כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות ניצול כמה דגמים נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק וחלבון הנגרמת המושרה נוירורעילות, כדי לפקח ולנתח את בסיס הסלולר והמולקולריים של מחלות ניווניות הקשורים גיל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
התמודדות עם הפתודים ניווניות האנושית וניהול ההשפעה הבין-כלכלי הנרחבת שלהם הוא הופך עדיפות גלובלית. על אף ההשפעות ההרסניות שלהם על איכות החיים האנושית ועל מערכת הבריאות, רוב ההפרעות האנושיות הנוירוניווניות עדיין להישאר חשוכת מרפא ולא ניתנת למניעה. לכן, ההתפתחות של התערבויות טיפוליות הרומן נגד מומים כאלה הופכת דחיפות דחופה. ההתדרדרות המשויכת לגיל של מעגלים עצביים ותפקוד הוא שימור בלתי מזוהה באורגניזמים כמגוון התולעים הנחות של האלמרנים ובני האדם, המציין קווי דמיון במנגנון הסלולר והמולקולרי הבסיסי. ג. אלגיה הוא מודל גנטי מחושל מאוד, המציעה מערכת עצבים מאופיינת היטב, שקיפות גוף ורפרטואר מגוון של טכניקות גנטיות ודימות להערכת פעילות עצבית ובקרת איכות במהלך ההזדקנות. כאן, אנו להציג ולתאר מתודולוגיות ניצול כמה דגמי נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק (g., מעלות -3 (ד) ו -mec-4 (d)) ולצבור חלבון (g., α-syunclein ו-פולי גלוטמט)-רעילות המושרה, כדי לפקח ולנתח את התחתון הסלולר והמולקולריים של התמוטטות עצבים הקשורים לגיל. שילוב של אלה מודלים נוירוניוון בעלי חיים, יחד עם מסכים גנטיים ותרופתי למוות תאים מאפטורים יוביל להבנה חסרת תקדים של פירוק הקשורות לגיל של תפקוד עצבי ויספק תובנות קריטיות עם רלוונטיות רחבה לבריאות האדם ואיכות החיים.
מבוא
במהלך שני העשורים האחרונים שימש כאורגניזם מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של מוות תאי נקרוטי. ג. אלגיה מציעה מערכת עצבים מאופיינת וממופה במיוחד, מבנה גוף שקוף ורפרטואר מגוון של שיטות גנטיות ודימות לניטור הפונקציה vivo סלולרית והישרדות במהלך ההזדקנות. לפיכך, מספר מודלים גנטיים של ניוון עצבי כבר פותחו כדי להעריך את הכדאיות העצבית. בפרט, מתוארים היטב ומשומשים מודלים נמטודות כוללים נמק המושרה ערוץ יון1,2,3 ומוות תא המופעל על ידי צבירת חלבון מוגבר4,5,6
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מוות של תאים נקרוסטיים הנגרמת על ידי ערוצי יון היפראקטיבי
הערה: מוטציות הרווח של הפונקציה במשפחת הגנים של degenerins, כולל mec-4 ו-מעלות 3 בין היתר, תוצאות הדור של ערוצי יון היפראקטיבי המפעיל מוות של תאים נקרוטיים של שישה הנוירונים לקולטן מגע הנדרש עבור מכונאי תולעים3. נמק שנגרם על ידי הגירוי החריג של הדגנרנס מציג מספר דומה של מכניסטים ומורפולוגיים לעירור ההתרגשות ביונקים. תחזוקת מטבוליזם האנרגיה והומאוסטזיס סידן יש תפקיד מכריע על הישרדות עצבית במהלך נמק11. הזנים הבאים ניתן להשתמש כדי לפקח על מוות תאים נקרוטיק המופעל על ידי ערוצי יון היפראקטיבי, mec-4 (u231) X ו-מעל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מוות בתאי נמק שנגרם על ידי תעלות היפראקטיביות
באמצעות ההליכים המוצגים כאן, mec-4 (u231) ו-מעלות 3u662) עוברי מוטציה היו מודבטים עבור 25 דקות ב 34 ° צ' או שמרו בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c. במהלך הבקיעה נקבע מספר גופות התאים העצביים בL1 הזחל של שתי הקבוצות. נמק מוות התאים הוא פחתה בתוך נמטודות שבקע מן הזעזועים חום ממוזג ביצים (איור 1א-1b).
ניוון מצטבר של חלבון
ביטוי הטרנסגניים מוגזם (A) האד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות עבור צמיחה, סנכרון ובדיקה מיקרוסקופית של כמה מודלים רב-תכליתי מסוג C. אלגיה חקירת ניוון מוחי התלוי בגיל. במיוחד, אנו להעריך ולנתח את התחתון הסלולר והמולקולריים של התמוטטות עצבים הקשורים לגיל באמצעות היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק המושרה חלבון מושרה נוירורעילות1,2,3,4,5,7
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים לצ מ. ולקונאקיס K. להקלטת וידאו ועריכה. K.P. ממומנת על ידי מענק הקרן היוונית למחקר וחדשנות (HFRI) ואת המזכירות הכללית למחקר וטכנולוגיה (GSRT). N.T. ממומנת על ידי מענקים ממועצת המחקר האירופית (ERC-GA695190-המן), תוכניות המסגרת של הנציבות האירופית ומשרד החינוך היווני.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אגר | סיגמא-אולדריץ' | 5040 | |
| אגרוז | ביוזים | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC) | ||
| סידן כלורי מיובש (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| כולסטרול | SERVA אלקטרופורזה | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V או deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | שמור על בעלי חיים ב-20 מעלות; | |
| מיקרוסקופ C DIC (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| סטריאומיקרוסקופ מנתח | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 זן | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri צלחות (60 מ"מ x 15 מ"מ) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| פיג'י | https://fiji.sc | ||
| KH<תת>2PO<תת>4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| מגנזיום גופרתי (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X או mec-4(d) | הגנטיקה של Caenorhabditis (CGC) | שמור על בעלי חיים ב-20 מעלות; C | |
| שקופיות מיקרוסקופ (75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| זכוכית כיסוי מיקרוסקופ (18 מ"מ x 18 מ"מ) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel חבילת תוכנה | Microsoft Corporation, רדמונד, ארה"ב | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| אגר מדיום גידול נמטודות (NGM) | |||
| תמיסת מלאי ניסטטין | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| פפטון | BD, Bacto | 211677 | |
| מאגר | |||
| נתרן כלורי (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| ציוד סטנדרטי להכנת לוחות אגר ( חיטוי, צלחות פטרי וכו') | |||
| ציוד סטנדרטי לתחזוקת תולעים (פיק חוטי פלטינה, אינקובטורים וכו') | |||
| תוכנת ניתוח סטטיסטי | GraphPad Software Inc., סן דייגו, ארה"ב | חבילת תוכנה GraphPad Prism | |
| Streptomycin | S6501 | ||
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | על פי בקשה: ג. קולדוול (אוניברסיטת אלבמה, טוסקלוסה AL) |
מקורות
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
