מאמר שיטה

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

DOI:

10.3791/61127

⸱

16 במאי 2020

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, St. Jude Children's Research Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה ממחיש את 1) הבידוד והתרבות של פיברובלסטים ראשוניים משריר הגסטרוקנמיוס של העכבר הבוגר, כמו גם 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בשילוב עם שיפועי צפיפות סוכרוז ולאחר מכן ניתוחי כתמים מערביים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים הם בועיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות כמעט על ידי כל התאים ומופרשות בכל הנוזלים הביולוגיים. שיטות רבות פותחו לבידוד שלפוחיות אלה, כולל אולטרה-צנטריפוגה, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. עם זאת, לא כולם מתאימים לטיהור ואפיון אקסוזום בקנה מידה גדול. להלן פרוטוקול לביסוס תרביות של פיברובלסטים ראשוניים שבודדו משרירי השלד של עכברים בוגרים, ולאחר מכן טיהור ואפיון של אקסוזומים מתרבית של תאים אלה. השיטה מבוססת על שימוש בשלבי צנטריפוגה רציפים ולאחריהם שיפועי צפיפות סוכרוז. טוהר התכשירים האקסוזומליים מאומת לאחר מכן על ידי ניתוחי כתמים מערביים באמצעות סוללה של סמנים קנוניים (כלומר, Alix, CD9 ו- CD81). הפרוטוקול מתאר כיצד לבודד ולרכז אקסוזומים ביו-אקטיביים עבור מיקרוסקופ אלקטרונים, ספקטרומטריית מסות וניסויי ספיגה עבור מחקרים פונקציונליים. ניתן בקלות להגדיל או להקטין אותו ולהתאים אותו לבידוד אקסוזום מסוגי תאים, רקמות ונוזלים ביולוגיים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים הם שלפוחיות חוץ-תאיות הטרוגניות שגודלן נע בין 30-150 ננומטר. הם שחקני מפתח מבוססים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בהתחשב בתפוצה שלהם בכל מקום ברקמות ואיברים 1,2. אקסוזומים נושאים מטען מורכב של חלבונים, ליפידים, סוגי דנ"א וסוגי רנ"א, המשתנים בהתאם לסוג התאים שמהם הם נגזרים 1,2,3. אקסוזומים מועשרים בחלבונים בעלי תפקידים שונים (כלומר, טטרספאנינים, כולל CD9 ו- CD63) אחראים לאירועי היתוך. לדוגמה, חלבוני הלם חום HSP70 ו- HSP90 מעורבים בקשירת אנטיגן והצגתו. בנוסף, Alix, Tsg101 ושייטת משתתפים בביוגנזה ושחרור אקסוזומים, ונמצאים בשימוש נרחב כסמנים של ננו-שלפוחיות אלה 2,3,4.

אקסוזומים מכילים גם מגוון של רנ"א (כלומר, מיקרו-רנ"א, רנ"א ארוך שאינו מקודד, רנ"א ריבוזומלי) שניתן להעביר לתאים מקבלים, שם הם משפיעים על איתות במורד הזרם3. בהיותה מוקפת בקרום יחידה אחת, פעילות ביולוגית אקסוזום תלויה לא רק במטען של חלבונים וחומצות גרעין, אלא גם ברכיבי שומנים של הממברנה המגבילה1. ממברנות אקסוזומליות מועשרות בפוספטידיל-סרין, חומצה פוספטידית, כולסטרול, ספינגומיילין, חומצה ארכידונית וחומצות שומן אחרות, שכולם יכולים להשפיע על יציבות האקזוזום ועל טופולוגיית הממברנה 2,3. כתוצאה מסידור המטען והשומנים, אקסוזומים יוזמים מסלולי איתות בתאים קולטים ומשתתפים בשמירה על פיזיולוגיה תקינה של רקמות 1,2,4,5. בתנאים פתולוגיים מסוימים (כלומר, ניוון עצבי, פיברוזיס וסרטן), הם הוכחו כמעוררים ומפיצים גירויים פתולוגיים 4,6,7,8,9,10,11.

בשל יכולתם להפיץ אותות לאתרים שכנים או מרוחקים, אקסוזומים הפכו לסמנים ביולוגיים יקרי ערך לאבחון או פרוגנוזה של מצבי מחלה. בנוסף, אקסוזומים שימשו באופן ניסיוני ככלי רכב של תרכובות טיפוליות 2,12. היישום הפוטנציאלי של ננו-שלפוחיות אלה במרפאה הופך את שיטת הבידוד לחשובה יותר ויותר על מנת להשיג תפוקה מרבית, טוהר ויכולת שחזור. טכניקות שונות לבידוד אקסוזומים פותחו ויושמו. באופן כללי, ניתן לבודד אקסוזומים ממדיה מותנית של תרביות תאים או נוזלי גוף על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ולכידת מערכת החיסון (באמצעות ערכות מסחריות). לכל גישה יתרונות וחסרונות ייחודיים שנדונו בעבר 1,2,13,14.

הפרוטוקול המתואר מתמקד ב 1) בידוד ותרבית של פיברובלסטים ראשוניים משריר גסטרוקנמיוס עכבר בוגר 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים המשתחררים למדיום התרבית על ידי תאים אלה. פרוטוקול מבוסס היטב לבידוד אקסוזומים מפיברובלסטים ראשוניים למחקרים פונקציונליים חסר כיום. פיברובלסטים ראשוניים אינם מפרישים כמויות גדולות של אקסוזומים, מה שהופך את תהליך הבידוד והטיהור למאתגר. פרוטוקול זה מתאר טיהור של כמויות גדולות של אקסוזומים טהורים מנפחי תרבית גדולים תוך שמירה על שלמותם המורפולוגית ופעילותם התפקודית. אקסוזומים מטוהרים המתקבלים מתווך מותנה שימשו בהצלחה בניסויי קליטה חוץ גופית כדי לגרום למסלולי איתות ספציפיים בתאים המקבלים. הם שימשו גם לניתוח פרוטאומי השוואתי של מטענים אקסוזומליים מדגימות ביולוגיות מרובות4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בעכברים בוצעו על פי פרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו על ידי בית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד, הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות.

1. הכנת פתרונות ומדיה

  1. הכן את תמיסת העיכול על-ידי ערבוב של 15.4 מ"ל PBS עם 2.5 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל קולגנאז P (ריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל), 2 מ"ל של 11 U/mL dispase II (ריכוז סופי של 1.2 U/mL), ו-100 μL של 1.0 M CaCl2 (ריכוז סופי של 5 mM).
  2. הכן 500 מ"ל של פיברובלסטים ראשוניים בינוניים (DMEM מלא) על ידי ערבוב 440 מ"ל של DMEM עם 50 מ"ל של FBS (10%), 5.0 מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס (100 U / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) ו 5.0 מ"ל של תוסף גלוטמין (2 מ"ל). סנן וחטא את המדיום באמצעות מסנן ואקום בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר.
  3. הכינו סרום נטול אקסוזום על ידי אולטרה-צנטריפוגה בת לילה של FBS בצינורות פוליפרופילן של 38.5 מ"ל ב-100,000 x גרם ב-4°C והעבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש.
  4. הכן 500 מ"ל של מדיום ללא אקסוזום על ידי ערבוב 440 מ"ל DMEM עם 50 מ"ל של סרום ללא אקסוזום (10%), 5 מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס (100 U / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל), ו 5 מ"ל של תוסף גלוטמין (2 מ"ל). סנן וחטא את המדיום באמצעות מסנן ואקום בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר.
  5. הכן 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4) על ידי המסת 6.057 גרם של בסיס Tris ב 90 מ"ל של dH 2 O והתאמתה- pH ל 7.4 עם HCl. כוונן את עוצמת הקול ל 100 מ"ל עם dH2O.
  6. הכן 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)/1 mM Mg(Ac)2 solution (תמיסת עבודה סוכרוז) על ידי ערבוב 97.9 מ"ל של dH 2 O עם 2 מ"ל של 0.5 M Tris-HCl (pH = 7.4) ו- 100 μL של 1 M Mg(Ac)2. הוסיפו מעכבי פרוטאז לתמיסה ממש לפני השימוש ושמרו את התמיסה על קרח.
  7. הכינו תמיסות שיפוע צפיפות סוכרוז על קרח לפי טבלה 1. פתרונות אלה מספיקים כדי להכין שני צינורות שיפוע סוכרוז.
  8. מכינים 100% TCA על ידי הוספת 40 מ"ל של dH2O עד 100 גרם אבקת TCA ומערבבים עד להמסה מלאה. כוונן את עוצמת הקול הסופית עם dH2O עד 100 מ"ל.
  9. להכין 80% אתנול על ידי ערבוב 20 מ"ל של dH2O עם 80 מ"ל של 100% אתנול.
  10. הכן את מאגר הריצה של הכתם המערבי על ידי ערבוב 1.8 ליטר של dH2O עם 200 מ"ל של חיץ ריצה 10x.
  11. הכן את מאגר העברת הכתם המערבי על ידי ערבוב 1.4 ליטר של dH2O עם 200 מ"ל של מאגר העברה 10x ו- 400 מ"ל מתנול. מצננים מראש את מאגר ההעברה ל-4°C.
  12. הכן 20x Tris-buffered מלוחים (TBS) על ידי המסת 122 גרם של בסיס Tris ו 180 גרם של נתרן כלורי ב 850 מ"ל של dH2O (pH 8.0). כוונן את עוצמת הקול ל- 1 L עם dH2O.
  13. הכן חיץ חוסם על ידי המסת 5 גרם חלב יבש ללא שומן עם 1 מ"ל של 10% Tween-20, 5 מ"ל של 20x TBS, ו 94 מ"ל של dH2O.
  14. הכן מאגר נוגדנים על ידי המסת 3 גרם של BSA עם 1 מ"ל של 10% Tween-20, 5 מ"ל של 20x TBS, ו 94 מ"ל של dH2O.
  15. הכינו את מאגר הכביסה על ידי ערבוב 100 מ"ל של 20x TBS ו-20 מ"ל של 10% Tween-20 (10x) עם 1.88 ליטר של dH2O.
  16. הכן את תמיסת הפיתוח על-ידי ערבוב נפח 1 של לומינול/שיפור עם נפח אחד של חיץ מי חמצן יציב.

2. דיסקציה של שריר העכבר גסטרוקנמיוס (GA)15,16

  1. הכינו צינורות של 50 מ"ל המכילים PBS של 10 מ"ל על קרח.
  2. הרדימו את העכברים בתאCO2 ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
  3. הסר את שריר הגסטרוקנמיוס משתי הרגליים והעבר אותם לצינור עם PBS על קרח.
    הערה: הסר את שריר הסולאוס משריר GA לפני העברת שריר GA ל- PBS.

3. בידוד ותרבית פיברובלסטים ראשוניים של עכבר

  1. שוקלים את השרירים ומעבירים אותם לצלחת של 10 ס"מ מתחת למכסה מנוע בטיחות ביולוגית. טוחנים את השרירים באזמלים עד שהוא הופך לעיסה דקה.
  2. מעבירים את משחת השרירים הטחונה דק לצינור של 50 מ"ל ומוסיפים לצינור 3.5x רקמת נפח/מ"ג של תמיסת עיכול ודגרים במשך 45 דקות ב-37°C. מערבבים היטב את המתלה עם צינור 5 מ"ל כל 10 דקות (זה יעזור לדיסוציאציה מוחלטת).
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במפיץ רקמות לשלב זה.
  3. הוסף 20 מ"ל של DMEM להשלים את השעיית התא כדי להשבית את פתרון העיכול. מעבירים למסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר המונחת על צינור 50 מ"ל. אסוף את הזרימה ושטוף את מסננת התא עם 5 מ"ל נוספים של DMEM מלא.
  4. צנטריפוגו את מתלה התא ב-300 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות והוציאו בזהירות את הסופרנטנט.
  5. להשעות מחדש את הגלולה ב 10 מ"ל של DMEM להשלים ולזרוע את התאים לתוך צלחת 10 ס"מ.
  6. תרבית את התאים ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2 (מעבר 0 או P0).
    הערה: 1) תרביות אלה צריכות להישמר ברמת חמצן נמוכה כדי להבטיח תנאים פיזיולוגיים (רמת O 2 בשרירי השלד היא סביב2.5%)17. 2) מספר המעבר (למשל, P0) של תרבית תאים הוא תיעוד של מספר הפעמים שהתרבית עברה תת-תרבית. 3) פיברובלסטים ראשוניים ב-P0 מתורבתים באופן שגרתי עד 100% מפגש פלוס יום אחד (ורק עבור P0). זאת כדי לטהר סוגים אחרים של תאים ולהבטיח שהתאים הנמצאים בתרבית הם רק פיברובלסטים, מרוקנים מתאים מיוגניים על סמך בדיקת מיקרוסקופ. שריר השלד של חיה בוגרת בגיל חודשיים מכיל כ -2% אבות מיוגניים4. בנוסף, אבות מיוגנים בדרך כלל אינם מתחברים למנות הלא מצופות; לכן, הם הולכים לאיבוד במהלך subculturing18,19,20. תאים מיוגניים דורשים תווך שונה (F10) בתוספת 20% FBS וגורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF)18. ב DMEM שלם, פיברובלסטים בינוניים יש קצב התרבות גבוה יותר מאשר תאים מיוגניים, אשר גורם חיסול של תאים מזהמים אלה לפני המעבר הראשון.
  7. שטוף את תאי P0 עם PBS כאשר 100% confluent בתוספת 1 יום. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסיניזציה ודגר ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2 כדי לנתק את התאים. עצור את הפעילות האנזימטית באמצעות 10 מ"ל של DMEM מלא.
  8. צנטריפוגות את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב RT ו resuspend את הגלולה ב 20 מ"ל של DMEM להשלים זרע לתוך צלחת 15 ס"מ (מעבר 1 או P1). התאים גדלים עד 80%-90% מפגש וניתן להרחיב אותם עד מעבר 3.
    הערה: בהתאם לניסויים במורד הזרם, ניתן להשתמש במעבר 1, מעבר 2 (P2) או מעבר 3 (P3).

4. זריעת תאים ואיסוף מדיום מותנה

  1. שטפו את הפיברובלסטים (P1, P2 או P3) עם 10 מ"ל PBS, הוסיפו 2.5 מ"ל של תמיסת טריפסיניזציה לתאים ודגרו ב-37°C, 5% CO 2, 3% O2. עצור פעילות אנזימטית באמצעות 10 מ"ל של DMEM מלא.
    הערה: לאחר קטע 4, תאים ראשוניים מושלכים ואין להשתמש בהם לניסויים נוספים, מכיוון שהם משנים מאפיינים.
  2. אסוף את התאים והצנטריפוגה ב 300 x גרם ב RT במשך 10 דקות.
  3. השהה מחדש את גלולת התא ב -10 מ"ל של תווך נטול אקסוזום וספור את התאים.
  4. זרעו את התאים ב 1.5-2.0 x 106 תאים לצלחת (15 ס"מ) ודגרו ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2.
  5. אספו את התווך המותנה בין 16-24 שעות בצינורות של 50 מ"ל על קרח.
    הערה: אם התאים אינם חופפים ב-80%, ניתן להוסיף שוב תווך חופשי אקסוזומלי טרי ולאסוף אותו לאחר תקופה נוספת של 16-24 שעות. ניתן לשלב את שני האוספים לעיבוד נוסף.

5. טיהור אקסוזומים באמצעות דיפרנציאל ואולטרה-צנטריפוגה

הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורה של 4°C או על קרח. אזנו את הצינור עם צינור מלא במים בעת הצורך.

  1. צנטריפוגה את התווך המותנה ב 300 x גרם במשך 10 דקות להסרת תאים חיים ולהעביר את supernatant לצינור חדש 50 מ"ל.
  2. הסר תאים מתים על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור פוליפרופילן 38.5 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 10,000 x גרם במשך 30 דקות להסרת אברונים, גופים אפופטוטיים, ושברי ממברנה. מעבירים את הסופרנאטנט לשפופרת אולטרה-שקופה בנפח 38.5 מ"ל.
  4. אולטרה-צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 100,000 x גרם במשך 1.5 שעות כדי לגלול את האקסוזומים.
  5. בזהירות להשליך את supernatant, משאיר כ 1 מ"ל של מדיום מותנה, ולשטוף את גלולה exosome בנפח כולל של 30 מ"ל של PBS קר כקרח.
  6. צנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 1.5 שעות בזהירות להשליך את supernatant על ידי pipetting, נזהר לא להפריע גלולה exosomal.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב- PBS קר כקרח (~ 25 μL לכל צלחת של 15 ס"מ) ומדדו את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA וקורא מיקרו-צלחות ב- 562 ננומטר.
    הערה: ריכוז החלבון נמדד על ידי דילול 1:2 עם 0.1% Triton-X100 ב-dH2O. התפוקה של אקסוזומים מצלחת של 15 ס"מ (20 מ"ל של תווך מותנה) של פיברובלסטים ראשוניים במפגש של 80% היא ~3-4 מיקרוגרם.

6. אפיון אקסוזומים על ידי שיפוע צפיפות סוכרוז

  1. טען את שיפוע הסוכרוז בצינור אולטרה-ברור של 13 מ"ל על ידי פיפטציה (מלמטה למעלה) את הדברים הבאים: 1.5 מ"ל של 2.0 מטר, 2.5 מ"ל של 1.3 מטר, 2.5 מ"ל של 1.16 מטר, 2.0 מ"ל של 0.8 מטר ו-2.0 מ"ל של תמיסות סוכרוז 0.5 מטר.
  2. ערבבו 30–100 מיקרוגרם של אקסוזומים עם תמיסת סוכרוז 0.25 מ' וכווננו את הנפח ל-1 מ"ל.
  3. טען בזהירות את האקסוזומים על גבי שיפועים ואולטרה צנטריפוגה את הדגימות במשך 2.5 שעות ב 100,000 x גרם ו 4 ° C.
  4. הסר את הצינורות מהאולטרה-צנטריפוגה והנח אותם על קרח ואסוף שברים של 1.0 מ"ל החל מראש השיפוע. העבר אותם צינורות 1.7 מ"ל על קרח.
  5. הוסיפו 110 μL של 100% TCA לכל צינור, ערבבו היטב ודגרו במשך 10 דקות ב-RT.
  6. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 10,000 x גרם ו RT בזהירות להשליך את supernatant.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב 500 μL של אתנול 80% מקורר מראש ולהשאיר את הדגימות לשטוף במשך 10 דקות ב -20 ° C.
  8. צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 10,000 x גרם ו-4°C והשליכו את הסופרנטנט.
  9. יבש את הגלולה למשך 10-15 דקות ב- RT והשהה מחדש את הגלולה ב- PBS לניסויים במבחנה. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA או השהה מחדש את הגלולה ישירות ב- 14.5 μL של dH2O, 5 μL של 4x Laemmli buffer ו- 0.5 μL של 1 M DTT עבור ניתוחי כתמים מערביים.

7. זיהוי אקסוזום על ידי ניתוח כתמים מערביים

  1. ערבבו 5-10 מיקרוגרם של אקסוזומים משלב 5.7 עם 5 μL של 4x Laemmli buffer, ו-0.5 μL של 1 M DTT, ולאחר מכן התאימו את הנפח הסופי ל-20 μL עם dH2O. חממו את כל הדגימות, כולל אלה בשלב 6.9, למשך 5 דקות ב-98°C.
  2. יש להעמיס את הדגימות לג'ל 10% TGX ללא כתמים ולהעמיס את סולמות החלבונים בהתאם להמלצות היצרן.
    הערה: בחר את אחוז הג'ל בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון המעניין.
  3. הפעל את הג'ל ב 100 V במשך ~ 1 שעות במאגר ריצה עד צבע ההעמסה נמצא בתחתית הג'ל.
    הערה: זמן הפעולה עשוי להשתנות בהתאם לציוד שבו נעשה שימוש או לסוג ולאחוז הג'ל.
  4. דמיינו את הג'ל. תמונות של הג'לים נטולי הכתמים משמשות כבקרת העמסה עבור אימונובלוטים.
  5. העבירו את הג'ל באמצעות קרום PVDF למשך שעה וחצי ב-80 וולט או למשך הלילה ב-30 וולט ב-4°C.
  6. חסום את הממברנות במאגר חוסם למשך שעה אחת ב- RT.
  7. יש לדגור על הממברנות לאיתור נוגדנים ספציפיים (טבלה 2) במאגר נוגדנים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם תסיסה.
  8. שטפו את הממברנות בחיץ השטיפה ודגרו על הממברנות עם הנוגדנים המשניים המתאימים (טבלה 2) למשך שעה אחת ב- RT עם תסיסה.
  9. שטפו את הממברנות במאגר הכביסה ודמיינו את הממברנות באמצעות תמיסת פיתוח ומצלמה מבוססת מצלמה. לחלופין, השתמש בסרט רנטגן כדי לפתח את הממברנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאים לטיהור אקסוזומים מכמויות גדולות של מדיום מותנה בצורה חסכונית. ההליך הוא מאוד לשחזור ועקבי. איור 1 מראה תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של אקסוזומים שטוהרו ממדיום התרבית של פיברובלסטים ראשוניים בעכברים. איור 2 מראה את תבנית ביטוי החלבונים של סמנים אקסוזומליים קנוניים, ואת היעדרם של מזהמים חלבוניים ציטוסוליים (LDH) ו-ER (קלנקסין). איור 3 מראה את ההתפלגות של סמנים אקסוזומליים קנוניים (Alix, CD9 ו-CD81) לאחר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צעד קריטי לבידוד מוצלח של אקסוזומים מאמצעי התרבות, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, הוא הקמה ותחזוקה נכונה של תרביות פיברובלסטים ראשוניים של עכברים משרירי שלד בוגרים. תרביות אלה צריכות להישמר ברמת חמצן נמוכה כדי להבטיח תנאים פיזיולוגיים (רמת O2 בשרירי השלד היא ~2.5%)15. פיברובלסטים ראשוניים ישנו מאפיינים כאשר הם מועברים בתרבית פעמים רבות מדי. לפיכך, מספר מעבר נמוך הוא הכרחי עבור תשואה אקסוזום אידיאלי. אקסוזומים מטוהרים יש להשתמש מיד למטרות ניסיוניות או לשמור קפוא ב aliquots ב -80 ° C עד הצורך. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלסנדרה ד'אזו מחזיקה בקתדרה לתכשיטנים לילדים (JFC) בגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH R01GM104981, RO1DK095169 ו-CA021764, קרן אסיזי מממפיס וארגוני הצדקה האמריקניים הלבנוניים הסוריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כלים 10 ס"מMidwest Scientific, TPPTP93100
15 ס"מ כליםBCA במערב התיכון ScientificTP93150
BCAThermo Fisher Scientific, Pierce23225
סרום בקר אלבומין Fraction VRoche10735094001
CaCl2SigmaC1016-100G
צנטריפוגה 5430R עם רוטורים FA-35-6-30/ FA-45-48-11Eppendorf022620659/5427754008
Chemidoc MP מערכת הדמיהBioRad12003154
Collagenase PSigma, Roche11 213 857 001100 מ"ג
קוקטייל מעכב פרוטאז cOmpleteMillipore/Sigma, Roche11697498001
Criterion Blotter עם אלקטרודות צלחתBioRad
ג'ל חלבון ללא כתמים Criterion TGXBioRad567803410% 18 בארות, מידי-ג'ל
Criterion תא אלקטרופורזה אנכית (midi)BioRadNC0165100
Dispase IISigma, Roche04 942 078 001פרוטאז ניטרלי, דרגה II
DithiothreitolSigma/Millipore, Roche10708984001
דולבקו s שינוי איגלס בינוניקורנינג15-013-CV
Dulbecco' s פוספט חוצץמלח קורנינג21-031-CV
אתנול 200 הוכחהפארמקו מאת Greenfield Global111000200
Falcon 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםקורנינג352070
סרום בקר עובריGibco10437-028
Fluostar Omega קורא מיקרו-פלטות רב-מצביBMG Labtech
GlutaMAX תוסףתרמו פישר סיינטיפיק, Gibco35050-061
חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיקA144S-500
ממברנות העברת אימובילון-PMilliporeIPVH00010
Laemmli מאגר דגימה (4x)BioRad1610747
תמיסת מגנזיום אצטטסיגמא63052-100 מ"ל
חלב יבש ללא שומןחממת LabScientificM-0842
O2/CO2 חממהSanyoMC0-18M
פניצילין-סטרפטומיציןThermo Fisher Scientific, Gibco15140-12210,000 U/ml
צינורות מיקרוצנטריפוגה פרימיוםFisher Scientific, Midwest ScientificAVSC15101.7 מ"ל
אזמלחד פעמי מוגןפישר סיינטיפיק, אספן כירורגי בארד-פרקר372610
מאגר ריצהBioRad1610732
נתרן כלוריפישר סיינטיפיק, פישר כימיקלS271-3
Stericup שחרור מהיר-GP מערכת סינון ואקום סטריליתMilliporeS2GPU05RE500 מ"ל
מסננת תאים סטרילית (70 מ"מ)פישר סיינטיפיק, מותגפישר22-363-548
סוכרוזפישר סיינטיפיק, פישר כימיקלS5-500
SuperSignal מערב FemtoThermo Fisher Scientific34096
צינורות פוליפרופילן בעלי דופן דקהבקמן קולטר326823
מאגר העברהBioRad16110734
חומצה טריכלורואצטיתסיגמא91228-100G
תמיסת Trisbase BioRad1610719
Triton-X100Sigma93443-100mL
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific, Gibco12604-013ללא פנול
אדום Tween-20BioRad#1610781
צנטריפוגה אולטרה צנטריפוגה Optima XPMBeckman CoulterA99842
שפופרת שקולה במיוחד (14x89 מ"מ)בקמן קולטר344059
צינורות שקופים במיוחד (25x89 מ"מ)בקמן קולטר344058
אמבט מים איזוטמפ 220פישר סיינטיפיקFS220
ערכת בדיקת חלבון 1704070

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  2. Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307(2019).
  3. Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
  4. van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270(2019).
  5. Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651(2018).
  6. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  7. Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367(2019).
  8. Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
  9. Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
  10. Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603(2015).
  11. Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705(2019).
  12. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
  13. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335(2019).
  14. Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
  15. Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217(2015).
  16. Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
  17. Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195(2019).
  18. Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
  19. Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
  20. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים