה נרגש על ידי לייזר 640 nm ונאסף באמצעות מסנן BP 670/14. כל הניסויים תא מיון בוצעו על מכונת הזרמת cy, (טבלה של חומרים) מצויד ארבע לייזרים (405 nm, 488 nm, 561 nm ו 640 nm). 7-עמ מ היה נרגש באמצעות 561 ננומטר לייזר ואסף עם מסנן BP 670/14. GFP ו Ghost צבען סגול 510 נאספו באמצעות אותו שילובים לייזר/סינון כפי שמתואר לעיל. כל הניסויים מיון מנוצל זרבובית 100 um עם הגדרות לחץ psi 17 כדי להגדיל את הכדאיות הזרם של תאי היעד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מערכת זרימה להפגנת בידוד מיופיברופיצוץ באמצעות עכברים αSMA-GFP
לבבות שלא נפגעו הראו לא ניתן לגילוי בתאי הαSMA-gfp במודל העכבר העיתונאי; מכאן, הם שימשו להקמת שער לאות הרקע של הערוץ GFP לאחר פיצוי (איור 2). αSMA+ תאים ממוינים בהתבסס על נוכחות של ביטוי gfp מן החדר השמאלי פצועים 10 ימים אחרי MI. אחוז קטן של אנדותל (GFP +/cd31 + תאים; SD = 3.8% ± 0.0164; n = 5) והמטפיאה (GFP +/cd45 + תאים; SD = 3.18% ± 0.0112; n = 5) התאים הביעו גם GFP בליבם הפגוע αSMA-GF...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מזוהה על ידי קבוצה מגוונת של סמנים. סמני החלבון ששימשו לזיהוי פיברוהטיים הם discoidin לקולטן תחום 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, קולגן אני ו III, ו Thy115,16,17,18,19,20. בעוד vimentin נעשה שימוש כדי לזהות השקט השקטים ביותר, חלבון פיברוביסט, חלבונים ספציפיים αSMA, ו-קרום הגוף הוכחו לז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים רוצים להודות ד ר איבו Kalajzic עבור העכברים αSMA-GFP. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות (NIH) תחת הפרס מספר R01GM118300 (האס), המכון הלאומי להדמיה ביו-רפואית וביוהנדסה של NIH תחת הפרס מספר R21EB019509 (P.P.Y.), ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני תחת הפרס מספר 17SDG33630187 (אס). מנתח זרימה cy, בוצעו ב-VUMC זרימה Cy, משאב משותף אשר נתמך על ידי מרכז הסרטן של ואנדרבילט Ingram (P30 CA68485) ואת מחלת העיכול ואנדרבילט מרכז המחקר (DK058404).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<ריאגנטים חזקים>
אצטון
אנטי פטרייתי (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)Sigma AldrichA9528
בקר סריום אלבומין (BSA)Sigma9048-46-8
סידן כלוריד
ציטראט בופר
תערובת קולגנאז (Liberase Blendzyme 3 TH)Roche Applied Science
DAPI
DDI מים
מי
DMEM-F12 עם טכנולוגיות L-גלוטמין ו-HEPESLife11330057
Dnase I(20U/mL)BioRad
Phosphate-Buffered Sas (dPBS) ללא Ca2+ ו-Mg2+Gibco13190-144
חוסם אתנול
FC 70% (מטוהר אנטי עכבר CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161
סרום בקר עוברי (FBS)Life Technologies16000044
10% סרום
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) עם Ca2+ ו-Mg2+Corning21-023-CV
1M HEPESCorning25-060-Ci
Krebs-Henseleit אבקת חיץSigmaK3753
מיקופלזמה מניעתית (פלסמוצין)Invivogenant-mpp
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו פישר 15140122
1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS)
10x מאגר ליזה של תאי דם אדומיםMiltenyi130-094-183
מדיההרכבה באיטיות
נתרן אזיד
נתרן ביקרבונט
TGF ובטא;
כתם כחול טריפן (0.4%)Gibco15250-061
קולגן
<חזק>נוגדנים
7AAD (מלאי: תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל ב-DMSO)בדיקות מולקולריותדילול A1310= 1:1000; RRID =
CD45-APCBD Bioscience559864דילול = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PEBD Bioscience553373דילול = 1:200; RRID = AB_394819
CD31BD Biosciences553370דילול = 1:250; RRID = AB_394816
CD45BD553076דילול = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α 1MD Bioproducts203002דילול = 1:1000; RRID =
צבע רפאים סגול 510 (ניסוח: 1 uL/בדיקה ב-DMSO)דילול Tonbo Biosciences13-0870= 1:1000; RRID =
עיזים נגד עכבר Alexa Fluor 488בדיקות מולקולריותA11029דילול = 1:200; RRID = AB_138404
עז נגד ארנב-Cy3Southern Biotech4050-02דילול = 1:200; RRID = AB_2795952
עיזים נגד ארנבות-FITCJackson Immunoresearch Laboratories711-165-152דילול = 1:200; RRID = AB_2307443
עיזים נגד חולדות Alexa Fluor 488בדיקות מולקולריותA11006דילול = 1:200; RRID = AB_2534074
עיזים נגד חולדות Alexa Fluor 647Thermo-FisherA21247= 1:200; RRID = AB_141778
פריוסטיןסנטה קרוזSC67233דילול = 1:100; RRID = AB_2166650
דילול VimentinSigma AldrichV2258= 1:200; RRID = AB_261856
&אלפא;-אקטין שריר חלק (αSMA)דילול סיגמא אולדריץ'A2547= 1:1000; RRID = AB_476701
חלבון ספציפי לפיברובלסטים 1 (FSP1)Millipore 07-227407-2274דילול = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 חרוזים מגנטייםMiltenyi Biotec130-052-301
CD31 חרוזים מגנטייםMiltenyi Biotec130-087-418
תאים נגד הזנה-APC (MEFSK4)Miltenyi Biotec130-102-900דילול = 1:100; RRID = AB_2660619
חרוזים נגד APCMiltenyi Biotec130-090-855
עכברוש IgG-APCMiltenyi Biotec130-103-034דילול = 1:100; RRID = AB_2661598
חמור נגד חולדות Alexa Fluor405Abcamab175670דילול = 1:100
anti-AN2/NG2Miltenyi Biotec130-097-455דילול = 1:11; RRID = AB_2651235
<חזק>חומרים אחרים
0.22 ומיקרו; m פילטרתרמו מדעי723-2520
10 ס"מ צלחת תרבית תאיםקורנינג430167
10 מ"לפיפט פישרברנד13-678-11E
40 ומיקרו; m מסננת תאיםFisherbrand22363547
5 מ"ל PipetFisherbrand13-678-11D
50 מ"ל צינור חרוטיFalcon352070
6 בארות צלחתקורנינג3506
צינורות ציטומטריה זרימהFalcon352058
מלקחיים
נדנדה
להב קצה יחידPAL62-0177
מספריים כירורגיים
GFP-αSMA מדווח עכברים
MACS מפריד שדה
MACS הפרדת עמודה
כיסויי
Qaigen Rneasy מיני ערכתQaigen74104
אמביון RNAqueous מיקרו בידוד מוחלט ערכתאמביוןAM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis KitBioRad1708891
48 בארות צלחת
30G מחט
3 מכונת ציטומטריה זרימת לייזר (BD LSRFortessa)BD Biosciences
4 זרימת לייזר מכונת ציטומטריה (BD FACSAria III)BD Biosciences
Flow Data Acquisition Software (BD FACSDiva Software v8.0a)Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)BD Biosciences
DI 7326828-Dulbecco's עיזים חולדה מסוג 1 דילול מגנטיBD

מקורות

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד מיופיברובלסטיםבידוד תאיםציטומטריה של זרימההפרדה מגנטיתזריעה דיפרנציאליתמיון תאים מופעל פלואורסצנציהעכברי Alpha-SMA-GFPאנטיגן MEFSK4התכווצות קולגן
בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.