מאמר שיטה

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

DOI:

10.3791/61024

⸱

30 באפריל 2020

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצרי העברה שאינם תלויי ATG הקשורים לחזרה מתגלים כתכונות פתוגניים של מחלות מבוססות הרחבה חוזרות. מטרת הפרוטוקול המתואר היא להעריך רעילות הנגרמת על ידי פפטידים אלה באמצעות בחני התנהגות הסלולר מערכת המודל C. אלגיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג. אלגיה משמש בדרך כלל למודל מחלות ניווניות הקשורות לגיל הנגרמת על ידי מוטציות התרחבות חוזרות, כגון טרשת Amyotrophic לרוחב (ALS) ומחלת הנטינגטון. לאחרונה, חזרה על הרחבה המכילה RNA הוכח להיות מצע עבור סוג הרומן של תרגום חלבון שנקרא לחזור על-ידי הקשורים לא אוגוסט תלוי (רן) תרגום. בשונה מתרגום קאנוני, תרגום רן אינו דורש התחלה של מפעיל ומתרחש רק כאשר החזרה עולה על אורך הסף. מכיוון שאין להתחיל קודון לקבוע את מסגרת הקריאה, תרגום RAN מתרחשת בכל מסגרות הקריאה מתוך הגיון ואנטי היגיון תבניות RNA המכילות רצף הרחבה חוזרת. לכן, תרגום הראן מרחיב את מספר הפפטידים האפשריים הקשורים למחלות רעילות מאחד לשש. עד כה, התרגום של רן תועד בשמונה שונות של התרחבות ומחלות נוירוניווניות המבוססות על הרחבה. בכל מקרה, פענוח אשר מוצרי ראן רעילים, כמו גם מנגנוני רעילות שלהם, הוא צעד קריטי לקראת הבנה כיצד אלה פפטידים לתרום פתופסיולוגיה המחלה. במאמר זה, אנו מציגים אסטרטגיות כדי למדוד את רעילות של פפטידים RAN במערכת דגם C. אלגיה. ראשית, אנו מתארים הליכים למדידת רעילות של מבני רן על הצמיחה והתנועתיות של התפתחות C. אלגיה. שנית, אנו מפרטים את התשובה למדידת ההשפעות ההתפתחותיות, התלויות בגיל של פפטידים של RAN בתנועתיות. לבסוף, אנו מתארים שיטת רעילות עצבית להערכת ההשפעות של פפטידים בראן על מורפולוגיה של תא העצב. מספר זה מספק הערכה רחבה של רעילות בתלת-המידה של פפטיד, ועשוי להועיל לביצוע מסכי מולקולות גנטיות או קטנות כדי לזהות מנגנוני מחלות או תרפיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתרחבות הבלתי הולמת של רצפים חוזרים DNA הוא הבסיס הגנטי עבור מחלות ניווניות מספר כגון טרשת amyotrophic לרוחב (ALS), דמנציה הפרופנטיסטית (FTD), ו מחלת הנטינגטון (HD)1. בעוד יש מבוססים מודלים סלולריים ובעלי חיים עבור מחלות אלה, מנגנונים המשמשים את התנאים הללו אינם מוגדרים היטב. לדוגמה, HD נגרמת על ידי הרחבות של רצף החזרה של הקאג ברצף הקידוד של החלבון Htt2. כי הקאג מקודד את החומצה האמינית גלוטמין, התרחבות חזרה הקאג התוצאות בהוספה של polyglutamine, או polyglutamine, רצף בתוך htt. מורחבת חלבונים polyglutamine הטופס באורך והגיל מצרפים מזיבי החלבון המשויכים רעילות3,4. למרבה ההפתעה, שני מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי אורכו של רצף polyq הוא לא הנהג העיקרי של התפתחות HD מחלה, מציע כי גורמים בלתי תלויים polyq עשוי גם לתרום למחלה5,6.

אחד אפשרי polyQ המנגנון העצמאי כולל סוג חדש של תרגום חלבון כינה REpeat aSSOCIATED NON-אוג-תלוי (רן) תרגום7. כפי ששמה מרמז, תרגום רן מתרחש רק כאשר קיים רצף חוזר מורחב ואינו דורש התחלה קאנונית. לכן, תרגום רן מתרחש בכל שלושת מסגרות הקריאה של החזרה כדי לייצר שלושה פוליפפטידים ברורים. בנוסף, מכיוון שגנים רבים מייצרים גם תעתיק אנטי-חוש המכיל את ההשלמה ההפוכה של רצף החזרה המורחב, תרגום הראן מתרחש גם בכל שלושת מסגרות הקריאה של התעתיק האנטי-הגיוני. יחד, תרגום רן מרחיב את מספר החלבונים המיוצרים מתוך רצף מורחב חוזר המכיל DNA מ פפטיד אחד עד שישה פפטידים. עד כה, תרגום רן נצפה בלפחות שמונה הפרעות חוזרות שונות של התרחבות8. פפטידים הרצתי נצפו בדגימות המטופל שלאחר המוות ורק במקרים שבהם המטופל נושא חזרה מורחבת9,10. בעוד פפטידים אלה נמצאים בבירור בתאי החולה, תרומתם למחלות פתופסיולוגיה אינה ברורה.

כדי להגדיר טוב יותר את הרעילות הפוטנציאל הקשורים עם הפפטידים RAN, מספר קבוצות הביעו כל פפטיד במערכות מודל שונות, כגון שמרים, זבובים, עכברים, והתרבות רקמות תאים11,12,13,14,15,16. במקום להשתמש ברצף החזרה של הביטוי, מודלים אלה מעסיקים גישה מקודון וריאציה שבה רצף החזרה מסולק, אך רצף חומצת האמינו נשמר. החניכה בתרגום מתרחשת באמצעות ATG קאנונית והפפטיד בדרך כלל מותכות לחלבון פלורסנט ב-N-או C-טרמינוס, שאף אחד מהם אינו מפריע לרעילות ה-RAN. לכן כל אחד מהמבנה מבטא פפטיד בודד. מידול מוצרים שונים של RAN באורגניזם משני עם בחני פשוטה למדוד רעילות הפפטיד של הראן הוא החשוב ביותר כדי להבין כיצד מוצרי RAN שונים של כל מחלה-גרימת התרחבות חוזרת לתרום לתפקוד התאי וניוון המוח.

כמו מערכות מודל אחרות, C. אלגיה מספקת פלטפורמה ניסיונית גמישה ויעילה המאפשרת מחקרים של מנגנוני מחלה חדשים, כגון רעילות של מחלות מסוג RAN. תולעים מציעות מספר תכונות נסיוניות ייחודיות שאינן זמינות כרגע במודלים אחרים של הרעלת פפטיד בראן. ראשית, הג הם שקופים מהלידה עד המוות. זה מאפשר הדמיה פשוטה של ביטוי פפטיד ולוקליזציה של הראן, כמו גם בניתוח vivo של ניוון מוחי בבעלי חיים חיים. שיטות שניות ליצירת מודלים של ביטוי פפטיד בשיטת RAN הם זולים ומהירים. בהינתן מחזור החיים הקצר של שלושה ימים של C. אלגיה, קווים טרנסגניים יציבים המבטא כל פפטיד RAN נתון בצורה מסוימת של סוג תא ניתן לייצר בתוך פחות משבוע. שלישית, פלטי פנוטים פשוטים יכולים להיות משולבים עם שיטות סינון גנטי, כגון מוטזיס כימי או הקרנת RNAi, כדי לזהות במהירות גנים חיוניים של הרעלת פפטיד בראן. לבסוף, תוחלת החיים הקצרה של הג (~ 20 יום) מאפשרת לחוקרים לקבוע את מידת ההזדקנות, שהיא גורם הסיכון הגדול ביותר למחלות התרחבות חוזרות ומחלות, השפעות רעילות מהפפטיד. יחד, שילוב זה של מאפיינים ניסיוניים הוא ללא תחרות בכל מערכת מודל אחרת והוא מציע פלטפורמה רבת עוצמה לחקר רעילות פפטיד בראן.

כאן אנו מתארים מספר שאומר כי למנף את היתרונות הניסיוניים של C. אלגיה כדי למדוד את הרעילות של פפטידים בראן ולזהות מכפילי גנטי של רעילות זו. Codon-מגוון מגוונת ATG-פפטידים רץ מתויגים עם GFP והביע בנפרד בתאי שריר תחת מקדם myo-3 או בנוירונים מוטוריים GABAergic תחת unc-47 יזם. לביטוי בתאי שריר, חשוב כי הפפטידים רץ רעילים מתויגים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP), או חלבון פלורסנט אחרים (FP) תג כי ניתן לפלח עם וקטור האכלה RNAi. הסיבה לכך היא ביטוי ביטויים רעילים מסוג RAN בדרך כלל חוסם את הצמיחה, עיבוד זנים כאלה ללא קיימא. השימוש gfp (RNAi) מותנית בביטוי פפטיד ביטוי מאפשר מאמץ, צלבים גנטיים, וכו '. עבור assays בעלי חיים אלה יוסרו gfp (RNAi), אשר מאפשר ביטוי של הפפטיד RAN ואת הפנוטיפים כתוצאה מכך. בנוסף לאסטרטגיה המולקולרית לעיצוב מבני ביטוי מגוונים בעלי מגוון של מבנים, אנו מתארים את הנושא למדידת רעילות התפתחותית (הזחל ושיטת הצמיחה), הרעילות לאחר גיל התפתחותי (שיטת שיתוק), ומומים מורפולוגיים (מזנון בטוח).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת מבנים מגוונים של ביטוי מגוון של פפטיד

  1. עצב את רצף הקידוד הפרטני של מבנה ה-DNA העושה שימוש בקודונים נרדפים כדי לסלק את המבנה הבסיסי של דנ א/RNA, אך לשמר את רצף חומצת האמינו שמעליה.
  2. הזמנת הקודון המותאם אישית באורכי מסחרית באורכים החוזרים הדרושים למחקרים (בדרך כלל 5 – 100 חוזר). כלול אתר הגבלה של HindIII בסוף 5 ' ובאתר הגבלת BamHI בסוף 3 ' כדי להקל על השכפול לתוך וקטורי ביטוי של C. אלגיה , כגון ppd 95.79.
    הערה: אם סינתזה של מבנים גדולים יותר מוכיחה הקשה, רצפים קטנים בנייה לחסום יכול להיות מסונתז ולאחר מכן בנוי לתוך גדול יותר באמצעות אסטרטגיה לימוד כיוונית17.
  3. שיבוט משנה את רצף הפפטיד לתוך וקטור ביטוי C. אלגיה באמצעות שיטות ה-T4 הסטנדרטיות.
  4. שיבוט משנה רצף מקדם ספציפי לסוג תא שנוצר על-ידי ה-PCR לפני רצף הפפטיד של RAN כדי לכונן ביטוי ספציפי לרקמה-פפטיד-GFP.
  5. הכנס את מבנה הפפטיד של ה-RAN לגונאד של מסוג פראי C. אלגיה כדי ליצור זנים טרנסגניים המכילים מערכים כרומוזומלית באמצעות שיטות סטנדרטיות18. עבור סמן שיתוף הזרקה, שריר ספציפי RFP כתבת (myo-3p:: rfp (pCFJ104)) היה מנוצל, למרות סמנים אחרים יכולים להיות מנוצל גם.
  6. שילוב של גן מעבר יציב לתוך הגנום באמצעות שיטות ההקרנה הרגילות של C. אלגיה 19.
  7. אם פפטיד ה-RAN הוא רעיל ובעלי חיים הטרנסגניים לא לשרוד, להאכיל בעלי חיים gfp (RNAi) ביטוי חיידקים pre-הזרקה כדי להשתיק את הביטוי של חלבון רעיל.
    הערה: הסרת בעלי חיים מ- gfp (RNAi) מאפשרת ביטוי פפטיד מסוג RAN לניתוחים פנותאריים באמצעות הספר המתואר להלן.

2. מדידת רעילות התפתחותית של פפטידים RAN בעקבות מבוסס RNAi גן הסתרה: פרוטוקול ניתוח מהירות וידאו

  1. שופכים תקן הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) rnai 24 לוחיות עם 1 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thioגלאוצד (iptg) ו 25 μg/mL carbenicillin.
  2. פס החוצה שיבוטים האכלה RNAi ב HT115 חיידקים להיבדק על ציר לוריא (LB) + carbenicillin (25 μg/mL) לוחות אגר ולגדל חיידקים ב 37 ° c עבור 24 שעות. כלול וקטור ריק (RNAi) כפקד חיובי עבור רעילות ו- Gfp (rnai) כפקד שלילי.
  3. עבור כל שיבוט, לבחור מושבה אחת לתוך 1 מ ל של LB + carbenicillin מדיה נוזלית ולגדול חיידקים לילה עבור 18 שעות ב 37 ° צ' בעוד רועד ב 250 סיבובים לדקה (RPM).
  4. ספוט ארבע בארות בודדים של NGM RNAI 24 בארות עם 20 μL של התרבויות הבאות בקטריאלי לילה: עמודה 1 בארות = gfp (RNAi); עמודה 2 בארות = (EV) RNAi; עמודות 3 – 6 בארות = RNAi נגד גנים להיבדק. אפשר לחיידקים RNAi לגרום dsRNA הפקה לילה בטמפרטורת החדר (RT).
  5. לבודד ביצים מיום אחד בוגר C. אלגיה מבטאת את השילוב המשולב פפטיד משולב באמצעות השיטה ההיפוכלורית והזרע ~ 30 C. אלגיה ביצים לתוך כל טוב של הצלחת ngm rnai 24 היטב.
  6. מפעיל את 24 הבארות ב -20 ° c במשך 7 ימים.
    הערה: זמן דגירה זה עבור זנים המבטא רעילים C9orf72 RAN dipeptides, כגון PR50 או GR50. זנים אחרים עשויים לדרוש זמני דגירה קצרים כדי למנוע תשישות של מקור מזון חיידקי ורעב לאחר מכן.
  7. רכישת קטעי וידאו משודרים באמצעות לייקה MZ16FA מיקרוסקופ לניתוח סטריאו מצויד במצלמה מונוכרום DFC345FX מחובר למחשב תואם Windows פועל לייקה AF תוכנת רכישת וידאו (גירסה 2.6.0.7266).
    1. לרכוש שני קטעי וידאו משתי בארות נפרדות עבור כל תנאי RNAi באמצעות עקבי רכישת וידאו הגדרות בין בארות. עבור כל וידאו, לרכוש 10 שניות ב 800 x 600 פיקסל ברזולוציה ו 13.16 מסגרות לשנייה (הזמן voxel ממד = 0.076 שניות) באמצעות הגדלה 29.9 X (1.49 הגדרת זום ב-AF תוכנה). הגדר את זמן חשיפת התמונה ל-4 אלפיות שניה. סמן כל וידאו מיד עם המתח, תנאי RNAi ומספר טוב.
  8. לעוור את הניסויים לגנוטיפ המשויכים כל קובץ וידאו על ידי אקראיות הסדר של קטעי וידאו ושינוי שם קטעי וידאו למספרים. שמור קבוצה זו של סרטי וידאו כקובץ חדש. לא לעוור את הניסויים. לאחר השלמת הניתוח
  9. למדוד את ' מרחק שנסע ' ואת אורך של כל חיה עבור 20 בעלי חיים שונים מכל וידאו, בחינת סך של ~ 40 תולעים עבור כל תנאי RNAi.
    1. בתוכנה, בחר את לחצן כלי הביאור, לאחר מכן הכלי לצייר טקסט. לחץ על נקודה במרכז התולעת הנמדדת במסגרת הראשונה של הווידאו וסמן אותה כמספר. העבר את הווידאו לסוף תוך מעקב חזותי של נתיב התנועה של התולעת. במסגרת האחרונה, לחץ על נקודה במרכז התולעת הנמדדת וסמן את המספר המתאים הבא. לאחר מכן, באמצעות הכלי לצייר scalebar, צייר קו מהמספר הראשון למספר השני כדי להקליט את "מרחק שנסע".
    2. ' מרחק שנסע ' הוא המרחק בין שתי נקודות הסנטהאיד. מרחק זה מוצג בסמוך לקו המדידה. הקלט מדידה זו בגיליון אלקטרוני. חזור על מדידה זו עבור 19 תולעים אחרות בווידאו תוך שמירה על כל מדידה בודדת בחלון הניתוח.
  10. ליצור מדידות מבעלי חיים המציגות את התנועה החזקה ביותר כדי להימנע מבחירת בעלי החיים לא מפגין תנועה וממתח את הנתונים לקראת שיתוק. לאחר השלמת המדידות, צלם תמונה של מסגרת הווידאו הסופית המדגימה את כל קווי המדידה כך שניתן יהיה לעקוב אחר הנתונים בחזרה אל בעל החיים שממנו היא נוצרה.
  11. נתח את הנתונים באמצעות גיליון אלקטרוני בעל ארבע עמודות. טור אחד הוא התולעת "מזהה", עמודה שתיים הוא המרחק שנסע/שעה (מהירות).
    1. הזמן של כל וידאו ניתן למצוא על ידי לחיצה ימנית על וידאו מתחת לניסוי וללכת המאפיינים של הווידאו.
  12. לנרמל את מדידת המהירות על ידי מציאת אורך של כל חיה על ידי בחירת כמת, ולאחר מכן סטטיסטיקה על התוכנה. לחיצה על סמל כלי הביאור בתצוגת הווידאו אמורה לאפשר את השימוש בכלי "צייר פוליליין". כלי זה יכול לשמש לאחר מכן לעקוב בחופשיות את C. אלגיה מן הווידאו מקצה הראש עד קצה הזנב. אורך הקו יירשם בסטטיסטיקה.
    1. צלם תמונה של מסגרת הוידיאו הסופית המדגימה את כל הפוליקו המשמש לשינוי גודל ה -C. אלגיה כך שניתן יהיה לעקוב אחר הנתונים בחזרה אל החיה שממנה הם הקורם.
  13. נתח את הנתונים באמצעות הוספת שתי עמודות נוספות לגיליון האלקטרוני. טור שלוש הוא "אורך החיים", והטור הרביעי הוא "המהירות המנורמלת" (אורך מהירות/בעלי חיים). ניתוח נתוני המהירות המנורמלת באמצעות ANOVA בכיוון אחד עם בדיקות שלאחר-הוק לעומת וקטור ריק (RNAi).

3. מדידת רעילות התפתחותית של פפטיד RAN: שיטת הצמיחה

  1. בחר ~ 30 בעלי חיים gravid לתוך מקום 50 μl של פתרון רדמה (10 מ ל של אקונומיקה, 2.5 ml של 10 N naoh, 37.5 ml של dH2O) על gfp (rnai), (EV) rnai, או (גנטי ספציפי) 6 ס מ rnai צלחת.
  2. לאחר 24 שעות, להעביר שישה צאצאים טרנסגניים שזחלו החוצה של האתר ההיפוכלוריט הפתרון ללוח חדש 6 ס"מ rnai זהה התנאים rnai על הצלחת שבה הם היו חשופים לטיפול היפוכלוריט פתרון. שים את הצאצאים האלה (F1) ב 20 ° צ' כדי לצמוח ולהתרבות.
  3. לאחר 24 – 48 h, לבחור 10 בעלי חיים L4 טרנסגניים אל 6 ס מ rnai התאמת התנאים rnai כי בעלי החיים כבר גדל. הניחו לבעלי החיים להטיל ביצים במשך 24 שעות בחממה של 20 ° c.
  4. לאחר 24 שעות, להסיר את החיות למבוגרים ולהשליך אותם. לספור את מספר הביצים ואת הזחלים L1 הניח במהלך 24 המחזור באמצעות מונה כף יד מכנית. . זה הגודל הכולל של הרבייה
  5. במהלך 72 h הבא, לספור את מספר בעלי החיים המגיעים L4 או בשלב מבוגר. , כאשר כל בעל חיים נספר. הסר אותו מהצלחת
  6. לכמת את "אחוז צמיחה" כאחוז של בעלי חיים המגיעים L4 או השלב המבוגר מתוך גודל הגידול הכולל.
  7. בצע מבחן מדויק של 2 x 2 של פישר לעומת וקטור ריק (RNAi) כדי לקבוע אם הצמיחה אחוז הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית. הקטגוריות להשוואה הן "צמיחה" (של בעלי חיים שהגיעו לשלב L4 או מבוגר ב 72 h) ו "ללא צמיחה" (גודל הקבוצה הכולל פחות מספר בעלי חיים המגיעים L4 או בשלב מבוגר ב 72 h).

4. התפתחות שיתוק לאחר התפתחותי של מדרסה

  1. שמור על משולבים C. אלגיה הזנים המבטא הראן פפטיד-GFP בשריר על GFP(rnai) על ידי הצבת 4 – 6 טרנסגניים L4's על צלחת 6 ס"מ GFP(rnai) להגדיל את התולעים ב 20 ° c.
  2. אם הניסוי מנצל את RNAi כדי לבדוק את ההשפעות הגנטיות על רעילות בראן להעביר 10 מבוגרים gravid הטרנסגניים מצלחת בלתי מורעב לכל אחד 2 6 ס"מ וקטור ריק(rnai) (שליטה חיובית עבור שיתוק, שלילי שליטה על השפעות גנטיות), gfp ( rnai) (שליטה שלילית לשיתוק, בקרה חיובית עבור אפקטים גנטיים), מיוחד גנטי(למשל, 10 gravid מבוגרים
  3. אם מוטציות משמשות כדי לנתח את ההשפעות הגנטיות על רעילות הפפטיד בראן, מקום 10 gravid WT או בעלי חיים מוטציה המבטא את אותו הגנטי RAN על כל אחד 2 6 ס"מ וקטור ריק(rnai) או Gfp (rnai) צלחות. לגדל את התולעים ב 20 ° צ' עבור 48 h.
  4. בחר 10 סטים של 10 טרנסגניים L4's מן 6 ס מ rnai לוחות ומקום כל להגדיר על 3 ס מ rnai הצלחת (כלומר, n = 100 בעלי חיים עבור כל גנוטיפ). ודא שL4's שנבחרו עבור הסדר כולם כוללים תנועתיות רגילה באופן שטחי. מניחים את הצלחות בתוך שקית אחסון רוכסן לשמור על לחות.
  5. מניחים את הצלחות ארוז עם L4's בחממה 25 ° c.
  6. הסר את בעלי החיים 24 שעות מאוחר יותר מהאינקובטור 25 ° c אחד בכל פעם כדי למזער את כמות הזמן שהם בחוץ ב-RT.
  7. הקש על לוחיות הזיהוי של המיקרוסקופ כדי לבדוק את התנועה. אם החיות לנוע יותר מאשר אורך הגוף, לספור את החיה כמו ניידים ולהעביר אותו לצלחת החדש 3 ס מ RNAi. השתמש באיסוף פלטינה כדי להקיש על התולעים הנותרות על הראש או הזנב. אם בעל החיים נע יותר מאורך הגוף, לספור את החיה כנייד ולהעביר אותו לצלחת החדש 3 ס מ RNAi.
    הערה: אין לחרוג מ -10 תולעים לכל צלחת בעת המעבר. היזהר כדי להימנע מהעברת צאצאים ללוח RNAi החדש, כי האפשרות תלויה בבעלי חיים בגילאי הבאים בלבד.
  8. קבץ את כל התולעים שאינן נעות יחד כך שתנועה של יותר מאורך הגוף יכולה להתגלות בקלות. תן לחיה לפחות דקה אחת להזיז יותר מאורך גוף אחד. אם זה עדיין לא זז, זה משותק, ארוז (כלומר, הזחלים בקעה בתוך אמא), או מת.
  9. בעלי חיים הצנזורה המוצגים, מתייבשות בצידי הצלחת, המעיים מפגינים, מחילה, הופכים לאבודים, או מתים מה, בזמן הגילוי. תולעים משותק נספרות, שמאל על הלוח RNAi הישן, ונמחק.
  10. ציון בעלי החיים לשיתוק בכל יום במשך 5 – 7 ימים כמתואר בשלבים 4.6 – 4.9.
  11. ניתוח נתוני שיתוק באמצעות מבחן בדרגת יומן זהה לזה המשמש לניתוח תוחלת חיים. בניתוח סטטיסטי זה, תולעים נעות הבקיע כמו "חיים", תולעים משותק הם הבקיע כמו "מת", ומת, ארוז, בטן הבלטת, מיובש, מחורץ, או התולעים איבד באופן אחר הבקיע כמו "מצונזרים".
    הערה: בניתוח זה, המספר "אחוז בחיים" מציין את בעלי החיים "אחוז העברת". ההופכי מייצג את "אחוז משותק". השתמש בכלי הניתוח המקוון OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) כדי לבצע את הניתוח הסטטיסטי בדירוג יומן הרישום.

5. מדידת תא עצב פתולוגיה: הספק מאוד

  1. הפקת ג ' אלגיה הטרנסגניים מבטאת את הפפטיד של העניין בנוירונים GABAergic באמצעות unc-47 מקדם. כמו כן , לבטא unc-47p:: gfp או unc-47P:: rfp כדי לחשוף את המבנה הסלולר של הנוירונים בגוגא.
  2. בחר 50 בעלי חיים L4 טרנסגניים ומניחים אותם על צלחת 6 ס"מ OP50 על 25 ° c עבור 24 h.
  3. להעביר את החיות 50 טרנסגניים על לוחית חדשה 6 ס"מ OP50 ב 25 ° c עבור 24 שעות.
  4. הפוך רפידות להדמיה עבור הדמיה של בעלי החיים תחת מיקרוסקופ שטח.
    1. הניחו שתי פיסות נייר על גבי שני מגלשות מיקרוסקופ. הצב שקופית מנוקה ללא קלטת באמצע שתי השקופיות המודבקות.
    2. מדבקות ~ 100 μL (ירידה אחת מתוך פיפטה פלסטיק חד פעמי) של 3% agarose מותכת על השקופית האמצעית עם פיפטה חד פעמי העברה סטרילית.
    3. מיד מניחים שקופית נקיה שנייה לאורך טיפת העלה המותכת, כך שהיא נשענת על השקופיות המודבקות ויוצרת שכבה דקה ושלמה של צמח בין השקופיות.
    4. לאחר שהצמח התקרר והתחזק, הסירו בזהירות את שתי השקופיות עם שכבת הצמח ביניהן, מבלי להפריד ביניהן, והניחו אותן בשקית ניילון עם פיסת נייר לחה מתחתיה. הפוך שקופית אחת לכל 10 תולעים להיבדק יחד עם שלוש שקופיות נוספות.
  5. להסיר את c. אלגיה הטרנסגניים מהאינקובטור 25 ° c ולבחור 10 הטרנסגניים c. אלגיה לתוך ירידה של 100 Μl של 10 מילימטר levamisole בשקופית הדיכאון זכוכית. דגירה של 10 דקות או עד שבעלי חיים משותקים.
  6. הוצא זוג שקופיות משקית הפלסטיק והפרד אותם בזהירות. סמן את השקופית עם הצמח עם ה-גנוטיפ והוסף 2 μL של 10 מ"מ לויאמאסole עד אמצע הצמח. להעביר את 10 בעלי חיים לתוך הלבן על כרית agarose. לכסות את בעלי החיים עם שמיכות #1 עובי.
  7. בעלי חיים תמונה שבה הפות מכוונת כך שהיא בצד ימין של החיה. אם הפות הוא בצד שמאל של הראש, המתקשה של הנוירונים מוטוריים יהיה מתחת בעלי חיים ולא בבירור גלוי, מה שהופך את הכמת מדויק קשה. השמט את הקוונפיקציה מבעלי החיים האלה. בכיוון זה, הcommres של הנוירונים המנוע הם הקרובים שמיכות והם גלויים בבירור על המיקרוסקופ הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטית. המחש את תא העצב המבטא GFP עם לייקה DMI4000B הפוך מיקרוסקופ מערכת פלואורסצנטית עם 63 x 1.4 X NA השמן העדשה טבילה ומסנן לייקה L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). אם תא העצב מגדיר אקספרס RFP במקום GFP, לנצל את מסנן לייקה TX2 RFP (Ex560/40nm; Em645/75 ננומטר).
    1. המחש את תא העצב באמצעות המבטא GFP עם מיקרוסקופ הפוך לשדה הפלואורסצנטית עם 63 x 1.4 x NA הנפט טבילה העדשה וערכת מסנן GFP (Ex480/40 ננומטר; Em527/30 ננומטר). אם תא העצב מגדיר RFP אקספרס במקום GFP, להשתמש בחלבון פלורסנט אדום (RFP) מסנן להגדיר (Ex560/40 ננומטר; Em 645/75 nm).
  8. צלם את התולעים בתוך 45 דקות של הצבת שמיכות על התולעים כדי למזער רעילות משתק.
  9. עבור כל תולעת, ספור את מספר ההנפקות הגלויות. ישנם 16 בעלי חיים גלויים בחיות טיפוס פראי. כמו כן, לספור את מספר ה, כי יש חרוזים גדולים (כלומר, blebs) בתוך ה, כמו גם מספר הנפקות כי הם שבורים. כדי לוודא שהמזנון מקולקל, עקבו אחר המזנון מחוט השדרה לחוט הגחון באמצעות התאמת המישור המוקד.
    הערה: כאשר ה -unc-47 p:: הקרינה הפלואורסצנטית של gfp מציגה פער נחשבים שבורים. המזנון השבור בדרך כלל יש bleb משני צדי ההפסקה, עוזר להראות כי הנפקות הוא שבור. תספור את כמות הבלתרים. וההפסקות עבור 20 תולעים
  10. לחשב את החלק של הקשר עם blebs או שברים על המספר הכולל של הנפקות שנצפו עבור כל חיה. ניתן גם למדוד את המספר המוחלט של הנפקות שנספרו לכל בעל חיים (כולל סוג פראי, ברירת מקום ואירועים שבורים).
  11. עבור כל קטגוריה, לחשב את ממוצע ± SD ומבחינה סטטיסטית לנתח עם מבחן t של סטודנט להשוואה בין שתי אוכלוסיות, או ANOVA חד כיוון להשוואות בין 3 אוכלוסיות או יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו בספר שמתואר כאן כדי להעריך את ההשפעה של מעצורים גנים שונים על רעילות של dipeptides RAN שנמצאים בחולים ALS עם G4C2 הרחבה חוזרת. באמצעות שיטת הצמיחה כדי למדוד רעילות התפתחותית, ניתחנו את ההשפעות של מוטציות הסתרה גנטית מספר מזוהה הגנום רחב RNAi דכאי מסך של השריר הביע הרעלת PR50-GFP. בעוד הביטוי של PR50-GFP לבדו הביא למעצר גדילה לחלוטין החדירה, אובדן של מוטציות פונקציה במספר גנים דיכאו רעילות התפתחותית PR מ 12-94% (איור 1A).

כמו כן, מדדנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מדווחים על שיטות שניתן להשתמש בהן כדי לעצב את הרעילות של פפטיד המודל בשריר או בנוירונים של ג. אלגיה. בעוד חלבונים נוירוניווניות יש הופעת גיל פנוטיפ בחולים אנושיים, הם יכולים גם להפגין רעילות מנטלית כאשר מתבטאת במערכות מודל. ביטוי יתר יש מגבלות הפרשנות משמעותי, אבל זה גם מספק נקודת התחלה רבת עוצמה עבור מסכי גנטיות או תרופתי מכוון לזהות גנים או תרופות שיכולות להפוך פנוטיפים רעילים. זה חשוב במיוחד בהתחשב ביותר מודלים בעלי חיים מדויקים של מחלות יש או לא פנוטיפ או פנוטיפים חלשים לא מתאים ההקרנה משוחדת גישות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R21NS107797

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ,מוצרים מדעיים סטריליים CELLTREAT50-202-036לוחות גידול נמטודות
ומערכות אבחוןמגורענות RNAi AGAR 2 קילוגרםלוחות גידול נמטודות וטכנולוגיות חיים רנאי
אגרוז אולטרה-טהוריםמיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN
קרבניצילין 5GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP26485צלחות גידול נמטודות
ומשקפיים לכיסוי RNAi מס' 1 22 מ"מ 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542Bהדמיה לבדיקת קומיסורה
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSמיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCIERIE 125485Cמיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN
Fisherbrand  שקופיות מיקרוסקופ Superfrost PlusTHERMO SCI ERIE12-550-15הדמיה לבדיקת קומיסור
Gibco  בקטו פפטון גיבקו DF0118-17-0לוחות גידול נמטודות ושמן RNAi
HALOCARBON 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLמיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN
IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSלוחות גידול נמטודות ותוכנת הדמיה פלואורסצנטית מתקדמת של RNAi
Leica Leica MicrosystemsLAS-AFתוכנת רכישת תמונות לניתוח מהירות וידאו ובדיקת קומיסורה
Leica טבילה מסוג N (שמן)W NUHSBAUM INCהדמיה לבדיקת קומיסורה
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GRTHERMO SCI ACROS ORGANICSהדמיה לבדיקת קומיסורה
טיפים למיקרו-מעמיס 2 X 96 יחידותEPPENDORF צפון אמריקה BIOTOOLSE5242956003מיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN

צלחת פטרי, 60X15 מ"מ, 500/CS		קורנינג מדעי החייםפלסטיק FB0875713A לוחות גידול נמטודות
וצלחת פולחן רקמות RNAi 24WEL 50/CSCORNING LIFE SCIENCES DL87721לוחות גידול נמטודות ו-RNAi
BD DF0145070 16500500 E5242952008 BP162010 NC9547002 AC187870100

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877(2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87(2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494(2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C elegansRNAiRPN7IGF DAF 2

מאמרים קשורים