תפוקה גבוהה של מגבלות תרמיות קריטיות בחרקים

סיכום

מגבלות תרמיות יכולות לחזות את סביבות אורגניזמים לסבול, שהוא מידע בעל ערך לנוכח שינוי האקלים המהיר. מתואר כאן פרוטוקולים בתפוקה גבוהה כדי להעריך מינימה תרמית קריטית וזמן נוקאאוט חום בחרקים. שני הפרוטוקולים ממקסמים את התפוקה וממזערים את עלות ההתייענות.

תקציר

גבולות תרמיים עלונים ונמונים של צמחים ובעלי חיים הם מנבאים חשובים של הביצועים שלהם, הישרדותם והתפלגויות גיאוגרפיות, והם חיוניים לחיזוי תגובות לשינויי האקלים. עבודה זו מתארת שני פרוטוקולים בתפוקה גבוהה למדידת מגבלות תרמיות של חרקים: האחד להערכת מינימה תרמית קריטית (CT_min), והשני להערכת זמן ההשבתה של חום (KDT) בתגובה לגורם לחץ חום סטטי. ב- CT_{מינימום} assay, אנשים ממוקמים בעמודה אקריליק ז'קט, נתון לרמפת טמפרטורה יורדת, ונספר כפי שהם נופלים מהסחזים שלהם באמצעות חיישן אינפרא אדום. בחום KDT assay, אנשים כלולים צלחת 96 גם, ממוקם באינקובטור להגדיר למלחיץ, טמפרטורה חמה, וידאו הוקלט כדי לקבוע את הזמן שבו הם כבר לא יכולים להישאר זקוף ולזוז. פרוטוקולים אלה מציעים יתרונות על פני טכניקות נפוצות. שני המקרים הם בעלות נמוכה ותוקף להשלים במהירות יחסית (~ 2 שעות). ה-CT_{מינימום} assay מפחית שגיאת experimenter והוא יכול למדוד מספר גדול של אנשים בו זמנית. פרוטוקול KDT חום יוצר תיעוד וידאו של כל תס"א ובכך מסיר הטיה experimenter ואת הצורך לפקח ברציפות על אנשים בזמן אמת.

מבוא

גבולות תרמיים של חרקים
שינויים בתנאים סביבתיים, כולל טמפרטורה, הוא גורם מרכזי המשפיע על הביצועים, כושר, הישרדות, והפצה גיאוגרפית של^{אורגניזמים 1,,2}. מגבלות תרמיות עליונות ונמיכות קובעות את הטווח התיאורטי של סביבות אורגניזם יכול לסבול, ולכן, מגבלות אלה הן מנבאים חשובים של התפלגות צמחים ובעלי חיים, במיוחד לנוכח^{שינוי האקלים 3,4}. לפיכך, פרוטוקולים למדי מידה מדויקת של מגבלות תרמיות הם כלים חשובים עבור אקולוגים, פיזיולוגים, ביולוגים אבולוציוניים וביולוגים לשימור, בין היתר.

כחיות הארציות השופעות והמגוונות ביותר, חרקים משמשים לעתים קרובות למדידות של גבולות תרמיים. מקסימום תרמי קריטי (CT_{מקסימום)}ומינימה תרמית קריטית (CT_min)משמשים בדרך כלל להערכת וריאציה פנים-ו- interspecific^{בסובלנות תרמית 5,6,7}. בעוד CT_{מקסימום} ו CT_דקות ניתן למדוד עבור פנוטיפים מרובים, כולל צמיחה, תפוקת הרבייה, והתנהגות, הם מוחלים בדרך כלל על פונקציית locomotor^5,6,7. לפיכך, CT_{מקסימום} (המכונה גם טמפרטורת נוקאאוט חום) ו CT_דקות מוגדרים לעתים קרובות כטמפרטורות גבוהות ונמוכות שבו חרקים מאבדים את התפקוד המוטורי ואינם מסוגלים להישאר^{זקוף 5,6,7,8,9,10,11}. CT_דקות עולה בקנה אחד עם תחילתה של תרדמת צינה, שיתוק הפיך הביא על ידי טמפרטורות קרות⁶. בעוד שיתוק בגבולות התרמיים הוא לעתים קרובות הפיך, חשיפה מתמשכת לטמפרטורות אלה מובילה למוות אקולוגי⁵.

שיטות נפוצות למדידת מגבלות תרמיות
מגוון של ציוד שימשו כדי למדוד מגבלות תרמיות (מסוכם סינקלייר ואח '. ⁶. בקצרה, חרקים מחוממים או מקוררים^{באינקובטורים 12,13,}מכולות שקועות באמבטיות^{נוזלים 11,14},^15,16,בלוקי^{אלומיניום 10,,17,}או מכולות^{ז'קט 18}, ומעקב עד שהקטר מפסיק. כדי לפקח על חרקים במהלך ההתאסה, השיטה הנפוצה ביותר היא התבוננות ישירה, שבה אנשים מנוטרים ברציפות בזמן אמת או בדיעבד עם^{וידאו מוקלט 6,9,10,11,15,17}. בעוד שיטות תצפית ישירה יש דרישות ציוד מינימליות, הם עבודה אינטנסיבית ולהגביל את התפוקה. לחלופין, ניתן לצפות בחרקים בעקיפין על ידי איסוף אנשים בזמנים דיסקרטיים^{כאשר הם נופלים מספנות 6,19,20,21} או באמצעות צגי פעילות¹³.

שיטות עקיפות למדידת מגבלות תרמיות הן בדרך כלל תפוקה גבוהה יותר ועלולות להיות פחות מועדות לטעויות מאשר שיטות תצפית ישירה. השיטה הנפוצה ביותר לניטור עקיף משתמשת בעמודה מבוקרת טמפרטורה^{עם ז'קטים 6,,8,,19,,20,,21}. חרקים ממוקמים בתוך עמוד עם צבים, והטמפרטורה של התא הפנימי נשלטת על ידי שאיבת נוזלים מאמבט נוזלי מבוקר טמפרטורה דרך הבטנה הז'קט של הטור. אנשים שמגיעים לגבול התרמי שלהם נופלים מהמקום שלהם ונאספים בטמפרטורות דיסקרטיות או במרווחי זמן. בעוד שיטה זו פועלת היטב עבור CT_דקות, זה נמצא לא מתאים CT_{מקסימום}, כי זבובים מרצון לצאת מתחתית העמודה כאשר הטמפרטורה עולה. השיטה החדשה המתוארת כאן עוקפת בעיה זו על ידי כך שהיא מכילה זבובים באופן אישי במהלך מדידות אוטומטיות.

בנוסף לשיטת התצפית, שני סוגים של משטרי טמפרטורה משמשים בדרך כלל כדי להעריך את הגבולות התרמיים העליונים. ההתייענות הדינמית מורכבת מהגברת הטמפרטורה בהדרגה עד שהתפקוד המוטורי אובד; טמפרטורה זו היא CT דינמי_{מקסימום}^7,8,9,13. לעומת זאת, ההתייחדות הסטטית מורכבת מטמפרטורה מלחיצה מתמדת עד לאיבוד התפקוד המוטורי; נקודת זמן זו היא זמן הנוקאאוט של החום (חום KDT), המכונה גם_{מקסימום} CT סטטי (sCT_max)בנייר^{שפורסם לאחרונה}על ידי יורגנסן ואח'^7,8,9,,16,22. למרות CT_{מקסימום} וחום נוקאאוט (חום KD assays) לייצר מדדים עם יחידות שונות, מידול מתמטי של שתי התכונות מציין שהם נותנים מידע דומה על עמידות חום ושניהם^{רלוונטיים מבחינה אקולוגית 8,9}. בדיקות דינמיות מניבות טמפרטורה שניתן להשוות לתנאים סביבתיים, והן עדיפות כאשר יש הבדלים גדולים בסובלנות לחום, כגון השוואות בין מינים עם גומחות תרמיות שונות באופן נרחב. עם זאת, בשל Q10 גבוה להצטברות פציעות חום, שקע סטטי עשוי להיות עדיף לזיהוי גדלי אפקט קטן, כגון וריאציה תוך ספציפית בסובלנות^{חום 9}. כמו כן, מבחינה מעשית, אסיי סטטי דורש ציוד פחות מתוחכם מאשר אסיי דינמי.

המטרה
מטרת נייר זה היא להפוך שיטות לפורמלית עבור CT_דקות וחום KD assays שניתן להשתמש במחקר עתידי כדי להעריך את הגבולות התרמיים של חרקים מוטיב. הפרוטוקולים מותאמים ממתודולוגיות שנקבעו בעבר ומתועדים להיות בעלי תפוקה גבוהה, אוטומטית וחסכונית. ניתן להשלים את שני ההתאסות תוך זמן קצר (~ 2 שעות), מה שאומר שניתן לערוך ניסויים מרובים ביום אחד, ולייצר כמויות גדולות של נתונים מבלי להקריב יכולת חזרה או דיוק. עם התקנה זו, ניתן למדוד בו-זמנית את עמידות החום של 96 זבובים, בעוד שהטור עבור CT_min יכול להכיל יותר מ-100 זבובים, בתנאי שיש שטח פנים מתאים לתפס.

שיטת התפוקה הגבוהה להתבוננות ב- CT_min משנה את מתודולוגיית העמודות הנפוצה עם תוספת של חיישן אינפרא אדום לספירת זבובים באופן אוטומטי. השימוש בחיישן אינפרא אדום לספירה הוצע לראשונה על ידי שומן ואח' בשנת 1996^23, אך לא אומץ באופן נרחב. התוספת של חיישן האינפרא-אדום מאפשרת יצירת נתונים רציפים במקום לאסוף נתונים במרווחי זמן שונים. פרוטוקול זה גם ממזער את שגיאת הניסוי על-ידי ביטול הזנת נתונים ידנית והצורך להחליף צינורות איסוף באופן ידני מתחת לעמודה הנספסת בנקודות זמן שונות.

שיטת התפוקה הגבוהה לתיעוד חום KDT משתנה משני מחקרים קודמים של עמידות^{לחום בחרקים 10,12}. זבובים בודדים מאוחסנים בצלחת 96 באר באינקובטור מבוקר טמפרטורה ווידאו מוקלט. פרוטוקול זה ממזער הטיית ניסויים בקביעת KDT חום מכיוון שניתן לסקור ולאמת ניסויים על-ידי השמעת ההקלטה. פרוטוקול זה מספק גם קבוצה של קבצי Script מותאמים אישית של פיתון שניתן להשתמש בהם כדי להאיץ את ניתוח הווידאו. השימוש בארות בודדות מבטל הפרעות שעלולות להתרחש כאשר אנשים אחרים לנוע או ליפול, אשר יכול להיות בעיה כאשר קבוצות של^{אנשים נצפו באותה זירה 10,17}. יתר על כן, האינקובטור מבוקר טמפרטורה מספק טמפרטורה יציבה על פני כל 96 הבאות, בניגוד לטמפרטורה הדרגתית שנצפתה לעתים על פני בלוק אלומיניום מבוקר^{טמפרטורה 10}. כמו כן, שים לב כי שיטת הקלטה 96 גם ניתן להתאים למדוד CT_{דינמי מקסימום} ופוטנציאל CT_דקות (ראה דיון).

כדי להדגים כל פרוטוקול, הגבולות התרמיים של נקבות מלנוגסטר דרוזופילה בוגרות מן השורות הנבחרות של לוח הייחוס הגנטי Melanogaster Drosophila (DGRP)^{הושוו 24}. קווים אלה נבחרו מכיוון שניסויים ראשוניים הצביעו על הבדלים משמעותיים בסובלנות תרמית. אלה הוכחו כשיטות חזקות להפלות הבדלים בסובלנות תרמית. שני הפרוטוקולים הבאים, תפוקה גבוהה CT_{מינימום} assay (סעיף 1) ו חום תפוקה גבוהה KD assay (סעיף 2), לתאר את הפעולות הדרושות כדי לייצר CT_דקות וחום נתוני KDT עבור כל שלב חיי חרקים מוטיב מסוגל להתאים את האביזרים, כגון דרוסופילה למבוגרים. עבור CT_דקות זה גם חיוני כי החרק להיות מסוגל לעמוד. כאן, כל תסה מדגים במלנוגסטר דרוזופילה למבוגרים. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בשינויים עבור מסה אחרים או שלבים^{חיים 6}. שינויים קלים עשויים לכלול שימוש בחומר חריץ עם פתחים גדולים יותר כדי להכיל דגימות גדולות יותר ב- CT_{מינימום} assay או שימוש במצלמה באיכות גבוהה יותר כדי להבחין KDT עדין של חרק נע לאט או שלב החיים בהאשה KD חום. פרוטוקול זה אינו מתאר שיטות להכנת זבובים, אך חשוב לתקנן פרוטוקולי גידול כדי להבטיח^{יכולת חזרה 25} (ראה גרסיה ו-Teets²⁶ ו-Teets ו-Hahn^27). הפרוטוקולים שסופקו כוללים מידע על אופן הבנייה וההגדרה של ההתאגנות, כיצד להקליט מדידות ותיאור קצר של ניתוח נתונים.

פרוטוקול

1. תפוקה גבוהה_{CT מינימום} תוואי

1. הרכבת העמודה עם הז'קט (איור 1A, איור 2)
   1. חותכים את הצינורות האקריליים הרחבים ביותר (7 ס"מ על 6.35 ס"מ על 0.3 ס"מ) והצרים ביותר (5.7 ס"מ על 5.1 ס"מ על 0.3 ס"מ) לאריכות שוות (31.5 ס"מ) עםמסור (איור 2א'). שני הצינורות האלה יהיו הקירות החיצוניים והפנימים ביותר של העמודה הז'קט.
   2. חותכים שתי טבעות (רוחב 2 ס"מ) מהצינור האקרילי בגודל בינוני (6.35 ס"מ על 5.7 ס"מ על 0.3 ס"מ) עםמסור (איור 2א'). שתי טבעות אלה יהיו החללים בין הצינורות הפנימיים והחוץיים ביותר, יצירת רווח בין שתי צינורות אקריליק ארוך עבור נוזל לזרום.
   3. בזהירות לקדוח שני חורים בצינור אקרילי (הרחב ביותר), חור אחד למעלה ואחד בתחתית. ודא כי כל חור הוא 3.5 ס"מ מקצה הצינור. לקדוח את החורים בצדדים מנוגדים של הצינור (איור 2B).
   4. כדי להפחית פיצוח, למקם את הסרט על הצינור מעל הנקודה של החור בעתיד לקדוח לאט מאוד על הגדרת מומנט הנמוך ביותר של המקדחה.
   5. באמצעות הקשה השחלה, thread שני החורים כך מתאמי צינור ניתן לדפוק לתוך שני החורים של הצינור חיצוני. כדי להפחית פיצוח, השתמש בחומר סיכה, וחוט לאט ביד.
   6. החלק את שני החללים אל הז'קט הפנימי, אחד בכל קצה (למטה ולמעלה). השאר רווח קטן (0.5 ס"מ) בין המחלל לקצה הז'קט הפנימי(איור 2ב').
   7. לרתך את החללים למקומו באמצעות בטון אקריליק.
   8. לאחר המלט על הצינור הפנימי וsser קובע, להחליק את המבנה הזה לתוך הצינור החיצון גדול יותר עם החורים. ודא כי הצינורות הפנימיים והפנימים הם סומק בשני הקצוות. החללים יהיו 0.5 ס"מ מהקצה, ויוצרים תעלות קטנות משני צידי העמודה (איור 2ג').
   9. לרתך את הצינור החיצון לחללים באמצעות מלט אקרילי, באמצעות מהדקי פלדה מתכווננת להחזיק את ההתאדרה יחד. חכה שהמלט ימוכן.
   10. להשחיל את מתאמי הצינור לתוך החורים של הצינור החיצון עכשיו מאובטח ים וצינור פנימי.
       הערה: המתאמים צריכים להשתחל רק לתוך הצינור החיצון ולא לתוך החלל הפתוח בין הצינורות הפנימיים והחוץיים ביותר. אם מתאמי הצינור חוט רחוק מדי ב, לקצר אותם לאורך המתאים עם מסור.
   11. אטמו את מתאמי הצינור בחוטים שלהם בצינור חיצוני עם חומר איטום סיליקון.
   12. מלאו את שתי השוחות בין הצינורות הפנימיים והפנימיים ביותר משני קצות העמודה עם הז'קט עם חומר איטום סיליקון.
   13. כדי לבדוק את העמודה, חבר צינורות בקוטר 0.6 ס"מ למתאמי הצינור. חבר את המתאם בתחתית העמודה למקור מים עם צינורות, ואת המתאם בראש העמודה לניקוז עם חתיכת צינור אחרת.
   14. תריץ מים דרך ההתאון מלמטה למעלה ותבדוק אם יש דליפות. אם יש דליפות, זהה מאיפה הן מגיעות וחתום עם סיליקון.
2. הגדרת העמודה עם הז'קט וצג המשפך של דרוסופילה (DFM)
   1. אבטחו את העמודה המקטורנת לעמוד ת'ת-חסידה עם מלחציים של שלושה ראשים. יישר את העמודה אנכית עם קצה אחד פתוח לתקרה והשני פתוח לספסל המעבדה(איור 1ב').
   2. חבר את קלט הנוזלים והפלט מאמבט קירור מבוקר טמפרטורה לתבליטי העמודה עם צינורות פלסטיק בקוטר 0.6 ס"מ(איור 1ב'). חבר את קלט הנוזלים לתנון בתחתית העמודה ואת תפוקת הנוזלים לתנון בראש העמודה.
   3. חותכים שני תקעי בידוד קצף עגולים בעובי 3 ס"מ (היקף זהה לפתיחת התא הפנימי ביותר של העמודה). ודא שהתקעים מתאימים בצורה נוחה ואטום את העמודה הפנימית ביותר בעת הוספה בשני הקצוות(איור 1ב').
   4. לנקב חור דרך המרכז של אחד התקעים ולהשחיל את הקצה החשוף של thermocouple דרך החור על 5 ס"מ ומאובטח עם קלטת. חבר את הקצה השני של התרמוקופל ללוגר נתונים תרמוקופל.
   5. חבר את לוגר הנתונים של התרמוקופל למחשב.
   6. טריז שתי חתיכות של מרזב פלסטיק (5 ס"מ x 7 ס"מ, עם ~ 0.5 ס"מ קטר פתחים) בתוך העמודה כדי לתפקד כחומר חריץ. מניחים חתיכת שומר אחת 2/3^rds מה החלק העליון של העמודה והשני 1/3^rd מה החלק העליון של העמודה (איור 1B).
   7. אבטחו את התקע התחתון (ללא תרמוקופל) ואת התקע העליון (עם תרמוקופל). כאשר התקע מוכנס בראש העמודה, ודא שהתרמוקופל אינו נוגע בצידי העמודה.
   8. התאם את גובה העמודה בעמדה לגובה כך שיהיה מרחק של 25 ס"מ בין תחתית העמודה לבין החלק העליון של הספסל.
   9. אבטח טבעת תחליף (בקוטר 5 ס"מ) לעמוד השיבה 5 ס"מ מתחת לתחתית העמודה וסובב את הטבעת לצד העמודה.
   10. הגדר את ה- DFM ישירות על טבעת ההתרה (איור 1B). חבר את כל הרכיבים האלקטרוניים: ספק הכוח, ממשק ספק הכוח והמחשב בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   11. לאחר חיבור הרכיבים, פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן כדי לסיים את ההתקנה של תוכנת DFM ו- DFM.
3. Ct_דקות בדיקת מעבדה
   1. הפוך את שסתומי הקלט והפלט של אמבט הנוזלים לעמדות הפתוחות.
   2. לחץ על לחצן ההפעלה כדי להפעיל את אמבט הנוזלים מבוקר הטמפרטורה ולאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה כדי להפעיל תוכנית העלאת ושמירה על הטמפרטורה של האמבטיה ל 25 °C. תנו לאמבט הנוזלי ולעמודה 5-10 דקות להגיע ולתחזק 25°C.
   3. הסר את התקע בראש העמודה והחלף אותו במשפך (קוטר 5.08 ס"מ; ראה איור 1C).
   4. הקש על זבובים ממבען האוכל שלהם לתוך הטור.
   5. הסר את המשפך והחלף אותו בתקע העליון במהירות, היזהר לא לתת לזבובים לברוח. לתת את הזבובים 5 דקות להתיישב, מדי פעם הקשה על התקע התחתון כדי לעודד את הזבובים לטפס.
   6. לחץ על לחצן התחל באמבט הנוזלים והתחל_את תוכנית הניגוח דקות CT (25 °C למשך 5 דקות; 25°C עד 10°C ב- 0.5°C/min; 10°C למשך 2 דקות; ולאחר מכן 10°C עד -10°C ב- 0.25°C/min).
      הערה: וריאציות אחרות של פרוטוקול זה CT_דקות ramping ניתן להשתמש בהתאם לשאלת המחקר (למשל, השוואות של ההשפעות של שיעורי ניגוח שונים על CT_דקות²⁸).
   7. לחץ על פתח את תוכנת ההקלטה thermocouple במחשב ולאחר מכן לחץ על סמל הקלטה כדי להתחיל להקליט את הטמפרטורה בתוך העמודה בכל שנייה למשך ההסכם. ודא שכל הקלטת טמפרטורה כוללת חותמת זמן ספציפית לשניה, כך שניתן יהיה למזג מאוחר יותר נתוני טמפרטורה עם נתונים מה- DFM.
   8. הוסף 5 מ"ל של 90% אתנול לצינור צנטריפוגה חורט 15 מ"ל ולמקם אותו בארון תקשורת מתחת לעמודה.
   9. מדי פעם, הקש על התקע התחתון של העמודה כדי לפתות זבובים בתחתית לטפס. רוב הזבובים יהיו על החכה או ליד החלק העליון של העמודה על ידי 15 °C.
   10. ב 15 °C, להסיר את התקע התחתון ולאסוף את כל הזבובים עדיין על התקע התחתון אתנול. לספור ולציין כי זבובים אלה נאספו ב 15 ° C אבל CT_{שלהם דקות} אינו ידוע.
       הערה: יש להחליט על הטמפרטורה שבה התקע התחתון מוסר לפני ההסתה ומבוססת על דקות ה-CT_{החזויות} של מין הבדיקה או הטיפול. עבור ספירה זו, 15 °C נבחר בהתבסס על דקות CT_של קווי DGRP מסוימים אלה נמצאו בבדיקות ראשוניות.
   11. מניחים משפך זכוכית בקוטר 75 מ"מ לתוך DFM. כוונן את טבעת הה'יהוה,DFM והמשפך' כך שהם יתמקמו מתחת לעמודה. ודא כי השפה של המשפך אוטמת לחלוטין את החלק התחתון של העמודה(איור 1D).
   12. הכנס את תחתית המשפך לתוך צינור אוסף 15 מ"ל(איור 1D).
   13. פתח את תוכנת DFM במחשב על-ידי לחיצה על סמל תוכנה. התוכנה תתחיל מיד להקליט את השעה / תאריך שבו זבובים להגיע ct_{דקות שלהם}. זבובים שמגיעים_{ל-CT שלהם} מאבדים את תפקוד הנוירו-שרירי ויפלו מהמוטות שלהם, ולאחר מכן דרך ה-DFM.
   14. נטר אם כל הזבובים הגיעו דקות CT_שלהם כמו הטמפרטורה יורדת על ידי בדיקת התקע העליון ואת הינים כדי לראות אם כל זבובים עדיין יושבים (כלומר, עדיין שמירה על תפקוד עצבי שרירי). המשפט מסתיים כאשר כל הזבובים הגיעו דקות CT_שלהם.
   15. בסוף המשפט, התאם את ה- DFM ואת המשפך הרחק מפתיחת העמודה. זבובים מסוימים_{עשויים להגיע} ל-CT שלהם דקות אבל להישאר תקוע בטור (כלומר תקוע על היתד או מתנדנד על ידי וו tarsal יחיד). פתח את התקע העליון והסר את הזבובים האלה. דקות_הסי-טי של הזבובים האלה אינן ידועות.
   16. שלב את קבצי הפלט של .txt תוכנת ההקלטה של thermocouple (כלומר, טמפרטורה, תאריך ושעה) ותווכת DFM (כלומר, מספר הזבובים דרך המשפך, התאריך והשעה) באמצעות הפקודה מיזוג ב- RStudio. מזג את שני הקבצים בהתבסס על משתנה התאריך/שעה המשותף.

2. תפוקה גבוהה חום KD תוואי

1. הרכבה והכנה של אפליקציית
   1. עם דבק, לתקן את רשת התיל ארוג פלדה (~ 1.5 מ"מ צמצם) לתחתית של צלחת 96 גם לא למטה.
   2. חבר מגנטים לצדדים הנגדיים של החלק התחתון של צלחת 96 גם ללא תחתית עם אקדח דבק חם ודבק חם(איור 3).
   3. כדי ליצור מכסה מחיצה מותאם אישית עם סרט דבק המיועד ל-96 צלחות באר, הדביקו שני סרטים צדדים דביקים יחד כדי ליצור יריעת פלסטיק מרופטת.
   4. מניחים את יריעות הפלסטיק מעל צלחת 96 הבאר ולהשתמש בקלטת כדי לדבוק בו לכל ארבעת צידי הצלחת. מעל הפתח לכל באר על הצלחת, לחתוך 'x' בסדין פלסטיק עם חותך תיבה (כלומר, 96 x סה"כ).
   5. להפיחות זבובים עם CO_{2 ולטעון אותם} בנפרד לתוך כל באר של צלחת שונה 96 גם ללא תחתית עם שואף ומכסה מחיצה. הסר את מכסה המחיצה מצלחת 96 באר בעוד הזבובים מנומסים עם CO_{2 ולהחליף} אותו עם מכסה ברור מתאים היטב.
   6. מניחים את 96 הציפוי ים ללא תחתית עמוס בזבובים ועם מכסה ברור והדוק על האוכל. ודא שלזבובים יש לפחות 48 שעות בין ההתרסה CO₂ לבין תחילת ההסכם (שלבים 2.2.1-2.2.5).
      הערה: החלק התחתון של 96 הצלחות לא-תחתית ששונו עשוי רשת שינוי, כך זבובים הרדמה עם CO₂ ניתן לטעון והשאיר על מזון לפחות 48 שעות לפני תחילת המשפט. כל מיכל פלסטיק >8.5 ס"מ רוחב x 13 ס"מ אורך כי הוא לפחות 2 ס"מ עמוק כדי להכיל שכבה עמוקה 1 ס"מ של מזון ניתן להשתמש.
   7. תקן מצלמת אינטרנט לתחתית החלק הפנימי של אינקובטור מבוקר טמפרטורה עם סרט הדבקה. כוון את המצלמה ישירות למעלה( איור 4). אבטחו מדף אינקובטור כ-10 ס"מ מעל המצלמה.
      הערה: מצלמת האינטרנט מצביעה למעלה ומתוהגת את צלחת 96 באר מלמטה כדי להבטיח כמה שיותר משטח הבאר הוא בתצוגה ככל האפשר (למשל, לא חסום מהתצוגה על ידי קירות באר של הצלחת). כאשר הזבובים מגיעים KDT שלהם הם נופלים לתחתית הבאר; במקרה זה, הצד הקרוב ביותר למצלמת האינטרנט, ולכן הם בתצוגה ללא קשר כמה רחוק הבאר שלהם היא ממרכז התצוגה.
   8. חבר את מצלמת האינטרנט למחשב.
   9. עם סרט, צרף גיליון נייר לבן (8.5 ס"מ על 13 ס"מ; האזור המדויק של החלק התחתון של צלחת 96 באר) לתחתית המדף(איור 4). ודא שהנייר ממלא את המסגרת כולה כאשר הוא נמצא בתצוגה באמצעות מצלמת האינטרנט.
   10. שים מקור אור באינקובטור. השתמש בנייר או בחומרים אחרים כדי לעמעם את התאורה ולמזער את הבוהק.
       הערה שלב 2.1.10 הוא ספציפי לכל אינקובטור מכיוון שהתאורה וההשתקפויות משתנות בין האינקובטורים. המטרה היא שיהיה מספיק תאורה בחממה כדי לספק ניגוד טוב בין הזבובים בכל באר לבין גיליון הנייר הלבן מאחורי הצלחת כאשר הם נצפים עם מצלמת האינטרנט.
2. ביצוע תסוואי KD חום
   1. הגדר את האינקובטור ל-37.5°C והמתן כ-30 דקות כדי לתת לאקובטור זמן להגיע ולתחזק את הטמפרטורה הרצויה. הטמפרטורה המדויקת תהיה תלויה בהערכת החרק ובכל שיקולי זמן אחרים.
   2. מניחים את צלחת 96 היטב הפוכה באינקובטור, כך החלק התחתון של הלוח (צד רשת) הוא נגד הנייר הלבן בתחתית המגש(איור 4). שים לב לכיוון הבארים (שמות עמודות ושורה) במגש ובמסגרת מצלמת האינטרנט. סרט צבעוני לאורך צידי צלחת 96 באר וקצוות של פיסת נייר לבן יכול לאמת את הכיוון(איור 4).
      הערה: ודא כי טמפרטורת האינקובטור עולה בקנה אחד עם הטמפרטורה בתוך צלחת 96 גם על ידי הקלטת הטמפרטורה בתוך הצלחת עם thermocouple במהלך ניסוי מבחן של חום KD assay. זה גם זהיר לבדוק כי יש וריאציה זניחה בטמפרטורה בין בארות של 96 צלחת גם עם תרמוקופלים מרובים לפני ביצוע חום KD assay.
   3. סגור את דלת האינקובטור.
   4. לחץ על הקלט את תוכנת הקלטת הווידאו.
   5. לאחר 2 שעות, לבדוק את ההקלטה כדי לראות כי כל הזבובים הגיעו למקום מנוחתם הסופי והפסיק לזוז. לאחר שכל הזבובים הפסיקו לנוע, לחץ על הפסק את תוכנת הקלטת הווידאו. עבור הגנוטיפים שנבדקו כאן, גדל ב 25 °C, רוב הזבובים להגיע KDT שלהם על ידי 60 דקות ב 37.5 ° C (ראה גם Jørgensen ואח^'9).
   6. היפטר מהזבובים.
   7. השתמש בקבצי Script מותאמים אישית של פיתון(קבצי קידוד משלימים 1-3)כדי להעריך את הזמן בסרטון כאשר זבובים מגיעים ל-KDT החום שלהם.
      הערה: שלב 2.2.7 הוא אופציונלי. כדי להאיץ את ניתוח הווידאו, פותחו סט של סקריפטים מותאמים אישית של פיתון כדי למדוד שינויים בצפיפות הפיקסלים לאורךזמן בכל באר (ראה קובץ קידוד משלים). כאשר הזבובים מפסיקים לנוע, צפיפות הפיקסלים קבועה, ותואם להשתמש בחלקה של נתונים אלה כדי לאתר את הזמן המשוער בסרטון שבו זבובים מופלים. למרות שאולי ניתן יהיה להשתמש בקובץ Script זה כדי להפוך ניתוח נתונים לאוטומטי, פגמים קלים כעת בסרטון מובילים לפערים קלים בין שינויים בצפיפות הפיקסלים לבין זמן KD האמיתי.
   8. לחץ על פתח את קובץ הווידאו והקליט את ה- KDT של כל זבוב בכל באר. המדד העקבי ביותר של חום KDT בין ניסויים ומשקיפים הוא רישום הזמן שבו זבוב מגיע למקום מנוחתו הסופי.
   9. עקוב אחר הסרטון הפוך, התמקדות בבאר אחת, ובחין בזמן שבו הזבוב זז לראשונה ממקום מנוחתו האחרון. חזור על תהליך זה עבור כל באר.

תוצאות

המגבלות התרמיות (כלומר, CT_{min וחום} KDT) של נקבות מפאנל ההתייחסות הגנטית של דרוזופילה מלנוגסטר (DGRP) נמדדו כדי להדגים את נתוני התפוקה הגבוהה שנוצרו משני הפרוטוקולים המתוארים. CT_min היה assayed באמצעות קווי DGRP 714 (n = 37) ו 913 (n = 45). חום KDT היה eded בהשוואה קווי DGRP 189 (n = 42) ו 461 (n = 42), וקבצי וידאו נותחו באופן ידני. הזמן הכולל של הניסויים, כולל צפייה בסרטון, לקח <2 שעות עבור כל פרוטוקול.

דיון

שתי השיטות המפורטות לעיל יוצרות נתונים בעלי תפוקה גבוהה של מדדים רלוונטיים למען איכות המידע עבור מגבלות תרמיות גבוהות ונמונות. פרוטוקולים אלה מתבססים על מתודולוגיות שנקבעו בעבר המשותפות למחקר על מגבלות תרמיות של חרקים (המסוכמות בסינקלייר ואח'). ⁶. שני הפרוטוקולים ניתן להשלים בתוך פרק זמן קצר (~ 2 שעות כל אחד), לייצר ערכות נתונים עם גדלים לדוגמה גדולה, לא להקריב חזרה או דיוק, ולמזער את שגיאת הנסיינים על ידי ביטול הקלטה ידנית של נתונים וכניסה (CT_{מינימום} assay), או על ידי יצירת הקלטות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ARCTIC A40 סירקולטור נוזל מקורר (רמפות טפרטורות הניתנות לתכנות)	תרמו מדעי; וולת'אם, MA	153-5401
C922 Pro Stream מצלמת אינטרנט	Logitech; ניוארק, קליפורניה	960-001087
מהדק פלדה מתכוונן עגול – 5.08 ס"מ עד 7.62 ס"מ	כל
צינורות אקריליק שקופים – 5.7 ס"מ x 5.1 ס"מ x 0.3 ס"מ	United States Plastic Corp., OH	44036
צינורות אקריליק שקופים – 6.35 ס"מ x 5.7 ס"מ x 0.3 ס"מ	United States Plastic Corp., OH	440515
צינורות אקריליק שקופים – 7 ס"מ x 6.35 ס"מ x 0.3 ס"מ	United States Plastic Corp., OH	44041
איטום סיליקון שקוף	כל
צינור איסוף (15 מ"ל)	כל
מקדחה אלחוטית	כל
צג משפך דרוזופילה (DFM)	TriKinetics; Waltham, MA	DFM	משמש לספירת מספר הזבובים שנופלים דרך המשפך בנקודת זמן נתונה
תוכנת איסוף נתונים DAM	TriKinetics; וולת'ם, מסצ'וסטס		רשומות קלט נתונים ממכסה אחסון הזבובים של DFM
	FlySorter; סיטל, וושינגטון	FS-96LID-5PK	משמש להעמסת זבובים לתוך לוחית האחסון עבור בדיקת sCTmax
FlySorter של לוחית אחסון זבובים	; סיטל, וושינגטון	FS-96PLATE-5PK	משמש להחזקת זבובים במהלך בדיקת sCTmax
מגש מזון זבוב	FlySorter; סיטל, WA	FS-TRAY-5PK	משמש לשמירת זבובים על מזון לאחר העמסה לצלחת 96 בארות עד לבדיקת sCTmax
משפך זכוכית	Kimax	28950-75 75	מ"מ
מגן מרזב	כל	פתחים	בקוטר 0.5 ס"מ
מסור
חממה Heratherm Thermo Scientific	Thermo Scientific; Waltham, MA	OMS100
מתאמי ניילון צינור (2) – ¼ MNPT x 3/8	United States Plastic Corp., OH	61135
אקדח דבק חם ודבק	כל
מקור אור	כל
מגנטים	כל
מקליט OMEGA TC-08 ותוכנת נגן TC-08	OMEGA; נורווק, צמד תרמי CT
OMEGA (סוג T)	OMEGA; נורווק, CT	5LRTC-TT-K-20-36
משפך פלסטיק	כל	צינורות	בקוטר 2 אינץ'
- קוטר 0.6 ס"מ	United States Plastic Corp., OH	62852
טבעת רטרט	כל	מעמד	בקוטר 2 אינץ'
כל כל
מהדק רטרט בעל שלושה שיניים	כל
מחבר
(PSIU9)	TriKinetics; Waltham, MA	PSIU9	חיבור ביניים בין ה-DFM למחשב, מאפשר חיבורי DFM מרובים
קלקר (עובי 2 אינץ')	כל
קלטת	כל
ספק כוח ללא הפרעה (PS9-1)	TriKinetics; Waltham, MA	PS9-1	ספק כוח עבור DFM ו-PSIU9
Weld-on #4 אקריליק צמנט	ארצות הברית פלסטיק Corp., OH	45737

כל כל פלסטיק רטרט יציאה טורית Rstudio