הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול המתאר ניטור של מחזור החיים המלא של חיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות בשילוב עם כרית agarose ומנות הדמיה תא.

תקציר

Bdellovibrio bacteriovorus הוא קטן גרם שלילי, חיידק טורף חובה שהורג חיידקים אחרים גרם שלילי, כולל פתוגנים מזיקים. לכן, הוא נחשב אנטיביוטיקה חיה. כדי להחיל B. bacteriovorus כאנטיביוטיקה חיה, זה הראשון הכרחי כדי להבין את השלבים העיקריים של מחזור החיים המורכב שלה, במיוחד התפשטותו בתוך טרף. עד כה, זה היה מאתגר לעקוב אחר שלבים רצופים של מחזור החיים הטורף בזמן אמת. מוצג כאן פרוטוקול מקיף להדמיה בזמן אמת של מחזור החיים המלא של B. bacteriovorus, במיוחד במהלך הצמיחה שלה בתוך המארח. לשם כך, מערכת המורכבת משטח agarose משמש בשילוב עם צחות הדמיה תא, שבו התאים הטורפים יכולים לנוע בחופשיות מתחת למשטח agarose בעוד תאי טרף משותקים מסוגלים ליצור bdelloplasts. היישום של זן המייצר שפעת מתויגת β-subunit של פולימראז DNA III עוד יותר מאפשר שכפול כרומוזום להיות במעקב במהלך שלב הרבייה של מחזור החיים B. bacteriovorus.

מבוא

Bdellovibrio bacteriovorus הוא קטן (0.3-0.5 μm על ידי 0.5-1.4 μm) חיידק גרם שלילי הטורף חיידקים אחרים גרם שלילי, כולל פתוגנים מזיקים כגון Klebsiella דלקת ריאות, פסאודומונס aeruginosa, ו Shigella flexneri^1,,2^,3.³ מאז B. bacteriovorus הורג פתוגנים, הוא נחשב אנטיביוטיקה חיה פוטנציאלית שניתן להחיל כדי להילחם בזיהומים חיידקיים, במיוחד אלה הנגרמת על ידי זנים עמידים לתרופות מרובות.

ב. bacteriovorus מציג מחזור חיים מוזר המורכב משני שלבים: שלב התקפה חיים חופשיים שאינם משוכפלים ושלב רבייה תאית(איור 1). בשלב החיים החופשיים, החיידק המוטיב הזה, אשר נע במהירויות של עד 160 μm / s, מחפש את טרפו. לאחר הצמדה לממברנה החוצה של הטרף, הוא נכנס פריפלסמה^4,5. במהלך שלב הרבייה הבין-פריפלסמית, ב. בקטריובוס משתמש בשפע של אנזימים הידרולטיסיים כדי להשפיל את המקרומולקולות של המארח ולהשתמש בהם מחדש לצמיחה שלו. זמן קצר לאחר הפלישה פריפלסמה, התא המארח מת ומתנפח לתוך מבנה כדורי הנקרא bdelloplast, שבו התא הטורף מארכת ושכפול כרומוזומים שלה. תהליך השכפול מתחיל במקור השכפול (oriC)⁶ וממשיך עד שמספר עותקים של הכרומוזום מסונתזים^{לחלוטין 7}. מעניין, שכפול של כל כרומוזום אינו מלווה על ידי חלוקת תאים. במקום זאת, הטורף מתעצם כדי ליצור תא ארוך, רב-גרעיני ונימה. עם דלדול תזונתי, חוט החוט עובר ספיגה סינכרונית ותאי הצבי משתחררים bdelloplast⁸.

לפני B. bacteriovorus יכול לשמש כאנטיביוטיקה חיה נגד זיהומים חיידקיים, זה חיוני כדי להבין את השלבים העיקריים של מחזור החיים שלה, במיוחד אלה הקשורים להתפשטותו בתוך הטרף. הדמיה חיה של ב. בקטריובוס הייתה מאתגרת, בשל הצורות המורפולוגיות השונות של הטורף וטרפו במהלך מחזור החיים המורכב. עד כה, האינטראקציות בין B. bacteriovorus והתא המארח שלה נחקרו בעיקר על ידי מיקרוסקופאלקטרונים וניתוח snap-shot 2^,9^,10, שניהם יש מגבלות, במיוחד כאשר הם משמשים כדי לפקח על שלבים^רצופיםשל מחזור^החייםהטורף. שיטות אלה מספקות תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי B. bacteriovorus ומאפשרות התבוננות טורף קטן במהלך שלב ההתקפה או הצמיחה. עם זאת, הם אינם מאפשרים מעקב אחר תאים B. bacteriovorus יחיד לאורך שני שלבי מחזור החיים.

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לשימוש מיקרוסקופית פלואורסצנית זמן לשגות (TLFM) כדי לפקח על מחזור החיים המלא של B. bacteriovorus. מערכת המורכבת משטח agarose משמש בשילוב עם צלחת הדמיה תא, שבו התאים הטורפים יכולים לנוע בחופשיות מתחת למשטח agarose בעוד תאי טרף משותקים מסוגלים ליצור bdelloplasts(איור 2). הגדרה זו מוכנה בהתבסס על זנים ספציפיים של חיידקי אי-קולי ו-B. bacteriovorus, אך ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כך שיתאים לזנים האישיים של המשתמש (לדוגמה, נשיאת סמני בחירה שונים, חלבונים המותכים לפלואורופורים שונים וכו').

במקרה זה, כדי לדמיין B. bacteriovorus במהלך שלב ההתקפה, זן ספציפי (HD100 DnaN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) נבנה המבטא גרסה מתויגת פלורסנטית של חלבון cytoplasmic, PilZ (זמין במעבדה שלנו על פי בקשה)⁷. זן זה בנוסף מייצר DnaN (β-הזזה מהדק), תת-אחד של הולוגאנזים DNA פולימראז השלישי, התמזגו עם חלבון פלורסנט. זה מאפשר שכפול DNA מתמשך להיות במעקב בתוך התאים הטורפים כפי שהם גדלים בתוך bdelloplasts.

למרות הפרוטוקול המתואר והתוכנה המשמשים לרכישת תמונה מתייחסים מיקרוסקופ הפוך המסופק על ידי יצרן מסוים (ראה טבלת חומרים),טכניקה זו עשויה להיות מותאמת עבור כל מיקרוסקופ הפוך מצויד תא סביבתי או מחזיק חימום חיצוני אחר ומסוגל הדמיה לשגות זמן. עבור ניתוח נתונים, משתמשים יכולים לבחור כל תוכנה זמינה התואמת לתבניות פלט בודדות.

איור 1: מחזור חיים ב. bacteriovorus ב E. coli כתא מארח. במהלך שלב ההתקפה, תא B. bacteriovorus שחיה חופשית מחפש ומתחבר לתא E. coli מארח. לאחר הפלישה, התא הטורף הופך למקומי בפריפלסמה של הטרף, משנה את צורת התא המארח ויוצר bdelloplast. שלב הרבייה מתחיל במבנה bdelloplast. התא הטורף מעכל את תא הטרף ומהשתמש מחדש בתרכובות פשוטות כדי לבנות מבנים משלו. ב. bacteriovorus גדל כתרימה אחת ארוכה בתוך פריפלסמה של המארח. כאשר המשאבים של תא הטרף מוצו, חוט החיידק B. סינכרוני ספיגה ויוצר תאים צגידים. לאחר שתאי הצולה מפתחים את הפלגלה שלהם, הם מלקטים את ה-bdelloplast. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

פרוטוקול

1. הכנת ב. בקטריובוס לניתוח מיקרוסקופי

1. בקבוקון 250 מ"ל, להגדיר את coculture על ידי שילוב 1 מ"ל של תרבות בקטריובוז 24 h רענן (למשל, HD100 DnaN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) ו 3 מ"ל של תרבות טרף לילה (למשל, E. coli S17-1 pZMR100) עם 50 מ"ל של מאגר Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 מ'מ CaCl₂ [pH = 7.6]) בתוספת עם אנטיביוטיקה בעת הצורך (כאן, 50 μg/ mL kanamycin).
2. דגירה coculture במשך 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד.
3. ודא כי תאי הטרף הם lysed באופן מלא על ידי מיקרוסקופית פאזה רכוב נוזלי. בשלב זה, מספר רב של תאי התקפה מוטיב שלב B. bacteriovorus צריך להיות נוכח, ולא תא E. coli או bdelloplast צריך להיות גלוי.
4. סנן את תרבות B. bacteriovorus באמצעות מסנן גודל נקבוביות 0.45 μm כדי להסיר את כל התאים המארחים הנותרים. תאים טורפים (0.3-0.5 μm x 0.5–1.4 μm) חודר בחופשיות 0.45 μm נקבוביות, בעוד תאים מארחים נשמרים על פני המסנן.
5. סובבו את הסינון למשך 20 דקות ב-2469 x g ו-30°C בצינור חרסי של 50 מ"ל לאיסוף תאים טורפים. תחשוף מחדש את גלולת החיידק B. bacteriovorus ב- 3 מ"ל של מאגר Ca-HEPES (עד OD_{סופי 600} של כ 0.2) ולדגור ב 30 ° C ו 200 סל"ד במשך 30 דקות.

2. הכנת תאים מארחים לפלישה ב. בקטריובוס

1. השתמש במושבה אחת של זן המארח(E. coli S17-1 pZMR100 מומלץ בשל גדלים שונים של תאים וכתוצאה מכך היווצרות של bdelloplasts בגודל לא שווה) כדי לחסן 10 מ"ל של YT בינוני (0.8% Bacto tryptone, 0.5% תמצית שמרים, 0.5% NaCl [pH = 7.5]) כי כבר בתוספת עם אנטיביוטיקה, במידת הצורך (כאן, 50 μg / מ"ל kanamycin). תאי תרבות לילה ב 37 °C ו 180 סל"ד.
2. להעביר 2 מ"ל של תרבות E. coli לילה (OD₆₀₀ של ~ 3.0) למבחן 2 מ"ל צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (RT) ו 2469 x g עבור 5 דקות. תוסתה מחדש את הכדור ב-200 μL של מאגר Ca-HEPES.

3. הגדרת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים)

1. מחממים מראש תא מיקרוסקופי עם יעד טבילה שמן פי 100 ל-30 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת לפני השימוש. שלב זה נדרש כדי למנוע שגיאות בשמירה על המיקוד במהלך הניסוי.
2. הפעל הן את מיקרוסקופ והן אוטומציית מיקרוסקופ. אתחל את תוכנת הבקרה ובחר את המסננים המתאימים כדי לרכוש תמונות brightfield/DIC/phase-contrast ופלואורסצנציה, לפי הצורך (כאן: תמונות BF, מסנן פוליכרומי GFP/mCherry, ופליטה/ריזור עבור mCherry ו-GFP).

4. הרכבה של פריסות עבור מיקרוסקופית פלואורסצנית זמן

1. לערבב 200 מ"ג של agarose כיתה מולקולרית פלואורסצנטית נמוכה עם 20 מ"ל של מאגר Ca-HEPES (1% ריכוז agarose הסופי) ולהמיס את agarose במיקרוגל. ניתן לעשות באצווה עשה בו פעולה חוזרת מספר פעמים לאחר שהיא מתגבשת, לכן פשוט חזור על שלב החימום.
2. יוצקים 3 מ"ל של אגרוז נמס לתוך צלחת זכוכית תחתית 35 מ"מ(שולחן של חומרים). תן לאגרוז להתגבש.
3. באמצעות מיקרו מרית מעבדה, בזהירות להסיר את כרית agarose מצלחת 35 מ"מ מבלי להפריע את הקוטב המרכזי של כרית agarose. הופכים את החלק התחתון כלפי פנים כלפי למעלה וממקם אותו בכיסוי צלחת פטרי(איור 2).
4. לשים 5 μL של מתלה E. coli מרוכז על גבי המשטח ההפוך ולהפיץ תאים בעמוד המרכזי באמצעות לולאת חיסונים. הוסף 5 μL של מתלה B. bacteriovorus מרוכז (OD₆₀₀ של ~ 0.2) על פני השטח E. coliמצופה. אל תפיץ את התאים.
5. מחזירים במהירות את ג'ל אגרוז לצלחת 35 מ"מ עם תחתית זכוכית (בצד העליון עם הפנים כלפי מטה), ולאחר מכן מכסים במכסה. במידת הצורך, הסר את כל בועות האוויר על-ידי לחיצה בעדינות על הגאר כנגד הצלחת.

איור 2: תיאור סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית. כרית agarose מוסרת מצלחת 35 מ"מ והתהפכה כך שהצד התחתון פונה כלפי מעלה. מתלים טריים של תאים טורפים ותרבות לילה של תאי טרף מונחים על המשטח ההפוך כדי לכסות את הצד ה"תחתון". כרית agarose לאחר מכן התהפך לכיוון המקורי שלה והונח בחזרה בצלחת 35 מ"מ, אשר מותקן על שלב מיקרוסקופ הפוך בתא המיקרוסקופ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

5. מוליכות של מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות

1. מניחים את צלחת ה-35 מ"מ במחזיק צלחת פטרי כך שהיא לא תזוז במהלך הניסוי. מניחים טיפה אחת של שמן טבילה (1.518 אינדקס שבירה) על המטרה, כמו גם את החלק התחתון של צלחת 35 מ"מ.
2. הר המחזיק על השלב של מיקרוסקופ הפוך בתא המיקרוסקופ.
3. הגדר את האפשרויות בתוכנה לבקרת מיקרוסקופ כדי לאסוף תמונות מרובות בעמדות שלב מרובות לאורך זמן.
   1. הגדר את ההגדלה (100x) ואת העדשה הפוליכרומית (GFP/mCherry). באמצעות פיסת עין ובהירפילד (BF), למצוא את מישור המוקד ולפתוח את מנהל רשימת הנקודות.
   2. בחר לפחות 10 עמדות עניין על-ידי הזזת הבמה ואחסון הקואורדינטות עבור כל מיקום בתוכנה למיקרוסקופ על-ידי לחיצה על לחצן סימן נקודה. הימנעו מעמדות הממוקמות קרוב זו לזו כדי למנוע פוטו-בליך וצילום-רעלים. סובב את שסתום המצלמה מהעין לצג וכויל כל נקודה על-ידי הגדרת מישור המוקד ולחיצה על לחצן החלף נקודה במנגנון רשימת הנקודות.
   3. פתח את מעצב הניסוי והגדר את כל הפרמטרים הניסיוניים בכל כרטיסיה באופן הבא:
      1. בטל את סימון תיבת סידור הערימה Z.
      2. בחרו ערוצי פלורסנט והגדרו את הגדרות התאורה האופטימליות. כאן נעשה שימוש בהגדרות הבאות: עבור ערוץ mCherry, ערכות מסנן mCherry (EX575/25; EM625/45), עוצמה של 50% וזמן חשיפה של 200 השנייה; עבור ערוץ GFP, סט מסנני GFP (EX475/28; EM525/48), עוצמה של 50% ו- 80 ms; ולתמונות BF, ערוץ POL, 5% עוצמה, ו 50 ms.
      3. בחר מרווחי זמן בין רכישת תמונות לבין הזמן הכולל של הניסוי. כאן, 5 דקות מרווחים בוצעו במהלך 10 שעות של הניסוי.
      4. אפשר תחזוקת מיקוד עבור המשרות שנבחרו (עבור המערכת המשמשת כאן, על-ידי סימון תיבת הסימון שמור על מיקוד עם UltimateFocus).
      5. בחר את תיקיית הנתונים שבה יש לשמור באופן אוטומטי את קבצי התמונה.
      6. בדוק מחדש את כל ההגדרות בפקד תוכנת מיקרוסקופ ולאחר מכן התחל את ניסוי הזמן- לשגות.
4. לאחר השעה הראשונה של הניסוי, בדקו שכל עמדות הבמה עדיין בפוקוס. התאם את המוקד במהלך מרווחי זמן בין רכישת תמונה, במידת הצורך.
5. עם סיום ניסוי הזמן, הסר את צלחת פטרי והשתמש בצלחת 35 מ"מ עם משטח agarose על פי פרוטוקול הבטיחות הביולוגית.
   הערה: כל שלד המשנה לאחר שלב 5.2 הם ספציפיים עבור משתמשי DeltaVision Elite. חוקרים המשתמשים במערכות אחרות צריכים להתאים את ההגדרות בהתאם למערכות בודדות.

6. עיבוד תמונות וייצור סרטים באמצעות תוכנת פיג'י

1. העבר נתונים ניסיוניים למחשב הטעון עם תוכנת פיג'י. הפעל את תוכנית פיג'י ופתח תמונה באמצעות קובץ | פתח או פשוט על-ידי גרירה ושחרור של קובץ התמונה לתוך פיג'י.
2. באפשרויות ייבוא בפורמטים ביולוגיים, בחר הצג מחסנית עם Hyperstack באפשרויות הצפייה בערימה, לחץ על מצב צבע מורכב באפשרויות הצבע וסמן קנה מידה אוטומטי.
3. על ידי גלילה בין ערימות התמונה, להעריך אם התאים bdelloplasts נשאר בפוקוס במהלך הניסוי. בדוק אם כתמי פלורסנט ירוקים מ-DnaN-mNeonGreen נמצאים בתוך תאי B. bacteriovorus בתוך bdelloplasts לאורך כל שלב הצמיחה, ולהבטיח כי כל השלבים של מחזור החיים הטורף ניתן לדמיין.
4. כדי לנתח תא B. bacteriovorus מסוים / bdelloplast, לסמן אותו באמצעות כלי הבחירה בתפריט פיג'י(מלבן, סגלגל, מצולע, או Freehand). שכפול האזור הנבחר באמצעות תמונה | שכפול או באמצעות Ctrl + Shift + D.
5. כוונן את הבהירות והניגודיות עבור כל ערוץ פלואורסקם כדלקמן:
   1. לבחירת ערוץ בודד, פתחו את כלי הערוץ על-ידי לחיצה על תמונה | צבע | כלי ערוצים או Ctrl + Shift + Z, ובחר את ערוץ העניין(ערוץ 1: mCherry, ערוץ 2: mNeonGreen, ערוץ 3: brightfield).
   2. כוונון הבהירות והניגודיות של תמונות בערוץ הפלואורסץ על-ידי פתיחת תפריט B&C בתמונה | כוונן | בהירות/חדות או על-ידי לחיצה על Ctrl + Shift + C.
6. הוספת סרגל קנה מידה באמצעות ניתוח | כלים ומידע | סרגל קנה מידה. הוסף את חותמת הזמן לתמונות על-ידי לחיצה על תמונות | ערימות | סטמפר זמן.
7. כדי לשמור תמונות ששונו, עבור אל קובץ | שמור בשם ובחר TIFF לשמירה כרצף תמונות, AVI כדי להפיק סרט או PNG כדי לשמור תמונה בודדת של המסגרת הנוכחית.

תוצאות

המערכת המתוארת מבוססת TLFM מאפשרת מעקב אחר תאים בודדים של B. bacteriovorus (איור 3, סרט 1) ומספקתמידע רב ערך על כל שלב במחזור החיים הטורף המורכב. היתוך PilZ-mCherry מאפשר לתייג את כל התא הטורף בשלב ההתקפה, כמו גם בשלב מוקדם של שלב הצמיחה (איור 3). המעבר מן ההתקפה לשלב משוכפל היה הדמיה לא רק על ידי היווצרות bdelloplast המארח אלא גם על ידי המראה של replisome (מכונות שכפול), אשר סומן על ידי DnaN-mNeonGreen פלואורסצנט foci

דיון

בשל העניין המוגבר בשימוש B. bacteriovorus כאנטיביוטיקה חיה, כלים חדשים להתבוננות במחזור החיים הטורף, במיוחד אינטראקציות טורפים-פתוגן, נדרשים. הפרוטוקול המוצג משמש למעקב אחר כל מחזור החיים B. bacteriovorus, במיוחד במהלך הצמיחה שלה בתוך המארח, בזמן אמת. יתר על כן, היישום של זן המייצר פלואורסצנט מתויג בטא מהדק של ה-DNA פולימראז השלישי הולואנזים אפשר ניטור של התקדמות שכפול כרומוזום לאורך כל שלב הרבייה של B. bacteriovorus.

שלב קריטי בשיטה זו הוא הכנה נכונה של פריסות בצלחת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צנטריפוגה	MPW MED. INSTRUMENTS	MPW-260R	רוטור נ"צ 12183
מוסמך ביולוגיה מולקולרית Agarose	BIO-RAD	161-3100	אגרוז פלואורסצנטי נמוך עבור כרית אגרוז
פיג'י	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	חבילת עיבוד תמונה בקוד פתוח
צלחת תחתונה זכוכית 35 מ"מ	ibidi	81218-200	זכוכית
לא מצופהמיקרוסקופ	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, מודול לייזר פוקוס אולטימטיבי, מצלמת DV Elite CoolSnap HQ2, מכלול SSI FP DV, ערכה obj. שמן Oly 100x 1.4 NA, פריזמה Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
מסנן Minisart 0.45 ומיקרו; m	Sartorius	16555----------K	אצטט תאית, סטרילי, Luer Lock Outlet
Start SoftWoRx	GE		תוכנת הדמיה המסופקת על ידי היצרן