הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

5.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61138

⸱

10 ביוני 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

תקציר

לימוד המבנה והדינמיקה של קינטומטלות וצנטורמרים חשובים בהבנת אי יציבות כרומוזומלית (CIN) והתקדמות הסרטן. כיצד המיקום הכרומוזומים ותפקודו של מרכז הריכוז (כלומר, זהות צנטוררה) נקבעים ומשתתפים בהפרדה מדויקת של כרומוזום היא שאלה יסודית. CENP-A מוצע להיות אינדיקטור non-DNA (מארק אפיגנטי) של זהות מרוכזת, ו-CENP-A אובידילציה נדרש עבור CENP-A התצהיר על צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, הכרחי הכדאיות התא.

כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי אובילילציה ב ליזין שונים נגרמת בגלל תיוג EYFP ב-K124R מוטציה חלבון CENP. ליזין 306 (K306) אוביזלציה ב-EYFP-K124R התגלתה בהצלחה, המתאימה ליזין 56 (K56) ב-CENP-A באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה. אזהרה נדונה בשימוש GFP/EYFP או תיוג של חלבון משקל מולקולרי גבוה ככלי לנתח את הפונקציה של חלבון. המגבלה הטכנית הנוכחית נדונה גם לאיתור להקות אוביקווילבטים, זיהוי אוביקווילציה ספציפיים לאתר, ויזואליזציה של אובידלציה בתאים חיים או תא יחיד מסוים במהלך מחזור התא כולו.

השיטה של ניתוח ספקטרומטר המסה המוצג כאן ניתן להחיל על האנושי CENP-חלבון עם תגים שונים ושאר מרכז החלבונים-הקיטוכורה. ניתן להמליץ על שיטות שונות הכוללות מספר בדיקות/ניתוח שנועדו לחוקרים המעוניינים לזהות תפקידים פונקציונליים של אובילציה.

מבוא

ברוב eukaryotes, מיקרוטובוקלס ציר חייב לצרף לאזור אחד של כל כרומוזום, כינה ריכוז. קינטוכור הוא קומפלקס של חלבונים הנמצאים במרכז הריכוז. לימוד העיתוי של התנועה של מרכז ומעטפת החלבון והמבנה של קינטומאז חשוב להבנת אי-יציבות כרומוזום (CIN) והתקדמות הסרטן. השאלות העיקריות הן כיצד המיקום הכרומוזומים ותפקודו של מרכז הריכוז (כלומר, הזהות הצנטורלית) נקבעים וכיצד הם משתתפים בהפרדה מדויקת של כרומוזום. ברוב המינים, הנוכחות של נוקלאוטיס מיוחד המכיל חלבון דומה histone הנקרא מגדיר את הזהות צנטרומר. לכן, מוצע כי CENP-A הוא מחוון שאינו DNA (סימן אפיגנטי) של הזהות צנטרומר. חשוב להבהיר את המנגנון של האופן שבו CENP-A מגדיר את הזהות הצנטרומר בבני אדם.

זיהוי של צומת הולידיי-היומי חלבון (hjurp) הוא המלווה cenp-a-מיוחד שעליו הפיקדונות cenp-a ב מרכז הריכוז של היום1,2,3. אנו דיווחו בעבר כי CUL4A-RBX1-COPS8 E3 לליגאז נדרש עבור cenp-A אובילציה על ליזין 124 (K124) ו צנטוררה לוקליזציה4. כמו כן, התוצאות שלנו הראו כי הגיוס צנטרומר של החדש מסונתז CENP-A דורש מראש הקיים אוביp-A5. לפיכך, מודל נמסר רומז כי CENP-A אובילציה עוברת בירושה דרך דימריזציה בין חטיבות התאים.

בניגוד לממצאים שלנו ולאלה של יו ואח ', התוצאות השליליות בנוגע ל-CENP-A והלוקליזציה הצנטגוניות שלה פורסמו לאחרונה6. המאמר טען כי CENP-A שינויים על ליזין 124 (K124) הם לוותר על הקמתה, תחזוקה, ותפקוד לטווח ארוך של מרכז האדם, מבוסס על התוצאות השליליות שלהם מראה כי מוטציה של K124R לא להשפיע על CENP-A צנטורייר לוקליזציה לא תאים6. עם זאת, יש מספיק מקום לדיון בתוצאות ובמסקנות שלהם, וכבר תיארנו איזו בעיה יכולה להיות בפרסום הקודם שלהם7. יש לשלם שימו לב כי הם התמזגו חלבונים עם CENP-A, שיש להם הרבה משקולות מולקולריות יותר מאשר בגודל של האנדוגניים CENP-A: למשל, הם התמזגו ~ 30 kDa חלבון פלורסנט משופרת (EYFP) כדי ~ 16 kDa CENP-A וניתח EYFP-CENP-K124R היתוך חלבון במערכת RPE-1 CENP-A-/F מערכת. K124 אוביקוויב לא צפוי לאגד ישירות HJURP מבוסס על תחזיות מבנית4, עם זאת, תוספת של מונו-אוביקוויב הוא ניבא יש השפעה על היווצרות חלבון של Cenp-A. החלבון של CENP-A קונפורמציה יכול להיות שונה על ידי נוכחות של חלבון פיוז'ן גדול, ושינוי זה התאמות עשוי להסוות את השינויים מבניים שנגרמו על ידי אובדן אוביפורמציה. אנו מציעים כי המיזוג של חלבון בגודל גדול גורם אוביקווילציה על ליזין אחר מאשר K124 ב-EYFP-CENP-A K124R מוטציה ואת זה אוביקווילציה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R המוטציה פנוטיפים. ראיות כי אובילציה מתרחשת על ליזין שונים ב-CENP-A K124R חלבון מוטציה עם חלבון תג גדול (EYFP) דווחה בפרסום הקודם שלנו8. נמצא כי התיוג EYFP גורמת אוביקווינציה של אתר ליזין אחר של EYFP-CENP-A K124R וכי EYFP-CENP-K124R מוטציה נקשר HJURP. כתוצאה מכך, אובילציה זה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R יחיד מוטציה פנוטיפ, ושניהם EYFP-CENP-מוטציות K124R הראו צנטרומר לוקליזציה (השתמשנו והשוו pBabe-EYFP-CENP-A WT ו K124R מוטציה, יחד עם בקרת pBabe-EYFP.). התוצאות הראו כי דגל-מתויג או לא מתויגים CENP-A K124R מוטציות קטלניות אבל ניתן להציל על ידי פיוז ' ן monoubi, מציע כי CENP-A אובילציה היא הכרחית לכדאיות התא.

בשנים האחרונות, מחקרים רבים פיתחו בחני שונים לזהות שינויים פוסטטרנסלוניים (לפטין) של cenp-חלבון ואחרים מרכז-החלבונים קיטומודים, הן בvivo והן במבחנה9,10,11. מקביל לפטין של חלבונים היסטון, כי הם מנגנון מרכזי המסדיר את הפונקציה של כרומטין, לפטין של רכיבים מרוכזת של כרוממיה מעורבים גם במנגנון חיוני כדי לווסת את המבנה הכולל ואת התפקוד של צנטרומרים. רוב האתרים של cenp-a ptm הם ספציפיים ל-cenp-a המכיל נוקלאוטיזומים, למרות כמה מהם נשמרים ב היסטון H3, מציע כי שינוי של שאריות אלה תורמים לפונקציה הספציפית צנטרומר. בשנת הבית, מתילציה, מתיונין, ואוביזלציה דווחו בעבר9, מציע כי cenp-A נתון למגוון מגוון של מערכי הקומבינטורית ומערכים שלהם על הטרמינוס האמינית והתחום הקיפול C-טרמינוס. חשיבותו של CENP-A שינויים בפונקציות מרובות נחשף על ידי קבוצות רבות כולל שלנו. פונקציות אלה כרוכות בתצהיר של CENP-A בריכוז, יציבות חלבונים, וגיוס של CCAN (הרשת המשויכת למרכז)9. עם זאת, מחקרים מוגבלים וממצאים של CENP-A השני מראש היכן ההשוואות נעשים עם אחד האבנים קאנוני כי ישירות או עקיף להסדיר את תפקידם. דוחות טכניים התמקדות במתודולוגיה כדי לזהות אלה CENP-A לפטין מוגבלים גם.

בגלל CENP-A אוביקווילציה נדרש עבור CENP-A התצהיר על צנטרומר12, ירש דרך dimerization בין חלוקת התא5, והכרחית לכדאיות התאים8, השיטה לזהות cenp-A אובילציה יהיה חיוני בעתיד כדי ללמוד את הפעילות הפונקציונלית, מיצוב, ומבנה של צנטרומר. לכן, כאן אנו מתארים בניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי התיוג EYFP שגורם אוביקווילציה על ליזין שונים ב-CENP-A K124R מוטציה חלבון8. פרוטוקולים של בקרת שליטה אחרים וניתוחים (ניתוח אימונוoforסנס, המושבה התרחבות הגידול, ו בvivo אוביקווילציה) מוצגים גם כדי לדון את התוצאה של ניתוח המסה הגדולה ספקטרומטריה כראוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים ורטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנים

הערה: EYFP-CENP-A מתבטא pBabe-EYFP-CENP-A ברמת חלבון דומה כדי אנדוסוגני CENP-A. סך הכל הסלולר cenp-חלבון מוחלף זה eyfp-cenp-a לאחר שיבוש של cenp-a-/f אלל על ידי recombinase כמו ב rpe-1 cenp-a-/-תאים6.

  1. הכנת הסופרנטנט המכיל רטרווירוס באמצעות תאי אריזה 293T.
    1. יום 0: התפשטות 293T בתאי אריזה על צלחת התרבות 6-היטב (1.0 x 106 תאים/טוב). תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. מודיית את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 24 h.
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
    2. יום 1: הכנת תגובת החצייה סביב 23 שעות לאחר התפשטות (24 שעות הנקודה היא 0 h נקודת ההעברה). ביטוי transfect בפלסאמצע של כל pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), ו pBabe-EYFP-CENP-K124R (B3164) (ראה טבלה 1).
    3. בחרו שילוב אחד של מארזים המסייעים/אריזות המפורטים בטבלה 2 והוסיפו אותם לצינורות המכילים את אחד הפלמידים המפורטים לעיל. יש בעיקר אלה 3 שילובים עבור המסייע/אריזות פלמידים (שולחן 2). כל שילוב עבד בניסויים אלה והראה יעילות מעבר דומה.
    4. להכין 50 μL של בינוני סרום מופחת ו לערבב 2.0 μg של כל pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), ו pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (ראה טבלה 1) הוספת שילוב אחד של המסייע/אריזות מארזים המפורטים בטבלה 2 מודקון תערובת זו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. התערובת הזאת היא פתרון A.
    5. הכינו עוד 50 μL של בינוני סרום מופחת ו לערבב 1.5 μL של החצייה ריאגנטים אני ו II, בהתאמה (טבלה של חומרים). מודקון תערובת זו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. התערובת הזאת היא פתרון ב.
      הערה: באופן אופציונלי, להוסיף רק 6.0 μL של החצייה מגיב השלישי (פוליאתילן [הפיי]; 1.0 mg/mL) בפתרון B או להוסיף 6.0 μL של החצייה הכימית השלישי בנוסף לחומרים ריאגנטים I ו-II בפתרון B (שולחן חומרי).
    6. פתרונות מערבבים A ו-B ביחד, ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
    7. לאחר שטיפת תאים תרבותיים פעם אחת עם PBS, להוסיף את התערובת של פתרונות A ו-B (כלומר, מורכבות DNA-ליפיד) ישירות לכל טוב של צלחת התרבות 6-היטב כי יש 500 μL מופחת סרום בינוני. הריכוז הסופי של הפלסמיד הוא 3.3 μg/mL.
    8. לאחר הדגירה של התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 4.5 h, לשנות את המדיום כדי הגלוקוז גבוהה dmem עם 10% fbs ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. שים 2 מ ל/טוב של תרבות בינונית לאחר שינוי בינוני בצלחת התרבות 6-היטב.
    9. תרבות התאים בשעה 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 48 h לאחר הזיהום. לבצע זיהום רטרווירוס ביום 3 באמצעות supernatant המכיל רטרווירוס.
  2. הידבקות רטרווירוס של התאים היעד של CENP-A-/F rpe-1.
    1. יום 2: יום לפני זיהום, להפיץ את CENP-A-/F rpe-1 תאים היעד כדי transfect ב 6-טוב התרבות היטב (2.25x 10 תאים /טוב). התאים התרבותיים ב-Dמאמ: F12 בינונית (שולחן חומרים) עם 10% fbs ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: כפולת תאים למושבת המושבה, מאימונוצילונציה וניתוח כתמי אבן מערביים כשליטה. לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
    2. יום 3 (זיהום היום של הווירוס): ב 48 h לאחר העברת בתאי אריזה 293t, לאסוף את supernatant המכיל וירוס ומסנן באמצעות 0.45 יקרומטר מסנן (לא להשתמש במסנן 0.2 יקרומטר אשר להטות את המעטפה וירוס). מומלץ להשתמש במסננים polyethersulfone (PES).
    3. להדביק CENP-A-/f -1 תאים עם הווירוס. עבור אחד טוב של לוחית 6-היטב התרבות, להוסיף 1 mL מדיה טרייה, 1 mL וירוס supernatant ו polybrene לריכוז הסופי של 8 μg/mL. מודטה CENP-A-/F rpe-1 תאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 4 ימים עד יום 7 לאחר הזיהום.
      הערה: תקופת הדגירה של הגדילה של CENP-A-/F rpe-1 צריכה להיקבע באמצעות ניתוחים לקבלת תוצאות אופטימליות.

2. ניתוח של התאים המכילים pBabe-EYFP-CENP-A

  1. יום 7:4 ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנה, להסיר את מדיום התרבות על ידי שאיפה. לשטוף את התאים פעם אחת עם TBS (25 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5; 125 מ"מ הנאל). החל TBS על הצד של בארות התרבות כדי למנוע הפרעה פני השטח של תאים.
    הערה: נקודת הזמן המיטבית לקיבוע התא חייבת להיקבע באמצעות המידע האמפירי. האותות של immunofluorescence הן EYFP-CENP-A WT ו K124R מוצגים במרכז לפחות 4 ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-בנייה גם ללא זיהום היצורים (נתונים לא מוצגים, איור 1C-E עבור הנתונים עם הידבקות ביצורים).
  2. בצע קיבוע תא מתנול ו immunofluorescence כמתואר בעבר13.
  3. כמו נוגדנים העיקרי להשתמש בנוגדן אנטי GFP (1:1000 דילול) ו נוגדן אנטי-CENP-B (יחס דילול של 1:200) עבור סמן מיקום צנטרומר ב-TBS המכיל 4% סרום עז (ראה טבלת חומרים עבור נוגדנים בשימוש).
  4. הסרת מדיום הרכבה עודפת עם מגבת נייר לאטום את קצות שמיכות עם לק ציפורניים בשלב האחרון.
  5. עיין בשיטה שתוארה בעבר13 עבור התבוננות בתמונה immunofluorescence רכישה, כימות וניתוח של האותות הנותרים של EYFP-Cenp-A ב צנטרומר.
  6. בצע רכישת תמונה, עיבוד כולל פירוק, כימות וניתוח באמצעות תוכנות A או תוכנות B1 ו-B2 (ראה טבלת חומרים). באופן אופציונלי להשתמש תוכנות C1-C3 (ראה טבלת חומרים) עבור מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד סריקה.
    הערה: ראה 2.6.1 בקבצי קידוד משלימים עבור כל הפקודות המשמשות בתוכנה A. ראה 2.6.2 בקבצי קידוד משלים עבור כל הפקודות המשמשות תוכנות B1 ו-B2.

3. המושבה מוצלח בחני אומר באמצעות pbabe-eyfp-cenp-לאחר דלקת וירוס בסגנון רטרו

הערה: הסיבה לביצוע מעשה זה היא להשוות את הכדאיות התאית בין eyfp-cenp-a WT ו K124R מוטציה לאחר השיבוש של cenp-a-/f אלל על ידי המין recombinase (לאחר החלפת הכולל של הסלולר cenp-חלבון).

  1. רטרו וירוס-העברה של pBabe-EYFP-מבנים.
    1. בצע העברה רטרווירוס של CENP-A-/F rpe-1 תאים כפי שמתואר בסעיף 1. בתאי תרבות ב-DMEM: בינונית F12 עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין עבור 72 h לאחר זיהום וירוס.
    2. שלושה ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנים (ביום 6), להוסיף בלפסיפידין (10 μg/mL) בבארות המכילות תאים מזוהמים לשמש עבור המושבה מעבר הצמיחה וניסויים בקרה. התאים מגודלים לפחות 14 יום לאחר זיהום וירוס בנוכחות של בלטות S. לשנות את המדיום המכיל בלטות כל 5 ימים.
      הערה: אם התאים מגיעים למפגש של 80% לפני הזריעה של שיטת המושבה (3.2.7. ו-3.2.8), העבר את התאים ב 1:2 ו-1:5 באמצעות טריסיזציה וציפוי בצלחת של 6 מיטב התרבות.
    3. לאסוף תאים עבור הכתם המערבי ביום 7 כדי לאשר את ביטוי החלבון של pBabe-EYFP-CENP-בנייה ללא זיהום היצורים. בצע ניתוח כתמי אבן מערבי כמתואר בסעיף 4. התוצאות מוצגות באיור 1B (נתיבים 1-4).
    4. עבור שיטת מושבה מחוץ לגידול עם זיהום וירוס היצור, לשמור על התאים גדלים 14 ימים לאחר זיהום וירוס בנוכחות של בלטות S (כלומר, לגדל תאים בתוך בלטות S המכיל בינוני עד יום 17 עבור התוצאות המוצגות כאן).
  2. הדלקת וירוס בסגנון רטרו של pBabe-puro.
    הערה: יום 0 בשלב 3.2.1 מקביל ליום 13 בסעיף 3.1.
    1. היום 0 עד יום 3: לבצע העברה רטרווירוס של CENP-A-/F rpe-1 תאים באמצעות pbabe-Puro (B3027) כמו ביטוי פלפמיד (ראה סעיף 1 לפרטים). הקפידו להוסיף בינונית תרבותית (10 μg/mL).
    2. יום 4: טריזיסיזציה לתאים כדי להתנתק מלוחית הרישוי. צלחת 500 או 5,000 תאים בטריליטה בלוח התרבות 6-היטב. בתאי תרבות ב-Dמאמ: F12 בינונית עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    3. יום 5: הוספת בלטות S (10 μg/mL) למדיום התרבותי. עבור 5,000 או 500 תאים, לבחור תאים עם בלטות S (10 μg/ml) 3-24 ימים (עד יום 14 ב [3.2.7]) או 3-28 ימים (עד יום 18 ב [3.2.8]) לאחר זיהום וירוס של בנייה (pBabe-EYFP-CENP-מבנים).
      הערה: בתוך שיטת ההתפשטות הזאת, השילוב של היצור החדש של pBabe-puro מתווסף יחד עם ההתפתחות של pBabe-EYFP-CENP-A. ההעברה של pBabe-EYFP-CENP-A מבוצעת ב 3.1. הזיהום של היצור של pBabe-פורו מבוצע ב3.2.1.
    4. יום 10 (7 ימים לאחר זיהום וירוס בסגנון רטרו): לאסוף תאים עבור ניתוח בלוק המערבי כדי לאשר את המחסור בחלבון של שאנדוגני CENP-לאחר הידבקות וירוס של הרטרו ו/או ביטוי החלבון של pBabe-EYFP-CENP-מבנים באותו יום 10.
    5. בצע בלוק מערבי כמתואר בסעיף 4 באותו יום 10. התוצאות מוצגות באיור 1B (נתיבים 5-7).
    6. בצע ניתוח immunofluorescence (סעיף 2 לעיל) כדי לאשר כי הן EYFP-CENP-A WT ו K124R מקומי לריכוז 7 ימים לאחר הפעלת האנדוגניים הנותרים CENP-A allele. התוצאות מוצגות באיור 1ג-1e.
    7. יום 14: לבצע את המושבה מוצלח שיטת עם הצלחת הנזרע עם 5,000 תאים. תקן תאים עבור 10 דקות מתנול והכתם עבור 10 דקות בתמיסת קריסטל סגול (2.3% קריסטל סגול, 0.1% אמוניום oxalate, 20% אתנול (ראה איור 2B). לספור את מספר המושבות באמצעות תוכנת OpenCFU (ראה איור 2C).
    8. יום 18: השימוש לוחית הזרע עם 500 תאים. תאים לתקן ולהכתים כמתואר בשלב 3.2.7 (ראה איור 2B). לספור את מספר המושבות (ראה איור 2 ג).

4. ניתוח כתמי מערביות באמצעות pBabe-EYFP-CENP-A

הערה: עיין בשיטה שתוארה בעבר13 עבור ניתוח כתמי אבן מערבית באמצעות נוגדנים המצוינים באיור 1B ואיור 2a וטבלת חומרים עבור eyfp-cenp-חלבונים.

  1. לבודד חלבונים על ידי lysing את התאים גדל עם זיהום וירוס שונים. לאחר מכן, השתמש 20 μg של חלבון בבאר אחת של SDS דף ג'ל. להעביר את החלבונים לקרום PVDF כמתואר בעבר13.
  2. לשטוף את הממברנה 3x לאחר incubations עם נוגדנים משני הראשי. לזהות ולנתח את להקות החלבון על הקרום עם מערכת הדמיה אינפרא אדום ו/או המיגראואניוליבורגר לזיהוי חיסוני. תוצאות אלה מוצגות באיור 1B ובאיור 2a.
    1. למערכת הדמיה אינפרא-אדום כדי לאתר ולנתח את להקות החלבון, ראה שלב 4.2.1 בקבצי קידוד משלימים.
    2. השתמש במקלינסנציה כדי לזהות ולנתח את להקות החלבון, ראה שלב 4.2.2 בקבצי קידוד משלימים. עבור מערכת זו, השתמש במצע כימי (טבלת חומרים) הרגישה במיוחד (ecl).
    3. באופן אופציונלי, השתמש בכתם המערבי להתפשט מאגר להסיר נוגדנים מראש מחדש מקרום PVDF למחוק אותו עם נוגדנים שונים לקראת הבא של ניתוח מערבי. מדעית לקבוע את זמן הדגירה אופטימיזציה הטמפרטורה להשתמש.

5. התרבות התא, העברה, ו ב vivo אוביקטלציה באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A

הערה: רמת החלבון של EYFP-CENP-A ביטא pQCXIP-וקטור הוא ~ 10x גבוה יותר מאשר האנדוגניים ברמת החלבון. השימוש וקטור זה מקל immunoprecipitation של כמות גבוהה יותר של EYFP-CENP-חלבונים, התבוננות של להקות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A, וזיהוי של אוביקווילציה של EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה.

  1. הvivo באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. הזרע 36.2 x 105 Cenp-A-/f rpe-1 תאים בצלחת 10 ס מ רקמת הרקמה. תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית קובעת את צפיפות התא המשמשת בזריעה. הכינו לפחות 2 מנות לדוגמה אחת immunoprecipitation (IP) כדי לקבל מינימום של חלבון מוחלט של 1 מ"ג.
    2. דגירה את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 18 h.
    3. , ב -17 לאחר זריעה. הכן את ריאגנטים החצייה
    4. להפוך את הפתרון על ידי ערבוב 6.7 μg פלאבין של כל pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-מK124R (B3256) (שולחן 1) ב 335 μl של בינוני סרום מופחת, ו-מודטה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. הוסף 6.7 μg פלאמיד של pcgn-האוביקוויב (B2806) לכל הדגימות.
      הערה: כל הווקטורים מפורטים בטבלה 1.
    5. להפוך את הפתרון B על ידי ערבוב 10.1 μL של החוצה ריאגנטים האני ו II, בהתאמה 335 μL סרום מופחת בינוני, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
      הערה: צעד אופציונלי הוא להוסיף רק 40.2 μL החצייה מגיב השלישי (פוליאתילן [הפיי]; 1.0 mg/mL) בפתרון B או להוסיף 40.2 μL החצייה מגיב השלישי בנוסף ריאגנטים החצייה אני ו II בפתרון B (טבלת חומרים).
    6. פתרונות מערבבים A ו-B ביחד, ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
    7. לאחר שטיפת תאים תרבותיים פעם אחת עם PBS, להוסיף את התערובת של פתרונות A ו-B (כלומר, מורכבות DNA-ליפיד) ישירות לכל אחד בודד 10 ס מ רקמת העור התבשיל כי יש 3.35 mL μL מופחת סרום בינוני.
      הערה: הריכוז הסופי הוא 1.67 μg/mL של פלסמיד.
    8. מודטה את התאים ב37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עבור 4.5 h. לאחר 4.5 h, לשנות את המדיום כדי הגלוקוז גבוהה DMEM עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    9. תרבות התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 48 h לאחר הזיהום. לאסוף תאים עבור הכנה lysates תא.
  2. הכנת חלבון חרוזים הקשורים בנוגדן אנטי-GFP.
    1. קח 25 μL (50% v/v) של חלבון חרוזים לתגובה אחת של immunoprecipitation (IP). לשטוף עם מאגר A1 (הטבלה של חומרים) לפחות 3x כדי להסיר את אטוח, ולעשות 50% פתרון עם מאגר A1 (20 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4; 50 MM הנאל; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% הסרת מעכב פרוטאז בחינם).
    2. הוסף 2.0 μL של נוגדן אנטי-GFP (Anti 76: נוגדן תוצרת בית) לחרוזים שהוכנו לעיל ולהוסיף נפח 10x של מאגר A1 השוואת עם נפח חרוזים נטו.
    3. בצע סיבוב מקצה לקצה ב-4 ° צלזיוס עבור 4-18 h. אורך הזמן האופטימלי לסיבוב מקצה לקצה חייב להיקבע בהתאם ליעילות הimmunoprecipitation.
    4. צנטריפוגה את החרוזים ב 100 x g עבור 1 דקות ולהסיר את supernatant לא מאוגד. הוסף מאגר A1 כדי לבצע מחדש 50% (v/v) פתרון של החרוזים. השתמש 25 μL (50% v/v) של פתרון זה עבור תגובה אחת של IP.
  3. Immunoprecipitation (IP) באמצעות חלבון חרוזים מספרד הקשורים בנוגדן אנטי-GFP.
    1. התאים lyse שהתקבלו בשלב 5.1.9 במאגר A1 על-ידי sonication ותהליך הקפאת הפשרה.
    2. מדידת ריכוזי חלבון ולנרמל כמויות חלבון בין דגימות IP שונות. הסר 5% מהדוגמה מכל צינור כדי לפעול כ-5% כדוגמת קלט ב-SDS-PAGE.
      הערה: מדגם הקלט 5% יכול להיות קפוא בחנקן נוזלי ומצויד ב-80 ° c, אם הוא לא טעון תוך יום.
    3. מערבבים את שאר 95% ליפוסט עם 25 μL (50% v/v) של חלבון חרוזים הקשורים לנוגדן אנטי-GFP שהוכן בשלב 5.2. בצע סיבוב מקצה לקצה ב-4 ° צלזיוס עבור 4-18 h.
      הערה: אורך הזמן האופטימלי לסיבוב מקצה לקצה חייב להיקבע כאמפירי.
    4. חלבון צנטריפוגה חרוזים עם חלבון מאוגד (כלומר, immunoprecipitates) עם 100 x g עבור 1 דקות, ולהסיר את supernatant. לשטוף את immunoprecipitates עם מאגר A1 על-ידי תפרידו ב 100 x g עבור 1 דקות. לבצע שלב זה 4x.
    5. מערבבים את הקלט 5% ואת שאר 95% הimmunoprecipitates עם מאגר טעינה של 2x ו-4x SDS-עמוד14, בהתאמה. מרתיחים שתי דגימות אלה עבור 5 דקות ולאחר מכן לטעון אותם על 10.0% הרפתקאות SDS-פוליאקרילאמיד ג'ל עבור אלקטרופורזה בנתיבים שונים. השתמש ביותר גדול SDS-דף ג'ל (למשל, 17 ס"מ x 15 ס מ) עבור אלקטרופורזה. אם מדובר בדגימות של ג'ל קטן יותר, ייתכן שלא ניתן יהיה להבחין בלהקות אוביקטלציה ברורות/חדות.
    6. בצע ניתוח כתמי מערבי כמתואר בסעיף 4 באמצעות הנוגדנים המצוינים בדוח הקודם8. התוצאה מופיעה באיור 2A.
    7. השתמש בכתם המערבי להתפשט מאגר להסיר את הנוגדנים טרום הדגירה של קרום PVDF למחוק אותו עם נוגדנים שונים לסיבוב הבא של ניתוח כתמי מערביות.

6. ספקטרומטר מסה כדי לזהות את האתר אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה

  1. העברה לניתוח ספקטרומטר המסה באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. זרעים CENP-A-/F rpe-1 תאים בצלחת 10 ס מ רקמת הרקמה. בדוק כי צפיפות התא היא 36.2 x 105 תאים לכל מנה. תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. הכינו לפחות 20 מנות עבור אחד immunoprecipitation (IP) לדוגמה, כדי לקבל לפחות 10 מ"ג חלבון כולל (לראות 5.3).
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
    2. מודחת את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 18 h. הכינו את המזרעות העירוי ~ 23 שעות לאחר התפשטות (24 שעות הנקודה היא 0 h נקודת ההעברה).
    3. ב -17 לאחר זריעה, הכינו את התאים הללו לטיפול בתאי העור (4.1.3). תאים מזוהמים יש pCGN-הא-אוביקוויב (B2806) ו-pQCXIP-EYFP-מK124R (B3256).
    4. מודיית את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 48 h לאחר החצייה. לאסוף תאים עבור ליסביטים תא.
    5. Lyse תאים במאגר A1 ולבצע immunoprecipitation as (5.2) ו (5.3). הפעל את שני immunoprecipitation lysates כדלקמן (6.1.6) ו (6.1.7).
      הערה: ב (6.1.6), הפעל את המדגם בתקן טריס-גליצין רגיל. In (6.1.7), להפעיל את המדגם של הזמין מסחרית 4%-12% החלבון Bis-Tris. ראה גם דיון.
    6. שמור דוגמה אחת עבור 10% של סך immunoprecipitants כדי לאשר EYFP-CENP-אובילציה ו לקבוע בדיוק את המיקום של EYFP מחולק אוביקוויל-CENP כמתואר בסעיף 5. הפעל דוגמה זו ב-ג'לים סטנדרטיים של טריס-גליצין. SDS-העמודים והכתם המערבי בוצעו כמו (5.3).
    7. שמור דוגמה נוספת עבור 90% של סך immunoprecipitants עבור ניתוח ספקטרומטר המסה. הפעל מדגם זה בתוך שתי בארות של זמין מסחרית 4%-12% Bis-Tris חלבונים. בצע כתמים כחולים coomassie באמצעות הפתרון הכחול coomassie. בלו וחותכים את אזור הג של 50-70 kDa (מונו-רוב-EYFP-CENP-A K124R אזור). השתמש באזור ג'ל זה לניתוח ספקטרומטר המסה.
  2. ניתוח ספקטרומטר מסה באמצעות העיכול בתוך ג'ל.
    1. חותכים כל פיסת ג'ל של עניין לחתיכות קטנות (1 מ"מ2) ומניחים אותו לתוך 0.5 mL של חלבון מחייב נמוך צינורות.
    2. לשטוף עם 100 μL 50% (v/v) acetonitrile ב 25 מ"מ NH4hco3, מערבולת 10-15 min, ספין למטה, להיפטר supernatant, לחזור על 3x.
    3. לרכז את המדגם באמצעות מרכז ואקום שחקן הספסל עבור 30 דקות לייבש את חתיכות ג'ל.
    4. הוסף 10 μL של 10 ng/μL רצף של כיתה ולתת את חתיכות ג'ל כדי לעבור מחדש עבור 5 דקות.
    5. הוסף 25 מ"מ NH4hco3 פשוט מספיק כדי לכסות את חתיכות ג'ל, לעכל ב 37 ° c לילה.
    6. העבר את הסופרנטנט המיתעכל לתוך שפופרת נקי 0.65 mL. הוסף 50% (v/v) acetonitrile/5% (v/v) החומצה הפורמית (30 μL או מספיק כדי לכסות), מערבולת 10 דקות, ספין להעביר לתוך צינור החילוץ אותו. חזור על 3x.
    7. הוסף 10 μL acetonitrile לחתיכות ג'ל, מערבולת 5 דקות, ו ספין למטה. העבר את הסופרנטאנט לאותה צינורית.
    8. לרכז את הדגימות באמצעות מרכז ואקום הספסל כדי 2 μl, להוסיף 8 μl 3% (v/v) acetonitrile/2% (v/v) החומצה פורמית למדגם, מערבולת עבור 15 דקות, ו ספין למטה ב 16,000 x g עבור 30 דקות. דגימות מוכנות לניתוח ספקטרומטר המסה.
    9. בצע ייבוא נתונים MS עם LC-MS/MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מערכת (טבלת חומרים) ביחד עם כלי ספקטרומטר מסה (טבלת חומרים).
    10. הכנס 8 μL של מדגם מחדש לעמודה כרומטוגרפית נוזלית בשלב הפוך (RPLC).
    11. הפרד את הפפטידים עם 2-80% הדרגתי של הממס B ב 60 דקות. ודא כי מעבר הצבע מורכב אחוז הולך וגובר של B ממס מ 2% עד 22% ב 40 דקות, 22% כדי 35% מומס B ב 12 דקות, ולאחר מכן לטפס על 80% מומס B ב 4 דקות, ולבסוף החזקת 80% הומס b עבור 4 הדקות האחרונות. הגדר את קבוע קצב הזרימה ב-300
      הערה: ממיס A מכיל 0.1% החומצה פורמית ו 2% acetonitrile, ממס B מכיל 0.1% החומצה פורמית ו 98% acetonitrile. כל הריכוזים מוצגים כאמצעי אחסון/אמצעי אחסון.
    12. איסוף נתונים מבוססי-ספקטרומטר מסה באמצעות מצב רכישה תלוי-נתונים. בקצרה, לאסוף MS ספקטרום ב 350 – 1500 m/z עבור 250 MS. בחר את למעלה 50 מקדם מקדים אינטנסיבי עם טעינה 2 – 5 עבור פיצול נוסף. לאסוף MS/MS ספקטרום ב 100 – 2000 m/z עבור 100 MS, להוציא יונים מקודמן מחדש בחירה עבור 15 s.
    13. לחיפוש במסד הנתונים, פתח את התוכנה המסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח נתונים ספקטרומוטוריקה מאסיבית בשולחן העבודה.
    14. כדי לבצע חיפוש חדש, לחץ על כפתור "LC" בתפריט העליון. לאחר מכן לחץ על "Add" כפתור כדי להעלות את המקורי MS נתונים raw קבצים.
    15. בחר "מזהה חלבון אנושי"בשיטה "פרגון" כשיטת חיפוש במסד הנתונים. חפש את קבצי MS המקורי של נתונים גולמיים נגד מסד הנתונים של יוניפרוט הומו-ספיינס (המכיל 160,566 רצפים, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. הגדר את הפרמטרים לחיפוש כדלקמן: בחירת טריפסין כאנזים העיכול, מאפשרים עד 3 ביקנים חסרים, 4 שינויים ו-2-5 חיובים לכל פפטיד. הגדר שגיאת מסה עד 20 עמודים לדקה עבור החיפוש הראשון ו-0.02 Da עבור יונים מפוצלים. ציין ספי שיעור גילוי כוזב (רוזוולט) עבור אתרי חלבונים, פפטיד ושינויים שפחות מ-1%. הגדר את כל הפרמטרים האחרים בתוכנה לערכי ברירת מחדל (ראה איור 3 לניתוח ספקטרומטר המסה).
    17. לחץ עלכפתור "שמירה בשם" בזכות התפריט העליון, בחר תיקיה לאחסון תוצאות החיפוש, הזן את שם החיפוש ולחץ על כפתור "שמור".
    18. לחץ על "תהליך" כפתור בצד ימין של התפריט העליון כדי להתחיל את החיפוש. לאחר סיום החיפוש, הנתונים עם שם החיפוש שהוזן יאוחסנו באופן אוטומטי בתיקיה שנבחרה. ניתן לפתוח את הנתונים בקלות על-ידי תוכנה F.
    19. כדי לקבל את ספקטרום MS/MS של כל פפטיד ספציפי, לחץ פעמיים על תוצאות החיפוש כדי לפתוח אותו על ידי תוכנה F. ראשית, לחץ על החלבון ברשימת החלבונים בחלק העליון של התפריט, ולאחר מכן לחץ על פפטיד באמצע התפריט. MS/MS של פפטיד זה מוצג בתחתית התפריט.
    20. כדי לייצא ולשמור של MS/MS ספקטרום, לחיצה ימנית על MS/MS ספקטרום בחלק התחתון של התפריט, בחר להעתיק ולאחר מכן להדביק קובץ מתאים כגון PPT או doc. בפורמט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Eyfp-CENP-מוטציה K124 מראה אוביקווילציה, אינטראקציה עם HJURP, ואין פגמים בלוקליזציה של מרכז התקשורת לא תאים. כאן המערכת דיווחה על ידי fachinetti ואח '. (2017)6 היה re-היווה: ב דיפלואידי אנושי (rpe-1) תאים נושא אחד שיבשו ואחד ' ' מכוסל ' ' cenp-a אלל (cenp-a-/f), eyfp-cenp-a היה ביטא את וקטור pbabe-ey במערכת זו, הביטוי של האנדודוגני cenp-a מ- cenp-a-/f אלל יכול להיות מופרת על ידי היצור recombinase6. בונה גנים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן תיארנו שיטות של ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי התיוג EYFP שגורם אוביקווילציה על ליזין שונים ב-CENP-A K124R מוטציה חלבון8. בתוצאות שלנו, זיהינו בהצלחה אוביקווילציה על ליזין 306 (K306) ב-EYFP-CENP-K124R, המתאים ליזין 56 (K56) ב-CENP-A באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה. ניתוח ספקטרומטר המסה המתואר כאן הוא שיטת חיקוי כפי שאנו מזהים בעבר את ליזין 124 (K124) האתר אוביקווילציה של CENP-A WT-דגל12. לכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על-יד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים לצ-ג'ון לי במרכז לחקר בעלי חיים במודל, באוניברסיטת נאנג'ינג לניתוח ספקטרומטר המסה. אנו מודים ליאנמיני דלאל, טאסואו פאקאגאווה, והחוקרים הנוכחיים במרכז לחקר בעלי חיים במודל, אוניברסיטת נאנג'ינג ומכון המחקר לחקר הסרטן של הילדים למען הדיון המועיל שלהם, הדרכה ניסויית וריאגנטים. אנו מודים לדון ולקליבלנד, דנילה פצ'נטי, יאנמיני דלאל, מין ובאר, גוסטבו ולאונה, ג'ון תומפסון, לורנס ס. קירשנר, אמרוטה אשקאר, בן א. שחור, גלניס א. לוגסדון, קנג'י טאגו, ודון ס. צ'נדלר על המתנות הנדיבות שלהם של ריאגנטים. Y.N. היה נתמך על ידי מחוז ג'יאנגסו ' ' כפול ממדרגה ראשונה ' ' קרן בנייה, ג'יאנגסו מחוז המדע הטבעי קרן (SBK2019021248), מחוז ג'יאנגסו 16th שישה כישרון גדול פסגות 31970665 הקרן (TD-swyy-001), מחוז ג'יאנגסו "מומחה זר 100 כשרונות תוכנית" קרן (SBK2019010048), ו הלאומית למדעי הטבע ה מחקר זה היה נתמך באופן חלקי NCI גרנט R21 CA205659.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד / כלים
0.5 מ"ל חלבון צינורות קשירה נמוכיםEppendorf022431064לניתוח ספקטרומטריית מסה
צלחת תרבית תאים 10 ס"מBIOFIL / JET, סין700224צלחת תרבית רקמה 10 ס"מ (מעבדת Yohei, PN63)
אשכול תרבית תאים 6 בארותFisher / Corning Incorporated07-200-83תרבית 6 בארות צלחת
CentriVapLABCONCO-רכזואקום ספסל לפפטידים יבשים ואקום לניתוח ספקטרומטריית מסה
ChromXP C18CL, 120A, 15 ס"מ x 75 μ mEksigent Technologies805-00120עמודה כרומטוגרפיה נוזלית (RPLC) לניתוח ספקטרומטריית מסה
HCX PL APO 100x עדשת טבילה בשמןLeicaLEICA HCX PL APO 1.40 שמן PHE100X עדשת טבילה בשמן
HCX PL APO 63x עדשת טבילה בשמןLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 שמן PH 3 CS63X עדשת טבילה בשמן
Immobilon-FL PVDF ממברנת העברתEMD MilliporeIPVH00010עבור כתם מערבי
Leica DM IRE2 מיקרוסקופ פלואורסצנטי ממונעLeicaמיקרוסקופ פלואורסצנטי ממונע
Leica EL6000 מקור אור קומפקטיLeicaמקור אור חיצוני לעירור פלורסנט
זכוכית מיקרו כיסוי (22 מ"מ x 22 מ"מ)Surgipath105כיסוי זכוכית (22 מ"מ x 22 מ"מ)
דגם V16-2 מכשיר אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמידApogee Electrophoresis/CORE Life Sciences31071010מכשיר אלקטרופורזה ג'ל I ליישום ג'ל SDS-PAGE גדול יותר
nanoLC.2DEksigentTechnologies-מערכתכרומטוגרפיה נוזלית לניתוח ספקטרומטריית מסה
NuPAGE 4%-12% ג'ל חלבון Bis-TrisThermo FisherNP0335BOXג'לי החלבון Bis-Tris הזמינים מסחרית לניתוח
ספקטרומטריית מסהאולימפוס FLUOVIEW FV3000 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלימיקרוסקופ סריקת לייזר אולימפוס-קונפוקלי (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ הורדות/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 מצלמת CCD DegitalHamamatsuC10600-10Bמצלמת CCD
אתר כריכתעט PAPAD100.1למחסום דוחה מים ברקמת צביעה אימונופלואורסצנטית
כלי תרבות 10 ס"מVWR25382-166צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ
אלקטרופורזה אנכית להפעלת ג'ל (גודל גדול)ג'וני, סיןJY-SCZ6 +מכשיר אלקטרופורזה ג'ל II למריחת ג'ל SDS-PAGE גדול יותר (מעבדת Yohei, PE23)
VWR Micro Slides, חלביתVWR International48312-013מיקרו שקופיות
<חזקות>נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006נוגדן חד שבטי לעכבר
נוגדן נגד CENP-B NovusBiologicalsH00001059-B01Pנוגדן חד שבטי
לעכבר אנטי-GAPDHABCAMab37168נוגדן רב-שבטי ארנב
אנטי-GAPDHInvitrogenPA1987נוגדן
רב-שבטי ארנבנוגדן נגד GFPANTI #76 (נוגדן תוצרת בית)נוגדן רב-שבטי ארנב
נגד HA (3F10)נוגדן Roche11815016001Rat נוגדן חד שבטי
נגד HJURPProteintech Group15283– 1-APRabbit polyclonal
anti-UbiquitinBethyl LaboratoriesA300-317A-1נוגדן רב-שבטי ארנב
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad Bio-Rad500-0006מגיב לבדיקת חלבון מסחרי I למדידת ריכוז החלבון (תואם ל-0.1% SDS)
ברנסון סוניפייר 450Sonicator
Branson Ultrasonics סוניקטור Microtip Step, מוצק, הברגה 9.5 מ"מVWR Scientific Products Inc.33995-325צופר משבש לסוניקציה
סוניקטור ברנסון אולטרסאונד מיקרוטיפ מחודד 6.5 מ"מVWR Scientific Products Inc.33996-185מיקרו-טיפ למאגר סוניקציה
A1--20מ"מ Tris-HCl, pH 7.4; 50 מ"מ NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% דאוקסיכולאט; 0.5% SDS; 1 מ"מ EDTA; ריאגנט מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA
קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA Roche11-873-580-001מגיב מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA למאגר A1
Coomassie כחול מבריק R-250BBI מדעי החייםCAS 6104-59-2תמיסה כחולה של Coomassie לניתוח ספקטרומטריית מסה
תמיסת קריסטל סגול (2.3% סגול קריסטל, 0.1% אמוניום אוקסילט, 20% אתנול)SigmaI-AldrichHT90132-1Lלצביעה של מושבה
DAPISIGMA-SLDRICHD9542לצביעה גרעינית
DMEM: F12 בינוניATCC30-2006DMEM: F12
סרום בקר עוברי בינוני, מוסמך, חום מושבת, ממקור ארה"בLife Technologies/Gibco10082FBS (סרום בקר עוברי)
DMEM עתיר גלוקוז (Dulbecco' s שונה Eagle' s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604גלוקוז גבוה DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies/InvitrogenL3000מגיב טרנספקציה I לטרנספקציה כימית
Lipofectamin 3000, P3000 פתרוןLife Technologies/InvitrogenL3000Transfection Reagent II להעברה כימית
מתנולפישרA412-4קיבוע
אבקת חלב ללא שומן reagant (תחליף מאושר לאבקת חלב ציפורן)Fisher ScientificNC9255871 (הזמנה מחדש מס' 190915; Lot # 90629)חלב דל שומן
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985מדיה מופחתת בסרום
p-פנילאנדיאמיןSIGMA-SLDRICHP6001להרכבת
פניצילין בינוני, סטרפטומיצין; נוזל פישר/ג'יבקו15-140פניצילין-סטרפטומיצין
פולי-L-ליזין תמיסתסיגמא-סלדריךP 8920פולי-L-ליזין, 0.1% משקל/נפח, במים
פוליאתילנימין [PEI]; 1.0 מ"ג/מ"לPolysciences23966– 2מגיב טרנספקציה III לטרנספקציה כימית
חלבון A חרוזי צפרוז CL-4B GEHealthcare/Amersham17-0963-03חרוזי חלבון A ספרוז CL-4B למבחני ubiquitylation in vivo באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A
שחזור מאגר הפשטת כתם מערביתרמו מדעיPI21059מאגר הפשטת כתמים מערביים I
רצף כיתה טריפסיןPromegaV5111לניתוח ספקטרומטריית מסה
SuperSignal West Femto מצע רגישות מקסימליתThermo34095מצע כימילומינסנט משופר רגיש במיוחד (ECL)
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977מים סטריליים בדרגת תרבית רקמה
מאגר הפשטת כתם מערבי II ((50 מ"מ Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 מ"מ DTT; 100 מ"מ 2-מרקפטואתנול)--Western Blot Stripping Buffer II
נוגדנים משניים>חזקיםחזקים
Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgGLife Technologies/InvitrogenA11008נוגדן משני מצומד פלואורופור (נוגדן משני מטוהר זיקה)
Alexa Fluor 594 עז נגד עכבר IgGLife Technologies/InvitrogenA11005נוגדן משני מצומד פלואורופור (נוגדן משני מטוהר זיקה)
Softwares
Acquisition FV31S-SW softwareOlympus-SofwareC1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT softwareOlympus-Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 18Olympus-SofwareC3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellens/
)Image Studio Analysis Software Ver 4.0LI-COR Biosciences-SoftwareD
Molecular Imager Versadoc MP4000 SystemBio-Rad-מצלמת כימילומינסנציה לזיהוי אימונובלוט
מערכת הדמיית אינפרא אדום Odyssey CLxLI-COR Biosciences-מערכתהדמיה אינפרא אדום לזיהוי אימונובלוטים
OpenCFU saftware-לספירת מושבות (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab גרסה 5.5.2. אספקת תוכנת הדמיהמדעית/PerkinElmer-SoftwareA
ProteinPilot תוכנה גרסה 4.5AB SCIEX-SoftwareF לניתוח ספקטרומטריית מסה
כמות אחת תוכנת ניתוח חד-ממדית Bio-Rad-SoftwareE
TripleTOF 5600+ SystemAB SCIEX-מכשירספקטרומטריית
מסהVolocity גרסה 6.3 תוכנה לניתוח תמונות תלת מימד (רכישת Volocity)PerkinElmer-SoftwareB1
Volocity גרסה 6.3 תוכנה לניתוח תמונות תלת מימד (כימות Volocity)PerkinElmer-SoftwareB2
<

מקורות

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זיהוי יוביקוויטילציהפרוטוקול למשקיפות חיסונית (Immunoprecipitation)אנליזה באמצעות LC-MS/MSשיטת חיתוך ג'לעיכול באמצעות טריפסיןגלולות Protein Aנוגדן Anti-GFPזהות הצנטרומרה
ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.