הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

5.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61169

⸱

15 באוגוסט 2020

 , 
1Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, Greece, 2Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, Heraklion, 70013, Crete, Greece

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות ניצול כמה דגמים נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק וחלבון הנגרמת המושרה נוירורעילות, כדי לפקח ולנתח את בסיס הסלולר והמולקולריים של מחלות ניווניות הקשורים גיל.

תקציר

התמודדות עם הפתודים ניווניות האנושית וניהול ההשפעה הבין-כלכלי הנרחבת שלהם הוא הופך עדיפות גלובלית. על אף ההשפעות ההרסניות שלהם על איכות החיים האנושית ועל מערכת הבריאות, רוב ההפרעות האנושיות הנוירוניווניות עדיין להישאר חשוכת מרפא ולא ניתנת למניעה. לכן, ההתפתחות של התערבויות טיפוליות הרומן נגד מומים כאלה הופכת דחיפות דחופה. ההתדרדרות המשויכת לגיל של מעגלים עצביים ותפקוד הוא שימור בלתי מזוהה באורגניזמים כמגוון התולעים הנחות של האלמרנים ובני האדם, המציין קווי דמיון במנגנון הסלולר והמולקולרי הבסיסי. ג. אלגיה הוא מודל גנטי מחושל מאוד, המציעה מערכת עצבים מאופיינת היטב, שקיפות גוף ורפרטואר מגוון של טכניקות גנטיות ודימות להערכת פעילות עצבית ובקרת איכות במהלך ההזדקנות. כאן, אנו להציג ולתאר מתודולוגיות ניצול כמה דגמי נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק (g., מעלות -3 (ד) ו -mec-4 (d)) ולצבור חלבון (g., α-syunclein ו-פולי גלוטמט)-רעילות המושרה, כדי לפקח ולנתח את התחתון הסלולר והמולקולריים של התמוטטות עצבים הקשורים לגיל. שילוב של אלה מודלים נוירוניוון בעלי חיים, יחד עם מסכים גנטיים ותרופתי למוות תאים מאפטורים יוביל להבנה חסרת תקדים של פירוק הקשורות לגיל של תפקוד עצבי ויספק תובנות קריטיות עם רלוונטיות רחבה לבריאות האדם ואיכות החיים.

מבוא

במהלך שני העשורים האחרונים שימש כאורגניזם מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של מוות תאי נקרוטי. ג. אלגיה מציעה מערכת עצבים מאופיינת וממופה במיוחד, מבנה גוף שקוף ורפרטואר מגוון של שיטות גנטיות ודימות לניטור הפונקציה vivo סלולרית והישרדות במהלך ההזדקנות. לפיכך, מספר מודלים גנטיים של ניוון עצבי כבר פותחו כדי להעריך את הכדאיות העצבית. בפרט, מתוארים היטב ומשומשים מודלים נמטודות כוללים נמק המושרה ערוץ יון1,2,3 ומוות תא המופעל על ידי צבירת חלבון מוגבר4,5,6,7,8,9,10 וחום שבץ11,12, בין היתר.

חשיפה לטווח קצר לטמפרטורות תת-קטלניות הענקת עמידות נגד מוות בתאי נמק, המופעל על ידי מתח החום הבאים הן בתוך נמטודות ונוירונים מיונקים11. מעניין, מיזוג יומי של נמטודות בטמפרטורה מוגבה מתון מגן מפני נוירוניוון, אשר נגרם על ידי גירויים שונים, כגון חוסר איזון יונית (g., mec-4 (u231) ו/או מעלות -3 (u662)) וצבירת חלבונים (לדוגמה, α-synuclein ו-polyQ40)11,13.

כאן, אנו מתארים מתודולוגיות רב-תכליתיות באמצעות C. אלגיה כדי לפקח ולהעריך ניוון הגילאים תלויי מודלים של מחלות האדם, כגון הרגש מוות מעורר התאים, פרקינסון ומחלת הנטינגטון. יתר על כן, אנחנו להדגיש את התפקיד הנוירולוגי של מיזוג חום במודלים שונים של ניוון. שילוב של טכניקות אלה יחד עם מסכים גנטיים ו/או תרופתי יגרום לזיהוי ואפיון של מודטורים מוות תאים הרומן, עם ריבית טיפולית פוטנציאלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מוות של תאים נקרוסטיים הנגרמת על ידי ערוצי יון היפראקטיבי

הערה: מוטציות הרווח של הפונקציה במשפחת הגנים של degenerins, כולל mec-4 ו-מעלות 3 בין היתר, תוצאות הדור של ערוצי יון היפראקטיבי המפעיל מוות של תאים נקרוטיים של שישה הנוירונים לקולטן מגע הנדרש עבור מכונאי תולעים3. נמק שנגרם על ידי הגירוי החריג של הדגנרנס מציג מספר דומה של מכניסטים ומורפולוגיים לעירור ההתרגשות ביונקים. תחזוקת מטבוליזם האנרגיה והומאוסטזיס סידן יש תפקיד מכריע על הישרדות עצבית במהלך נמק11. הזנים הבאים ניתן להשתמש כדי לפקח על מוות תאים נקרוטיק המופעל על ידי ערוצי יון היפראקטיבי, mec-4 (u231) X ו-מעלות -3 (u662) V.

  1. אחזקה, סנכרון והכנת תולעי מוטציה לבדיקת מוות תאי נקרוטי
    1. יום 1: לקטוף L4 הזחלים של mec-4 (u231) או מעלות 3 (u662) מוטציה נמטודות על מדיה צמיחה נמטודות (ngm; שולחן 1) צלחות שנזרע עם es, האנכיה coli (OP50) באמצעות ניתוח stereomicroscope.
    2. מקום 10 L4 נמטודות לכל צלחת ngm שנזרע ולגדול אותם בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c.
    3. יום 5: לשטוף את הצלחות עם 1 מ ל של M9 מאגר (שולחן 1) ולאסוף את החיות בצינור 1.5 mL.
    4. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s ולהסיר את supernatant.
    5. הוספת 0.5 mL של תמיסת הלבנה (7 מ ל של H2O, 1 מ ל 5 N naoh ו 2 מ"ל של אקונומיקה).
      הערה: הלבנת התמיסה מאבדת בהדרגה את יעילותה; ולכן יש להכין אותו מדי יום.
    6. מערבולת ומוניטור מדי פעם עד התולעים התפרקה.
      הערה: הימנע מהלבנה לתקופות ארוכות מ-5 דקות, מכיוון שיכולת הקיום של העוברים תושפע.
    7. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s ולהסיר את supernatant.
    8. כביסה פעמיים את הגלולה (ביצים) עם 1 mL של M9 מאגר.
    9. לאחר כביסה, להשעות מחדש את הביצים ב-200 μL של מאגר M9 ו מודלים אותם 25 דקות ב 34 ° c באמבט מים.
    10. שמרו על קבוצה נפרדת של מדגם ביצים ברזולוציה של 20 ° c.
    11. פיפטה 100 μL של שליטה או חום ביצים שטופלו ומניחים אותם על לוחות NGM לא הנזרע. כל צלחת מכילה לפחות 100-200 ביצים.
    12. מודפה את הביצים ב -20 ° צלזיוס עד לבקיעה.
  2. הרכבה L1 הזחלים לבדיקה באמצעות ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC; נוארמסקי) מיקרוסקופ
    1. הכינו 2% משטחי הצמח.
    2. השתמש 1 mL של M9 מאגר לשטוף את הצלחות ולאסוף הזחלים L1 נמטודות בצינורות 1.5 mL.
    3. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s.
    4. הסר את הסופרנטאנט ושמור את הגלולה (nematodes).
    5. הוסף 100 μL של 20 מ"מ M9/levamisole מאגר כדי לממש את הנמטודות.
      הערה: הימנע נתרן אזיד כהרדמה. נתרן עזידה מפעילה נזק מיטוכונדריאלי ומתח חמצוני מוביל בסופו של דבר למוות תאים אינדוקציה
    6. פיפטה 10 μL של מאגר M9/levamisole המכיל תולעים L1 ולטעון אותם על 2% השני רפידות (טבלה 1).
    7. הנח בעדינות את הכיסויים בחלק העליון של המדגם.
      הערה: אטום את הכיסויים בלק הציפורניים כדי לשמר לחות לאורך כל תהליך ההדמיה.
    8. שימו לב לתולעים באמצעות ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC; Nomarsky) מיקרוסקופ.
    9. ניקוד נוירוניוון של שישה הנוירונים לקולטן מגע על ידי ספירת תאים עם המראה האופייני לחללים האופייניים לכל nematode.

2. חלבון מושרה ניוון מצטבר

הערה: הזנים הבאים ניתן להשתמש כדי לחקור את אגרגטים החלבון המושרה-רעילות נוירוגרם: (א) ביטוי יתר של האדם α-synuclein בנוירונים, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1gfp] ו (ב) הבעות יתר של חלבון polyglutamine האנושי (polyglutamine) פאן-neuronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40:: yfp]6,10.

  1. אחזקה, סנכרון והכנת מחלות טרנסגניים לצורך שיטת ניוון נוירותית
    1. השתמש בניתוח stereomicroscope כדי לפקח על פיתוח וצמיחה של ג. אלגיה .
    2. יום 1: לסנכרן את האוכלוסייה של נמטודות טרנסגניים על ידי איסוף והעברה של 15-20 L4 הזחלים של כל זן על לוחיות טריות OP50-הזריעה.
      הערה: השתמש בשלוש צלחות לפחות בכל אחד מהזנים בכל תנאי.
    3. דגירה ומאפשרים נמטודות לגדול בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c.
    4. יום 2: לבצע התניה יומית במשך 30 דקות על ידי העברת הצלחות בחממה שנקבעה ב-34 ° c. לאחר מכן, החזר את הנמטודות הממוזגים לאחור בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c.
      הערה: רקע גנטי שונה עשוי להיות רגיש לטמפרטורה גבוהה לחשיפה לפרקי זמן ארוכים.
    5. (א) בחקירת ביטוי יתר של α האדם-synuclein בנוירונים הדוגיים, UA44: הוא[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1gfp]: ביום 9, צג 7 ימים-העברה הטרנסגניים הישן עבור מוות התאים הנוירוניגיים.
    6. (ב) בחקירת הבעות יתר של חלבון polyglutamine האנושי (polyglutamine) פאן-NEURONALLY, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40:: yfp]: ביום 5, למדוד אגרגטים עצביים polyglutamine באזור הראש של בעלי 4 ימים בעלי חיים טרנסגניים ביטוי Q40:: yfp.
  2. הרכבה של דגימות לבדיקה מיקרוסקופית
    1. הכינו 2% משטחי הצמח (שולחן 1).
    2. הוסף 10 μL של 20 מ"מ M9/מאגר levamisole ירידה במרכז של כרית agarose.
    3. בחר את נמטודות בהתאמה ולהעביר אותם בירידה M9/levamisole.
      הערה: מ20-30 מקום לירידה.
    4. מניחים בעדינות שמיכות בחלק העליון של המדגם.
      הערה: אטום את הכיסויים בלק הציפורניים כדי לשמר לחות לאורך כל תהליך ההדמיה.
    5. המשך לבדיקה מיקרוסקופית של הדגימות המתאימות.
  3. תהליך הרכישה וניתוח נתונים של מעבר שיתוף והבעת הביטוי α-synuclein ו ציטוטרוג GFP בנוירונים הדוגיים
    1. השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית בשילוב עם מצלמה (למשל, EVOS FL אוטומטי 2).
    2. לזהות וללכוד תמונות של מחסנית z של אזור הראש בהגדלה של 20x.
    3. שמור ואסוף את התמונות של הקרנת העוצמה המירבית.
    4. המשך לניתוח התמונות שנרכשו.
    5. בדוק את התולעים הטרנסגניים עבור ניוון נוירוגני על ידי הבקיע את המאפיינים הסלולריים הבאים, (i) אובדן של זריחה מן הנוירונים ביטוי GFP תחת היזם של dat-1, (ii) נוירונים מראה סומה ו/או האקסון, outgrowths או אובדן הדנדריטים.
    6. יבא ונתח את הנתונים באמצעות חבילת תוכנה (לדוגמה, Excel).

3. תהליך הרכישה וניתוח נתונים של נמטודות מבטאים את פאן-neuronally PolyQ40 התמזגו עם yfp

  1. השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית בשילוב עם מצלמה (למשל, EVOS FL אוטומטי 2).
  2. לזהות וללכוד תמונות של מחסנית z של אזור הראש בהגדלה של 20x.
  3. שמור ואסוף את התמונות של הקרנת העוצמה המירבית.
  4. המשך לניתוח התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת פיג'י.
  5. פתח תמונות עם תוכנית פיג'י14.
  6. בחרו בפקודה ' פצל ערוצים ' באמצעות התפריט הנפתח ' תמונה ' ו'צבע '.
    הערה: שמור את תמונת הערוץ הירוק.
  7. השתמש בכלי בחירה ביד חופשית כדי להגדיר באופן ידני את אזור הפלורסנט של הריבית (ROI; לדוגמה, ראש).
  8. הוסף את התשואה המתאימה ב- Roi Manager באמצעות לנתח וכלים התפריט הנפתח.
  9. הפחת את הרקע ל-50% על-ידי בחירה בתהליך וחיסור רקע.
  10. הגדר והחל ערכי סף באמצעות תמונת פקודת התפריט | כוונן | הסף. שמור וקבע את אותם ערכי הסף במהלך ניתוח התמונה של הניסוי כולו.
  11. בחר את ההחזר המתאים ממנהל הroi.
  12. לנתח את מספר אגרגטים החלבון באמצעות פקודת התפריט לנתח ולנתח חלקיקים.
  13. חזור על שלבים 3.5-3.12 עבור כל תמונה שנרכשה.
  14. העתק את ערכי התצוגה מחלון התוצאות הנפרד.
  15. הדבק/יבא ונתח את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה.

4. דו ח ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש לפחות 30 נמטודות עבור כל מצב ניסיוני. בצע שלוש משכפל ביולוגי.
  2. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי לביצוע מבחן t (השוואה בין שתי קבוצות) או ב -ANOVA (השוואה בין קבוצות מרובות) לניתוח סטטיסטי עם p < 0.05 כמשמעותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מוות בתאי נמק שנגרם על ידי תעלות היפראקטיביות
באמצעות ההליכים המוצגים כאן, mec-4 (u231) ו-מעלות 3u662) עוברי מוטציה היו מודבטים עבור 25 דקות ב 34 ° צ' או שמרו בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c. במהלך הבקיעה נקבע מספר גופות התאים העצביים בL1 הזחל של שתי הקבוצות. נמק מוות התאים הוא פחתה בתוך נמטודות שבקע מן הזעזועים חום ממוזג ביצים (איור 1א-1b).

ניוון מצטבר של חלבון
ביטוי הטרנסגניים מוגזם (A) האד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות עבור צמיחה, סנכרון ובדיקה מיקרוסקופית של כמה מודלים רב-תכליתי מסוג C. אלגיה חקירת ניוון מוחי התלוי בגיל. במיוחד, אנו להעריך ולנתח את התחתון הסלולר והמולקולריים של התמוטטות עצבים הקשורים לגיל באמצעות היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק המושרה חלבון מושרה נוירורעילות1,2,3,4,5,7

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים לצ מ. ולקונאקיס K. להקלטת וידאו ועריכה. K.P. ממומנת על ידי מענק הקרן היוונית למחקר וחדשנות (HFRI) ואת המזכירות הכללית למחקר וטכנולוגיה (GSRT). N.T. ממומנת על ידי מענקים ממועצת המחקר האירופית (ERC-GA695190-המן), תוכניות המסגרת של הנציבות האירופית ומשרד החינוך היווני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרסיגמא-אולדריץ'5040
אגרוזביוזים8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC)
סידן כלורי מיובש (CaCl2?2H2O)Sigma-AldrichC5080
כולסטרולSERVA אלקטרופורזה17101.01
deg-3(u662)V או deg-3(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)שמור על בעלי חיים ב-20 מעלות;
מיקרוסקופ C DIC (Nomarsky)ZeissAxio Vert A1
סטריאומיקרוסקופ מנתחNikon CorporationSMZ645
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיThermo Fisher ScientificEVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 זןCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri צלחות (60 מ"מ x 15 מ"מ)Sigma-AldrichP5237
פיג'יhttps://fiji.sc
KH<תת>2PO<תת>4EMD Millipore1,37,010
K2HPO4EMD Millipore1,04,873
מגנזיום גופרתי (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
mec-4(u231)X או mec-4(d)הגנטיקה של Caenorhabditis (CGC)שמור על בעלי חיים ב-20 מעלות; C
שקופיות מיקרוסקופ (75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ (18 מ"מ x 18 מ"מ)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel חבילת תוכנהMicrosoft Corporation, רדמונד, ארה"ב
Na2HPO4EMD Millipore1,06,586
אגר מדיום גידול נמטודות (NGM)
תמיסת מלאי ניסטטיןSigma-AldrichN3503
פפטוןBD, Bacto211677
מאגר
נתרן כלורי (NaCl)EMD Millipore1,06,40,41,000
ציוד סטנדרטי להכנת לוחות אגר ( חיטוי, צלחות פטרי וכו')
ציוד סטנדרטי לתחזוקת תולעים (פיק חוטי פלטינה, אינקובטורים וכו')
תוכנת ניתוח סטטיסטיGraphPad Software Inc., סן דייגו, ארה"בחבילת תוכנה GraphPad Prism
StreptomycinS6501
Tetramisole hydrochlorideSigma-AldrichL9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]על פי בקשה: ג. קולדוול (אוניברסיטת אלבמה, טוסקלוסה AL)
תוכנת ניתוח תמונות מרכז צלחות פוספט

מקורות

  1. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
  2. Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
  3. Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
  4. Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  5. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  6. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  7. Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
  8. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  9. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  10. Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
  11. Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
  12. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
  13. Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337(2017).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניוון עצבי ב-C. elegansנמק תעלות יוניםנוירוטוקסיות של צברי חלבוניםסריקות גנטיותסריקות פרמקולוגיותמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתמיקרוסקופיית DICעיבוד מקדים של הלם חוםצברי אלפא-סינוקלאיןמוות של נוירונים דופמינרגיים
דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.