הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61119

⸱

26 ביוני 2020

 ,  ,  , 
1College of Public Health, Shaanxi University of Chinese Medicine, 2Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, University of Kentucky

במאמר זה

סיכום

שיטה לאספקת תאי גזע עצביים, הניתנים להזרקת פתרונות או השעיות, דרך עורק הראש המשותף (עכבר) או העורק הראשי החיצוני (עכברוש) לאחר דיווח על שבץ. תאים מוזרק מופצים בהרחבה ברחבי המוח באתר וניתן לאתרם עד 30 d לאחר המסירה.

תקציר

הטיפול בתאי גזע עצביים (למועצה לבטחון לאומי) הוא טיפול חדשני המתעוררים שבץ, פגיעה מוחית טראומטית והפרעות ניווניות. לעומת משלוח תוך גולגולתי, מינהל פנים-עורקי של NSCs הוא פחות פולשני ומייצרת התפלגות מפוזר יותר של NSCs בתוך המוח מבכיצ'ימה. יתר על כן, משלוח פנים-עורקי מאפשר את האפקט הראשון של המעבר במחזור המוח, הפחתת הפוטנציאל להשמנה של תאים באיברים היקפיים, כגון כבד וטחול, סיבוך המשויך זריקות היקפית. כאן, אנו לפרט את המתודולוגיה, בשני עכברים וחולדות, עבור המסירה של NSCs דרך העורק הראשי המשותף (עכבר) או עורק הראש החיצוני (עכברוש) לחצי הכדור השני הצלעות לאחר שבץ איסכמי. באמצעות GFP-התווית NSCs, אנו להמחיש את ההתפלגות הנרחבת השיגה לאורך האונה המסילתית מכרסם ב 1 d, 1 שבוע ו 4 שבועות לאחר משלוח פוסטימזימות, עם צפיפות גבוהה יותר או ליד באתר הפציעה האיסכמי. בנוסף להישרדות ארוכת טווח, אנו מראים עדויות על הבידול של תאים המסומנים ב-GFP ב -4 שבועות. הגישה הפנים-עורקי המתואר כאן עבור NSCs יכול לשמש גם עבור ניהול של תרכובות טיפוליות, ולכן יש ישימות רחבה לפציעה מגוונת של ה-CN ומודלים מחלות על פני מינים רבים.

מבוא

תא גזע (SC) תרפיה מחזיקה פוטנציאל עצום כטיפול במחלות נוירולוגיות, כולל שבץ, פגיעת ראש ודמנציה1,2,3,4,5,6. עם זאת, שיטה יעילה לספק ה scs אקסוגני למוח החולה נשאר בעייתי2,6,7,8,9,10,11,12,13. ה scs מועברת באמצעות נתיבי אספקה היקפיים, כולל הזרקת העירוי (IV) או הצפק הפנימי (IP), כפופים לסינון מעבר ראשון במחזור המיקרו, במיוחד בריאות, בכבד, בטחול ובשריר8,9,13,14, הגדלת הסיכויים להצטברות תאים באזורים שאינם מטרה. שיטת הזרקת גרם פולשנית תוצאות הנזק רקמת המוח מקומי והפצה מוגבלת מאוד של ה scs ליד האתר הזרקת2,6,8,14,15,16. לאחרונה הקמנו קטטר מבוססי שיטת הזרקה פנים-עורקים לספק נוירוסוגני ה scs (NSCs), אשר מתוארת כאן להחיל מודל מכרסם של שבץ איסכמי מוקד. אנו לגרום ארעי (1 h) איסכמיה-reperfusion פציעה באונה אחת באמצעות חוט גומי מצופה סיליקון לסגר את עורק המוח האמצעי השמאלי (MCA) בעכבר או עכברוש17,18,19. במודל זה יש לנו שנצפו באופן מיוחד כ 75-85% דיכאון של זרימת דם מוחין (cbf) בחצי הכדור הרוחבי עם דופלר לייזר או הדמיה מיוחד לייזר17,19, מניב נוירוזעיות נוירולוגיות בעקביות17,18,19.

למטרות חיסכון בזמן, הווידאו מוגדר לשחק פעמיים את המהירות הרגילה ואת ההליכים כירורגי שגרתי כגון הכנת העור וסגירת הפצע עם תפר השימוש וההתקנה של משאבת מזרק ממונע אינם מוצגים. השיטה של משלוח פנים-עורקי של NSCs מוצג בהקשר של מודל העורק האמצעי של אוטם המוח (MCAO) של שבץ ניסיוני מכרסמים. לכן, אנו כוללים את הליך השבץ הארעי של התהליך כדי להדגים מאוחר יותר כיצד הניתוח השני, הזרקת פנים-עורקים, מבוצע באמצעות האתר הכירורגי הקודם על אותה חיה. הכדאיות של משלוח המועצה לבטחון לאומי פנים-עורקי מודלים שבץ מכרסמים מומחש על ידי הערכת ההפצה והישרדות של NSCs אקסוגני. היעילות של הטיפול במועצה לבטחון לאומי להחליש מחלות מוח ותפקוד נוירולוגי, ידווחו בנפרד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים על נושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת קנטקי, הטיפול המתאים נלקח כדי למזער את הלחץ או הכאב הקשורים לניתוח.

1. הכנת קטטר הזרקה ווים כירורגיים

  1. בנו את צנתר ההזרקה (איור 1). לאסוף חומרים הכרחי כולל: MRE010, MRE025, ו MRE050 אבובים, 20 G, 26 G ו -27 הזרקת G מחטים (איור 2A), 600 אומץ נייר זכוכית, דבק-על ושני מרכיבים 5 דקות אפוקסי.
    1. גזור 20 G ו 26 מחטים G ב 1 ס מ מרכזת מחט ולהבריק את הקצה על נייר זכוכית (איור 2B). ריקון המחטים עם 10 מ ל של מים מזוקקים כפולים כדי לנקות את המחט משעמם.
      הערה: משתמשים בשני עיצובים שונים (איור 1). עיצוב 1 כולל מחבר יחיד והוא משמש להזרקה של פתרונות או השתלים. לעיצוב 2 יש 20 G ו -26 מחברי מנעול G Luer להזרקה של תאים (20 גר' מחט) וריקון הנפח המת (26 גרם מחט) כדי להבטיח את המסירה של הנפח המלא של הפתרון המכיל המועצה לבטחון לאומי.
  2. עיצוב 1: הוספת קטטר 3-4 ס"מ אורך MRE010 לתוך קטטר באורך 15 ס"מ MRE025 ומאובטח עם דבק.
    1. חבר את הקצה השני של צינור MRE025 לקטע של קטטר MRE050, ומאובטח עם דבק. הכנס את המחט של 20 גרם בקצה הנותר של הקטטר MRE050 ובטוח עם דבק-על (איור 1).
    2. לחזק עוד יותר את אתרי החיבור עם דבק אפוקסי. זה עיצוב קטטר הוא אופטימלי להזרקה של ריאגנטים (כמו פתרונות כימיים או תרופות או מוצרים ביולוגיים אחרים כגון ציטוקינים).
  3. עיצוב 2: הכנס 3-4 ס מ אורך הצנתר MRE010 לתוך צנתר 15 ס"מ אורך MRE025 ומאובטח עם דבק.
    1. חבר את הקצה השני של צינור MRE025 לקטע של קטטר MRE050, ומאובטח עם דבק. הכנס את המחט לתוך הקצה הנותר של קטטר MRE050 ומאובטח עם דבק.
    2. הכנס מחט מוMRE050 26 G לתוך צינור המים ליד קצה המחט הראשונה, לאחר כיוון זרימת ההזרקה, ומאובטח עם דבק (איור 1 ואיור 2c). לחזק את שתי המחטים ואת קטע של צינור MRE050 עם אפוקסי ברור (איור 2C). עיצוב זה מאפשר הזרקה של פתרון הרכב באמצעות מחט 2 (26 G) לאחר הזרקת המועצה לבטחון לאומי דרך מחט 1 (20 G) כדי לרוקן את נפח המת בקטטר לתוך זרימת המוח, השגת שליטה מדויקת יותר של אמצעי הזרקה.
    3. השתמש במחט של 20 גרם עבור הזרקת המועצה לבטחון לאומי כדי למזער את הנזק NSCs, אשר עלול להשפיע לרעה על יכולת הקיום.
  4. לאחר הבנייה, לשטוף את הקטטרים עם 10 מ ל של מים מזוקקים כפולים, ואחריו 70% אתנול, ולאחר מכן להשרות אותם ב 70% אתנול בן לילה.
  5. לפני הניתוח, להסיר את הקטטרים מ 70% אתנול וריקון עם 10 מ ל של PBS סטרילי, ולמקם אותם בתיבת כלי ניתוח אוטוקלבית עבור אחסון ותחבורה.
  6. הכנת ווים כירורגיים
    1. חותכים 1.5-2 ס מ מחט ארוך המחט של 27 גרם, והפולני הן הקצוות על נייר זכוכית עד עמום. לאחר מכן, השתמש בתפס קטן הפסטטי כדי לכופף את הפיר לתוך וו בקצה אחד וצורת טבעת בקצה השני.
    2. ה10-15 וספת קטטר MRE025 ס מ ארוך דרך הטבעת ומאובטח עם קלטת כירורגית ברורה (איור 2D). להפוך 2 קרסים יותר באמצעות אותה שיטה.
    3. להשרות את כל הקרסים מערכות קטטר ב 70% אתנול עד השימוש.

2. הכנה לבעלי חיים: משלוחים, דיור, עיבוד סביבתי

  1. זכר ונקבה C57BL/6 עכברים (10-12 שבועות, n = 10/נקודת זמן) ו חולדות Wistar (10-12 שבועות, n = 10) שימשו במחקר זה.
  2. הבית אותם בתוך יבר בעלי חיים בשליטה סביבתית עם מזון ומים libitum המודעה.
  3. הרשו להם להסתגל לסביבה לפחות שבוע אחד לפני ניתוח השבץ.
    הערה: עכבר אחד ועכברוש אחד מתו ב-1 d לאחר ניתוח שבץ ועכבר אחד הורתו במהלך 3 d לאחר שבץ לפני הזרקת המועצה לבטחון לאומי מסיבות אנושיות בגלל שיתוק חמור.

3. תרבות העכבר ותאי גזע עצביים (NSCs)

הערה: NSCs היו מבודדים ומתורבתים בעקבות פרוטוקול מבוסס20.

  1. עכבר
    1. לבודד wildtype (WT) ו-GFP המסומנים NSCs מן הקליפה העובריים E18 מ בעיתוי-הריון נקבה C57BL/6 עכברים הזדווג עם העכברים מסוג GFP-חיובי (B6 ACTb-EGFP). כדי לזהות העוברים GFP (+), להתבונן העוברים שנקטפו על מיקרוסקופ פלואורסצנטית באמצעות ערוץ FITC. GFP (+) עוברים תשואה האות זריחה ירוק בעוד עוברי WT להראות רק חלש-פלואורסצנטית אוטומטי (איור 3A).
  2. עכברוש
    1. לבודד NSCs מאזור תת המוח (SVZ) של חולדות למבוגרים צעירים WT. סמן אותם עם DiI רק לפני להזרקה בעקבות ההוראות של היצרן21.
  3. העכבר התרבות או עכברוש NSCs עד שהם מתפתחים לתוך כדורים נוירועיים, ומעבר אותם כאשר קוטר הכדור מגיע סביב 100 יקרומטר (איור 3b). השתמש בNSCs לצורך הזרקה בין מעברים 3 ו-5.
  4. בדוק את מאפייני תא הגזע שלהם באמצעות פאנל גזע מעובריים הסמן (איור 3C).
  5. ביום של הזרקה, לאסוף כדורים המועצה לבטחון לאומי ולנתק עם פתרון הניתוק התא, להשעות את ה-PBS של סידן ומגנזיום לריכוז של 107 תאים/mL, ומניחים על קרח רטוב עד הזרקה.

4. הכנה כירורגית

  1. לפני הניתוח, סימון נקודה על תפר MCAO מסחרי עם עט סמן כסף ב 9 מ"מ (עבור העכבר) או 15 מ"מ (עבור עכברוש) מהקצה של התייחסות בניתוח של אורך ההכנסה. לחץ על כלי הניתוח (מספריים, מלקחיים) וכלים לפני כל ניתוח, והחום מעקר אותם באמצעות חרוז זכוכית החוטא בין המבצעים.
  2. לגרום הרדמה בבעלי חיים עם 5% isof, באמצעות אינהלציה ולשמור על הרדמה עם 1-2% isofלוריאן. להעריך את עומק ההרדמה באמצעות התבוננות של תנאים כלליים (דפוס נשימה, התנועה הקצנקר, ויציבה תיקון הגוף ספונטנית), רפלקס הקרנית ותגובה צביטה בבוהן.
  3. להטיל בעלי חיים מלאה על כרית חימום, ולהכין את האתר כירורגי על החיה על ידי מסיכה וקרצוף עם פתרון betadine ואחריו 70% אתנול. הגנו על העיניים של בעל החיים מפני ייבוש באמצעות משחה אופטלמולוגית (למשל, משחה דמעה מלאכותית) במהלך הניתוח.
  4. ותלבש מסכה, כפפות סטריליות. וחלוק מעבדה נקי

5. כירורגיה של עורק המוח האמצעי (MCAO)

הערה: הניתוחים כדי לגרום לשבץ האיסכמי בחצי הכדור האחד של העכבר או עכברוש דומים בכך תפר מוצג לתוך העורק הראשי העורק הפנימי (ICA) כדי לסגר את זרימת הדם (איור 4)17,18,19,22. עם זאת, העורק שנבחר להכנסת תפרים שונה בהתבסס על שטח הפעולה הזמין הנדרש להזרקה בעקבות תאי הגזע. לחולדה יש מספיק מקום בקטע של עורק הראש החיצוני (ECA) כדי לאפשר שני ניתוחים נפרדים, רציפים (שבץ והזרקת לבטחון לאומי), אך העכבר אינו דורש גישה חלופית. המושרה שבץ מוחין זרימת דם שינויים, גודל סיכונים המוח ופגיעות נוירולוגיות דווחו כמו בדוחות הקודמים של המחברים17,18,19.

  1. כדי לגרום לשבץ האיסכמי, להתחיל בשני ניתוחי עכבר ועכברוש עם חתך באמצע קו באזור צוואר הרחם, ובידוד של העורק הראשי המשותף השמאלי (אמנות עכשווית), ECA ו ICA (איור 4). היזהרו לא למתוח, להוציא או לסחוט את העצב אמנות עכשווית או תועה. מאחר שמבחר העורקים והניתוחים שונים לאחר מכן, הניתוח של MCAO על העכבר והחולדה יתואר בנפרד.
  2. ניתוח MCAO עלהעכבר (איור 4a)
    1. המקום שלוש קלוע 6-0 ניילון תפרים מתחת אמנות עכשווית (איור 4A, צעד 1), ולבצע אחד הקשר הכירורגי הדוק כדי לסגר את הספינה רחוק ככל האפשר באמצעות המחרוזת הקרוב ביותר (איור 4a, שלב 2). . קצץ את קצות התפרים
    2. הפוך קשר מעניין בצדו המרוחק של אמנות עכשווית (זהירות: לא מעל להדק כפי שהוא ישוחרר בשלב 6) וקשר רופף אחד בין שתי הקשרים התהדקו (איור 4A, שלב 2).
    3. חותכים חתך קטן (~ 1/4-1/3 של היקף) קרוב הקשר האבובית על אמנות עכשווית עם מיקרו מספריים (איור 4A, שלב 3), ובזהירות להכניס את גומי סיליקון מסחרי מצופה 7-0 התפר מוצק לתפור (איור 4a, שלב 4). אבטחו את התפר עם המיתר האמצעי, הידוק מספיק (איור 4A, שלב 5) כדי להבטיח שאין דליפת דם מהחתך ואין תנועה של הסיליקון גומי מצופה פילמנט על ידי הרקע של ICA, תוך שהוא עדיין מאפשר את ההתקדמות של תפר לכיוון ECA עם דחיפה עדינה על ידי הפינצטה.
    4. שחרר את הקשר העליון (המרוחק) (איור 4A, שלב 6) ולקדם את תפר ניילון לתוך ICA עד הטיפ שלה עובר את הבייון עבור 9 מ"מ (באמצעות סמן כסף על תפר כהפניה). הדקו את שני הקשרים העליונים כדי לאבטח את התפר ומנעו את זרימת הדם.
    5. למשוך את חוט הלהט 1 מאוחר יותר (איור 4a, שלב 7) ו פסיקים אמנות עכשווית באמצעות הקשר האמצעי כדי למנוע דימום (איור 4a, שלבים 5-7 בסדר הפוך, התוצאות הסופיות כפי שנראה בשלב 8). . שחררו את הקשר העליון סגרו את הפצע עם. תפר 4-0 כירורגי
  3. כירורגיה של MCAO על חולדה (איור 4B)
    1. מקום שני קלוע 6-0 ניילון תפרים מתחת ECA (איור 4B, שלב 1), ולעשות קשר הדוק אחד בקצה המרוחק ככל האפשר (איור 4b, שלב 2).
    2. מניחים את כלי הקיבול על ה-ICA ו-אמנות עכשווית לסגר את זרימת הדם העורקי (איור 4B, שלב 3). ניתן להשתמש בקשר מוכן כחלופי עבור קליפ של כלי קיבול.
    3. לעשות חתך קטן על ECA עם מיקרו מספריים (איור 4B, שלבים 3-4), הכנס מסחרי גומי סיליקון מצופה 6-0 חוט ניילון (איור 4b, שלב 5), ובטוח כראוי עם קשר מתוך העסקה ב-eca.
    4. שחררו את הקליפ על ה-ICA, התקדמו את החוט לתוך ה-ICA עד שסמן הכסף (15 מ"מ) יגיע לביקטיון (איור 4b, שלב 6), ולאחר מכן אבטחו את התפר עםהקשר השני על ה-ECA (איור 4b, שלב 6).
    5. אחרי 1 h של איסכמיה, למשוך את החוט הזה להוריד את החתך כדי למנוע דימום (איור 4B, שלב 7), להסיר את קליפ כלי מ אמנות עכשווית (התוצאה הסופית כמו בשלב 8), ולסגור את הפצע עם תפר כירורגי 4-0.

6. שחזור

  1. לאחר ניתוח שבץ, מניחים בעלי חיים על משטח חימום עד שהם מחדש לחלוטין את התודעה.
  2. לספק חוסר כאבים. באמצעות הזרקה תת-עורית החזר בעלי חיים לכלובים הבית שלהם עם גישה למים ומזון libitum.

7. הזרקת פנים-עורקים

  1. לשטוף את הצנתר כולו עם 70% אתנול ולהשרות לילה עד השימוש. ממש לפני הזריקה, לחבר את נעילת Luer של המחט עם מזרק סטרילי, ולשטוף את הצד לומן כולו של מערכת הקטטר עם 10 מ ל של ה-PBS סטרילי.
  2. חלון זמן והכנה להזרקת המועצה לבטחון לאומי
    הערה: מבוסס על ניסיון ודוחות מצוותי מחקר אחרים, העיתוי להזרקת המועצה לבטחון לאומי הוא חיוני להישרדות של שני הנושאים והאקסוגני NSCs. במחקר הפיילוט שלנו, הזרקה של NSCs בנקודות זמן מוקדם (בתוך 6 h הראשון אחרי reperfusion) הוביל לתמותה גבוהה יותר. כך, בדקנו מאוחר יותר נקודות זמן הזרקה וקבע את חלון הזמן בין 2 ד (48 h) ל 3 ד (72 h) לאחר השבץ הוא בטוח נסבל עבור בעלי חיים, והוא יעיל בהשגת התפלגות הפנימי של NSCs. תוצאות שהוצגו בזאת הם מבעלי חיים קיבל הזרקת לבטחון לאומי 3 d לאחר הפציעה
    1. הגדר את קצב ההזרקה של משאבת המזרק במהירות 20 μL/min עבור עכברים ו-50 μL/min עבור חולדות. מהירות מופרזת או משך ההזרקה עלולים לגרום לעומס יתר של נפח מערכתי, שעכברים פגיעים יותר מחולדות.
    2. בקצרה, ב 3 ד לאחר ניתוח שבץ, להטיל את בעלי החיים עם isof, להניח אותם פרקדן על כרית חימום.
    3. פתח מחדש את הפצע בצוואר הרחם ולחשוף את ECA, ICA ו אמנות עכשווית שוב (איור 5, שלב 1). כמו בניתוחי שבץ, לקבוע את תוואי ההזרקה על בסיס המינים. נצל את אמנות עכשווית הזרקת המועצה לבטחון לאומי בעכבר, ו-ECA עבור החולדה23.
  3. הזרקת פנים-עורקים דרך אמנות עכשווית בעכבר
    1. מקום שני 6-0 התפרים קלועה הניילון תחת אמנות עכשווית. יצירת קשר רופף עם כל אחד מהם בין הביפריון לבין קשרים התחתון מהניתוח שבץ הקודם (איור 5, שלב 2).
    2. הדקו את הקשר העליון ולאחר מכן עשו חתך קטן מעל הקשר התחתון (איור 5, שלב 3). הכנס קטטר MRE010 דרך החתך (איור 5, שלב 4) ובטוח עם הקשר האמצעי מבלי לחסום את זרימת ההזרקה (איור 5, שלב 5). Backflow של דם צריך להיות גלוי הקטטר בעת שחרור הקשר העליון והתאמת מיקום קטטר.
    3. מקום קליפ על ה-ECA, להזריק 1 x 106 Gfp-NSCs דרך קטטר זה ב 20 μl/min עבור 5 דקות עם משאבת מזרק, ואחריו סומק עם 50-100 ΜL של PBS באותו מהירות.
    4. לאחר הזרקה, פסיקים אמנות עכשווית מעל החתך עם הקשר להחליק העליון ולסגת את הצנתר MRE010 (איור 5, שלב 6). להדק ולחתוך את הקשר האמצעי ואת הקשר העליון. הסר את קליפ הכלי מ-ECA. עיין בתמונה הסופית באיור 5, שלב 7.
    5. סגרו את הפצע עם. תפר 4-0 כירורגי
    6. לאחר מתן התאוששות נאותה על כרית חימום והזרקת כאבים תת עורית, להחזיר בעלי חיים לכלוב הבית שלהם.
  4. הזרקת פנים-עורקים דרך ה-ECA בחולדה
    1. הסגר זמנית את ה-ECA ואת אמנות עכשווית עם הקליפים (איור 5, שלב 2).
    2. לעשות חתך קטן בצד הטוב ביותר של ECA (איור 5, שלב 3), להכניס את קטטר MRE010, ומאובטח עם קשר (איור 5, שלב 4).
    3. הסר את שני כלי הקיבול, הזרק 5 x 106 NSCs ב 100 μl של PBS ב 50 μl/min עבור 2 דקות, ואחריו ריקון עם 50-100 μl של PBS (איור 5, שלב 5) באותה מהירות, באמצעות משאבת מזרק ממונע.
    4. לאחר ההזרקה, סגר את אמנות עכשווית ו-ECA עם כלי הקיבול שוב וליגייט ב-ECA בצד הקרוב ביותר של החתך השני לאחר נסיגה של קטטר ההזרקה (איור 5, שלב 6).
    5. הסירו את שני התפסים (איור 5, שלב 7) וסגרו את הפצע עם תפר 4-0 כירורגי.
    6. לאחר מתן התאוששות נאותה על כרית חימום והזרקת כאבים תת עורית, להחזיר בעלי חיים לכלוב הבית שלהם.
  5. שיטת היסטולוגית
    1. לאסוף מוחות מעכברים וחולדות שהתקבלו שבץ איסכמי ואחריו הזרקה של NSCs או הרכב הפתרון לאחר המתת החסד ו הפריה תאיים עם 4% פאראפורמלדהיד ב 1 d (עכבר ועכברוש), 7 ד (עכבר) ו-30 d (העכבר) לאחר ההזרקה. כל אחת מארבע הקבוצות הללו הייתה בעלת 5 להמועצה לבטחון לאומי ו -5 חיות מוזרקים.
    2. תקן את המוח בלילה והקפאה של 30% סוכרוז במשך 3 מטרים.
    3. להטביע את המוח לתוך OCT, פרוסה בעובי 40 יקרומטר, ולבחון את התפלגות NSCs לאחר מעטפת חיסונית עם סמנים ספציפיים לתא, כולל חלבון חומצי fibrillary (gfap, astrocytes), Tuj1 (נוירונים בוגרים), ו doublecortin (dcx, בוגר נוירונים).
      הערה: בשל העדר זן חולדה המבטא GFP, אנו מנוצל DiI, תווית פלורסנט ארעית, עבור עכברוש NSCs, אשר מאפשר רק התבוננות לטווח קצר יחסית. לפיכך, התפלגות המועצה לבטחון לאומי נבדקה רק ב-1 ד' לאחר שבץ בחולדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

GFP שכותרתו NSCs זוהו בקלות במוח האיסכמי, בעיקר בחצי הכדור השדרה, במיוחד בתוך penרומבה ולאורך שפת הפציעה (איור 6). הבוחן היה עיוור. במהלך הדמיה וניתוח

לדוגמה, ב-1 ד לאחר ההזרקה, NSCs זוהו בתוך ההיפוקמפוס של העכבר. קבוצת משנה של NSCs הראה ביטוי משותף של הסמן תא העצב הילדותי dcx ב פיתול כישור ה, אפילו בנקודת זמן מוקדמת זו (איור 6a).

ב 10 ד ' אחרי קו (7 ד ' לאחר הזרקת המועצה לבטחון לאומי), אקסוגני GFP-NSCs נצפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טיפול בתאי גזע למחלות נוירולוגיות עדיין נמצא בשלב מוקדם של הבדיקה. בעיה אחת גדולה היא שאין שיטה מבוססת למסירה מספקת של ה scs או NSCs לתוך המוח.

למרות אקסודוגני ה scs/NSCs ניתן לזהות במוח בעקבות ורידי (IV), בתוך הצפק (IP) או הזרקת הפנימי/גרם, כל גישת מסירה יש חסרונות. האוכלוסיה הניתן לזיהוי בתוך המוח מוערך מאוד נמוך עם הזרקה היקפית (IV או IP), המייצג רק חלק קטן של התאים הוזרק או מוחדרת. גרם הזרקת תשואות התפלגות מיקוד מאוד, ואולי ישירות לגרום לפציעה במוח2,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

מחקר זה היה נתמך על ידי הבאים: פרס AHA 14SDG20480186 עבור LC, בנושא חדשנות צוות של אוניברסיטת שאנש של הרפואה הסינית 2019-QN07 עבור BZ, ו קנטאקי חוט השדרה והראש פגיעה מחקר אמון גרנט 14-12A עבור KES ו-LC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
20 גרם מחטבקטון & DickinsonBD PrecisionGlide 305175הכנת קטטר הזרקה
26 גרם מחטBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305111הכנת קטטר הזרקה
27 גרם מחטBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305136הכנת קטטר הזרקה
4-0 תפר NFS-2 עם מחטהנרי שיין בריאות בעלי חיים56905ניתוח
6-0 תפר ניילוןTeleflex/Braintree Scientific104-sניתוח
AccutaseSTEMCELL Technologies7922תמיסת ניתוק תאים
Bard-Parker10ניתוח
מעבדת בופרנורפין-SRZooPharmבופרנורפין-SR Lab®משככי כאבים (0.6-1 מ"ג/ק"ג על פני 3 ימים)
ללא סידן/מגניסום PBSVWR02-0119-0500NSC dissociation
נוגדן DCXMilliporeAB2253צביעה חיסונית
נוגדן GFAPInvitrogen180063צביעה חיסונית
איזופלורןהנרי שיין בריאות בעלי חיים50562-1ניתוח
נימה MCAO לעכברניתוחDoccol702223PK5Re
נימה MCAO לחולדהDoccol503334PK5Reניתוח
MRE010 קטטרBraintree ScientificMRE010הכנת קטטר הזרקה
MRE025קטטר Braintree ScientificMRE025הכנת קטטר הזרקה
MRE050 קטטרBraintree ScientificMRE050הכנת קטטר הזרקה
Nu-Tears משחהNuLife PharmaceuticalsNu-Tears משחהלטיפול בעיניים במהלך ניתוח
S& מלקחיים T - טיפים SuperGrip JF-5TC כלי מדע עדינים בזווית00649-11ניתוח
S& מלקחיים T - טיפים SuperGrip JF-5TC StraightFine Science Tools00632-11ניתוח
SupergluePacer Technology15187מזרק קטטר הזרקה
קנט ScientificGenieTouchניתוח
Tuj1 נוגדןMilliporeMAb1637צביעה חיסונית
דו-רכיבית 5 דקות אפוקסיDevcon20445הכנת קטטר הזרקה
מספריים קפיצי VannasFine Science Tools15000-08ניתוח
מהדקי כלי דםFine Science Tools00400-03ניתוח
מיקרוסקופZeiss ZeissAxio Imager 2מיקרוסקופיה
להב הכנת משאבת

מקורות

  1. Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
  2. Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
  3. Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154(2018).
  4. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
  5. Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
  6. Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
  7. Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
  8. Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
  9. Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
  10. Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758(2017).
  11. Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
  12. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
  13. Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
  14. Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
  15. Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
  16. Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155(2015).
  17. Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
  18. Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967(2015).
  19. Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
  20. Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001(2013).
  22. Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  23. Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  24. Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
  25. Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
  26. Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עורק תרדמי משותףעורק תרדמי חיצוניחסימת העורק המוחי האמצעיתאים מסומני GFPווים כירורגייםקטטר להזרקהטיפול בתאי גזע
משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.