הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana)

בעלי חיים Gnotobiotic הוכיחו להיות כלים לא יסולא בפז עבור מחקרים מיקרוביום^1,2,3. בעלי חיים נטולי נבטים ומוגדרים אפשרו הבהרת אינטראקציות בין מארח למיקרואורגניזמים, כולל תגובות אימונולוגיות מארחות, התבגרות אפיתל במעיים ומטבוליזם מארח^1,4,5,6,7. בעלי חיים Gnotobiotic מחוסנים עם קהילה פשוטה סייעו גם בהבנה מלאה יותר של אינטראקציות microbe-microbe בקהילה במעיים, במיוחד בפענוח האכלה צולבת ויחסים עוינים^8,9,10,11. מערכת המודלים המועדפת הנוכחית למחקרים במיקרוביום המעיים של היונקים היא מודל המורין. בעוד שמערכת זו הייתה חיונית בתגליות שתוארו לעיל, חסרון מרכזי הוא העלות הכרוכה בכך. ציוד מיוחד וטכנאים מיומנים נחוצים כדי להקים ולתחזק מתקן gnotobiotic. זה, בשילוב עם טיפול נוסף שיש לתת לכל היבט של תחזוקת בעלי חיים gnotobiotic, גורם החיה gnotobiotic לעלות פי עשרה עד עשרים יותר להתרבות מאשר מודל חיה סטנדרטי¹². בשל עלויות גבוהות, חוקרים רבים עשויים להיות מסוגלים להרשות לעצמם מודל מורין gnotobiotic. בנוסף, בעוד מודלים מורין עשוי להיות הבחירה המקובלת ביותר עבור מחקרים המעוניינים לתרגם לבריאות האדם, ישנם עדיין הבדלים פיזיולוגיים ומורפולוגיים רבים בין המעיים האנושי והעכבר¹³. ברור שאין מודל יחיד מספיק כדי לענות על מספר הולך וגדל של שאלות לגבי ההיבטים הרבים של מיקרוביום המעיים.

דגמי חרקים הם חלופה זולה יותר בשל עלות התחזוקה הנמוכה שלהם בהשוואה למינים של יונקים. מחקר נרחב ללא חיידקים וגנוטוביוטיקה במגוון מיני חרקים הוביל להתפתחותם של מודלים נפוצים רבים. יתושים ו Drosophila הם מודלים נפוצים לעבודה ללא חיידקים בשל הרלוונטיות שלהם למחלות גלובליות ומתיחה^{גנטית 14,15}. מערכת מודלים מתפתחת נוספת היא זו של דבורת הדבש (Apis mellifera), בהתחשב בחשיבותה במחקר האבקה וחברתיות¹⁶. עם זאת, רבים של חרקים נפוצים אלה חסרים את המורכבות הטקסונומית לראות בקהילות מעי יונקים¹⁷, הגבלת יכולתם מודל אינטראקציות סדר גבוה יותר. לא רק שהמגוון הכולל של המיקרואורגניזמים המצויים במעיים של ג'וקים אמריקאים דומה יותר ליונקים, אלא שרבים מהמיקרואורגניזמים הנמצאים במעי הג'וק שייכים למשפחות ופילה המצויים בדרך כלל במיקרוביוטה של יונקים ובני אדם¹⁸. ההיסחפות של הג'וק מקבילה גם מבחינה תפקודית למעי הגס של היונקים, שכן הוא תא תסיסה עמוס בחיידקים כדי לסייע בהפקת חומרים מזינים^19,20. לבסוף, האופי הכל-יכול של המקקים מאפשר מגוון של משטרי דיאטה שלא יתאפשרו עם מומחים תזונתיים.

ג'וקים אמריקאים יכולים להיות מערכת מודל שימושית להבנת קהילות מיקרוביאליות במעיים באורגניזמים גבוהים יותר, אך מעמדו של המקק כמזיק גם הופך את המערכת לרלוונטית לבקרת מזיקים²¹. מינוף הידע הבסיסי בהשפעת קהילת המעיים על בריאות הג'וקים והפיזיולוגיה מסייע בפיתוח טכניקות חדשות לניהול מזיקים.

מטרת שיטה זו היא להתוות תיאור מקיף של הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana), אך פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת נימפות של כל ג'וק אוביפר. הוא כולל שיטה לאוסף יעיל ולא פולשני של ביציות בוגרות, וטכניקה לא הרסנית לניטור מצב הגנטוביוטיקה של החרקים^22,23,24. בעוד ששיטות קודמות להשגת ותחזוקה של גנוטוביוטיות מתארות את אוסף אותקה^{23,24,25,26,27}, בגרות אוותקה מתפרשת במונחים של רמזים ספציפיים למינים (בבלטלה גרמניקה^22,24,25), או לא מתואר במפורש^27,28, מה שהופך את היישום קשה עבור אלה שאינםמכירים את המערכת. מאז השיטה המתוארת כאן משתמשת באופן טבעי ירד oothecae, השגיאה של הסרת ביצים בטרם עת נעדר. פרוטוקול זה מכיל הן שיטות תלויות תרבות והן שיטות בלתי תלויות בתרבות של בקרת איכות, והשיטה התלויה בתרבות אינה דורשת הקרבת חרקים. לבסוף, שיטה זו מביאה יחד מידע ממחקרי ג'וקים gnotobiotic מרובים כדי ליצור אחד, פרוטוקול מקיף עם כל המידע הדרוש להשגת ושמירה על גנוטוביוטיקה מקקים.

1. הכנת חומרים

1. תחזוקת תרביות ג'וקים
   הערה: ישנן דרכים רבות לגדל חרקים חזקים אלה. הפרטים על מתן מחסה ומים יכולים להיות שונים בהתאם לחומרים נגישים (כלומר, קרטוני ביצים במקום צינורות קרטון). פרוטוקול העיקור הבא יפעל עבור כל כיוונון מיכל מלאי.
   1. מורחים מספיק מצעים עץ במיכל דגים 37.85 L (10 ליטר) כדי לכסות את החלק התחתון של המיכל עם כ 1 אינץ 'של מצעים. הכן דיור על ידי חיתוך (שטוח) קרטון ל 2 ב x 4 בחתיכות. הכנס חתיכות קרטון לצינורות קרטון (למשל, צינורות נייר טואלט) וצינורות מחסנית בקצה אחד של המיכל (איור 1).
   2. למרוח שכבה דקה של ג'לי נפט על שני סנטימטרים העליונים של החלק הפנימי של המיכל כדי למנוע בריחה חרקים.
      הערה: הקפד לציפוי כראוי את החלק הפנימי של פינות המיכל.
   3. הוסף מקקים על ידי העברת (כבוש) צינורות קרטון ממיכל מלאי הקודם, לנער אותם כדי לשחרר את תושביהם. עבור כל העברה, להעביר 100-200 מעורב גיל, מעורב מין מקקים. מוסיפים מזון לכלבים (20-30 חתיכות), מנטרים את כמות המזון לכלבים במיכל וממלאים מחדש כאשר הם נמוכים.
   4. תארגן צלחת מים.
      1. מלאו מיכל מזון קטן לשימוש חוזר מפלסטיק במים מזוקקים כפולים (ddH₂O). חותכים ספוגים תאית וחורים במכסה של מיכל המזון בערך באותו גודל.
         הערה: הספוגים התאיים מונעים ממקקים לטבוע בצלחת המים.
   5. הכנס ספוגים לתוך חורים במכסה ומניחים את המכסה על המיכל מלא. מניחים את המיכל במיכל וממלאים מחדש כאשר נמוך. מכסים את המיכל במטלית כותנה ומאבטחים אותו במקום עם רצועה אלסטית.
   6. כאשר טנקים מתחילים לצבור כמויות מוגזמות של פגרים ופגרי חרקים, מקים טנקים חדשים ומעבירים ג'וקים.
      הערה: טנקים מועברים בדרך כלל כל 6 חודשים. כל המקקים / הביצים הנותרים במיכלי מלאי שהוצאו משירות מורדמים על ידי הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ותכולת מיכל המלאי מועברת לאחר מכן לשקית אוטוקלאב ו autoclaved (1 שעות, מחזור הכבידה) לפני סילוק. מיכלי מניות מעוקרים עם אקונומיקה של 2% בין שימושים.
2. לחטא מיכל משני.
   הערה: גורם מכיל זה אינו כולל מסנן, אלא מאפשר החלפת אוויר בחינם.
   1. מרססים את החלק הפנימי של המכסה והתחתון עם 2% אקונומיקה ומאפשרים להם להשרות במשך 10 דקות. מחק את האקונומיקה עם מגבת נייר נקייה.
   2. מרססים את החלק הפנימי של המכסה והתחתית עם 70% אתנול ומנגבים יבש עם מגבת נייר נקייה. החלף את המכסה עד לשימוש.
3. הפוך BHI שיפוע ובקבוקים עבור דגירה ביצים נימפות דיור.
   1. הכן BHI על פי הוראות החבילה, הוספת 2% אגר. מרתיחים את פתרון BHI-אגר עד להבהרה.
   2. עבור slants, להעביר 5 aliquots מ"ל כדי 18 מ"מ x 150 מ"מ מבחנות זכוכית וכובע. לעקר באמצעות אוטוקלאב (זמן עיקור = 20 דקות, מחזור נוזלי). מניחים צינורות אוטומטיים בזווית של 45° כדי להתקרר לשייטים. לאחר התגבשות, יש לשמור במקרר עד לשימוש למניעת התייבשות.
   3. עבור בקבוקונים, להעביר 10 aliquots mL של פתרון מבושל BHI-אגר לתוך 250 מ"ל ארלנמייר בקבוקונים כדי לכסות לחלוטין את החלק התחתון של הבקבוק. מכסים את הבקבוק בנייר כסף וחיטוי באמצעות אוטוקלאב (20 דקות, מחזור נוזלי). אפשר צלושי autoclaved להתקרר במקרר עד לשימוש כדי למנוע התייבשות.
      הערה: אין צורך במסנן אוויר עבור התקנה זו. כיסוי הרדיד מספיק כדי לאפשר החלפת גז תוך מניעת זיהום מזרימת אוויר פתוח.
4. לעקר באמצעות אוטוקלאב: צ'או עכברוש autoclavable שבור לתוך חצי גדלים (~ 1/2 חתיכות אינץ ') ב מכוסה רדיד אלומיניום (זמן עיקור = 1 שעות, מחזור הכבידה), ddH₂O בבקבוק כתרים (זמן עיקור = 20 דקות, מחזור נוזלי), ומכריח ב מכוסה רדיד אלומיניום (זמן עיקור = 20 דקות, מחזור הכבידה).
   הערה: אין למלא יתר על הרה את צ'או החולדה. כדורי יתנפחו במובלעת האוטומטית.
5. להקים טנק "מחלקת יולדות".
   הערה: מיכל זה מכיל את אותם חומרים כמו מיכלי המלאי (צינורות קרטון, צלחות מים עם ספוגים, מזון לכלבים, מצעים מעץ; ראו איור 1)וצריך להיות ריק ממקקים אלא אם כן הוא מועבר לאיסוף אותקי (ראו סעיף 2).
6. לחות חממה על ידי הכנת מלאה פתרון נתרן כלורי רווי (NaCl). הכינו פתרון זה על ידי הוספת 37 גרם של NaCl לכל 100 מ"ל של ddH₂O ומערבבים עד להמסה.
   הערה: בדרך כלל, 500 מ"ל של תמיסת מלח רווי בדרך כלל לחות אינקובטור עם מידות תא 51 ס"מ x 46 ס"מ x 46 ס"מ (H x W x D) במשך כחודש לפני מים נוספים יש להוסיף.

2. אוסף של ביציות

1. העבר נקבות (בכל מספר שמתאים לניסויים מתוכננים) הנושאות ביציות(איור 2)ממיכל המלאי ל"מחלקת היולדות" באמצעות מלקחיים להזזת צינורות קרטון המכילים נקבות גראביד.
   1. אם צינור קרטון מכיל חרקים מרובים בנוסף לנקבה הכבידה, תחילה לנער את הצינור לתוך מיכל פלסטיק נוסף מוקף ג'לי נפט, ולאחר מכן לעודד את חרק היעד לטפס בחזרה לתוך צינור הקרטון לבד.
2. העבר נקבות בחזרה למיכל המניות ברגע שהם ירדו oothecae שלהם. לאחזר את oothecae מהפסולת במיכל עם מלקחיים.
   הערה: Oothecae הם ירדו לעתים קרובות בתוך 24 שעות של הנקבה מועברת.

3. ניקוי של oothecae

1. הוסף oothecae לצינור צנטריפוגה 5 מ"ל המכיל 3 מ"ל של נתרן דודקיל סולפט (SDS). וורטקס במשך 10 שניות. יש לחזור על הפעולה לשלב שטיפה שני עם צינור צנטריפוגה המכיל SDS טרי.
   הערה: ניתן להשתמש ב-100 מ"ל לכל 3 מ"ל של SDS.
2. באמצעות ניגוב משימה עדין, לשפשף בעדינות את פני השטח של כל ootheca כדי להסיר את כל פסולת. ניתן להוסיף SDS נוסף כדי לסייע בניקוי יסודי. מניחים oothecae ניקה בסירת שקילה עד מוכן עיקור.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, אך השארת ה-oothecae בסביבות לחות נמוכה לפרקי זמן ממושכים (ימים עד שבועות) תגרום להם להתייבש ולאבד את הכדאיות.

4. עיקור והדגירה של oothecae

1. מים סטריליים של אלקוט לשטיפת לאחר הסטריליזציה. עבור כל ootheca להיות מעוקר, למלא שני צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של מים סטריליים.
2. הוסף 10 μL של מרוכז (32%) פתרון מלאי חומצה peracetic ל 3.2 מ"ל של ddH₂O בצינור צנטריפוגה 5 מ"ל כדי ליצור פתרון 0.1% עבור עיקור. כובע והפך מספר פעמים כדי לערבב.
   התראה: חומצה פרמקטית מזיקה במגע עם העור או הריאות. לדלל בברדס אדים.
   הערה: יש לעשות זאת באותו יום של עיקור. אם מדולל מראש, הפתרון יתפרק במהירות ולכן לא לעקר כראוי. עד חמישה oothecae ניקה עשוי להיות מעוקר ב 3.2 מ"ל של חומצה מדוללת.
3. מניחים (עד חמישה) oothecae ניקה בתמיסת חומצה peracetic 0.1% במשך 5 דקות. הפוך את הצינור מספר פעמים כל 60 שניות.
4. במכסה המנוע של זרימה למינארית, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר כל אותקה לצינור צנטריפוגה משלו עם מי שטיפה סטריליים (שלב 4.1). הפוך מספר פעמים לערבב. חזור על שטיפה שנייה, ולאחר מכן להעביר כל ootheca שטף לשיפיון BHI משלו באמצעות מלקחיים סטריליים.
5. מניחים לנטים במיכל המשני החיטוי. מעבירים את המיכל לאינקובטור הלח ב-30 מעלות צלזיוס למשך 4-5 שבועות עד לבקוע.
   הערה: Slants עשוי להיות מוחזק זקוף על ידי מתלה מבחנה קטן או מצע בינוני / קטן.
6. יש לבדוק את ההסתבלויות באופן קבוע (1-2x בשבוע). אם צמיחת מושבה פטרייתית או חיידקית מופיעה על האגר, הסר את הנטייה המזוהמת. כאשר נקודת הזמן של ארבעה שבועות מתקרבת, לבדוק slants כל יום.
   הערה: לאחר הבקיעה, נימפות יכול לשרוד עד כמה שבועות על BHI לבד אבל לא יגדל בצורה אופטימלית.

5. תחזוקת נימפות גנוטוביות

1. במכסה המנוע של זרימה למינארית, מעבירים בצורה לא מתאימה גלולה של צ'או עכברוש מעוקר לבקבוק BHI מוכן (משלב 1.3.3) עם מלקחיים סטריליים. כבדיקת עקרות, מניחים את הבקבוק במיכל המשני באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ואינם משתמשים אם מופיעה צמיחה.
2. מוסיפים נימפות לבקבוק BHI עם גלולת מזון סטרילית. לנער אותם מתוך שיפוע BHI שלהם ולתת להם ליפול לתוך הבקבוק במכסה המנוע זרימה למינארי.
   הערה: הנימפות אין מתיחה על קירות הזכוכית של המבחנה. טלטול הצינור כדי להפיל אותם מהשפה ולאחר מכן להטות את הצינור כדי לאפשר להם להחליק במורד הזכוכית לתוך הבקבוק יעיל. בעוד נימפות ניתן להעביר באמצעות מלקחיים, הסיכון לפציעה קטלנית הוא גבוה.
3. נימפות מים עם 300 μL של מים סטריליים פעם בשבוע במכסה המנוע זרימה למינארי על ידי pipetting ישירות על הרצפה BHI של הבקבוק.
4. כמו צואת נימפה מתחילים לכסות את הרצפה BHI, להעביר בקבוק BHI חדש, הוספת צ'או עכברוש מעוקר 24 שעות מראש (כדי לאמת עקרות) כמו בשלב 5.1.

6. בקרת איכות של סטריליות

1. הסר נימפה אחת מבקבוק BHI כדי להקריב לבדיקת בקרת איכות שאינה תלויה בתרבות של מצב gnotobiotic באמצעות הגבלת פולימורפיזם באורך שבר (RFLP). כדי לעשות זאת, יוצקים את הנימפה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי (בדומה להעברה נימפלית משלב 5.1) או מניחים אפליקטור עץ סטרילי לתוך הבקבוק ומחכים לנימפה כדי להתחיל לטפס עליו, ואז להעביר אותו לצינור הצנטריפוגה.
2. מוסיפים 0.5 מ"ל של מלוחים 1x פוספט אגירה (PBS) לנימפה בצינור צנטריפוגה הומוגנית עם micropestle סטרילי עד שכל החלקים הגדולים מתפרקים. וורטקס היטב.
3. לחלץ DNA מנימפה הומוגנט באמצעות ערכת מיצוי DNA חיידקי (שולחן החומרים) כדלקמן.
   1. צנטריפוגה נימפה הומוגנית במשך 10 דקות ב 5,000 x g ולהסיר את supernatant. מחממים שייקר תרמי ל 37 מעלות צלזיוס.
   2. הוסף 100 μL של 1x Tris-EDTA, ומערבולת כדי resuspend לחלוטין את גלולה. מוסיפים 10 μL של lysozyme ומערבבים, ואחריו 30 דקות (ללא טלטול) דגירה בשייקר תרמי שחומם מראש 37 מעלות צלזיוס.
   3. מוסיפים 25 מ"ג חרוזי זכוכית לדגימות, ומערבולת במהירות מרבית במשך 5 דקות. מחממים מראש את השייקר התרמי ל 55 מעלות צלזיוס.
   4. אפשר את החרוזים להתיישב לפני העברת supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל עם 100 μL של חלבון K חוצץ ו 20 μL של פרוטאינאז K. וורטקס לערבב ביסודיות.
   5. דגירה, עם טלטול ב 600 סל"ד, בשייקר תרמי 55 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 2 דקות, ולהעביר supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. מחממים מראש את השייקר התרמי ל 65 מעלות צלזיוס. התחל חימום מראש של חיץ האלוציה בתנור הכלאה של 65 מעלות צלזיוס.
   6. הוסף 220 μL של 100% אתנול. וורטקס במהירות מקסימלית למשך 20 שניות. לשבור כל משקעים גלויים על ידי pipetting למעלה ולמטה 10x.
   7. הכנס עמודת DNA לצינור איסוף של 2 מ"ל והעבר את הדגימה לעמודה, כולל כל משקע שייתכן שנוצר. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה, להשליך סינון מצינור האיסוף, ולהחליף את צינור האיסוף.
   8. הוסף 500 μL של מאגר איגוד לעמודה, וצנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה אחת. השלך סינון מצינור האיסוף והחלף את צינור האיסוף.
   9. הוסף 700 μL של מאגר לשטוף DNA לעמודה, וצנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה אחת. השלך סינון מצינור האיסוף והחלף את צינור האיסוף. יש לחזור על הפעולה לשלב שטיפה שני.
   10. צנטריפוגה עמוד ריק במשך 2 דקות כדי לייבש אותו, העברת העמודה לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל לאחר מכן. הוסף 50 μL של מאגר התרוממות רוח שחומם מראש ישירות למטריצת עמודת ה- DNA, והדגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 5 דקות.
   11. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה כדי elute. לכמת את ה-DNA שחולצו בסינון באמצעות ספקטרופוטומיה או פלואורומטריה.
4. להגביר ולעכל גן 16S שלם. דמיינו שברים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
   1. השתמש 12.5 μL של 2x תערובת הורים, 0.5 μL של כל פריימר 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) ו 27F (5'-AGAGTTTGATCCTCTCTCAG), 5 ng של DNA, ומים ברמה מולקולרית עבור נפח תגובה כולל של 25 μL.
   2. הפעל את תוכנית התרמוציקלר הבאה: 94 °C (60 שניות); ואחריו 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס עבור 30 s, 50 °C (65 °F) עבור 45 s, 68 °C (68 °F) עבור 90 s; ואחריו 68 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
   3. לטהר את התגובה שרשרת פולימראז (PCR) המוצר באמצעות ערכת טיהור DNA(טבלה של חומרים).
      1. הוסף 120 μL של מאגר טיהור למוצר PCR ומערבולת לערבב. בקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף טיפות בתוך המכסה. הכנס עמודת DNA לתוך צינור איסוף 2 מ"ל, להעביר נוזל לעמודה מוכנה צנטריפוגה ב ≥ 13,000 x g במשך דקה אחת.
      2. השלך את הסינון והחלף את צינור האיסוף. הוסף 700 μL של מאגר שטיפת DNA וצנטריפוגה ב ≥13,000 x g במשך דקה. השלך את הסינון והחלף את צינור האיסוף. יש לחזור על הפעולה לשלב שטיפה שני.
      3. צנטריפוגה העמוד הריק במשך 2 דקות לייבוש והעברת העמוד לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. מוסיפים 50 μL של חיץ התרוממות רוח שחומם מראש ישירות למטריצת עמוד הדנ"א, ומדגרים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
      4. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה כדי elute. לכמת את ה-DNA שחולצו בסינון באמצעות ספקטרופוטומטריה או פלואורומטריה.
   4. הוסף 1 מיקרוגרם של מוצר PCR מטוהר ל 5 μL של מאגר עיכול, 10 יחידות RsaI, ומים ברמה מולקולרית עבור נפח התגובה הכולל של 50 μL. לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה דגירה ב 37 °C (60 °F) במשך 60 דקות.
   5. הפרד את המוצר מתעכל באמצעות אלקטרופורזה ג'ל על ידי הפעלת 20 μL של DNA מתעכל על 2% ג'ל agarose. דמיינו את הג'ל כדי לאשר מצב גנוטוביוטי.
      הערה: חרקים Gnotobiotic צריך רק לגרום להקות ב 402 bp, 201 bp, ומריחה מ 163 כדי 148 bp, בהתבסס על רצף 16S rDNA של אנדוסימביונט, Blattabacterium. כל להקות נוספות שנראות בג'ל מעידות על מינים מיקרוביאליים מזהמים.

7. מעקב אספטי של צמיחת נימפה

1. רשום את אורך הגוף כדי לעקוב אחר צמיחת נימפה על ידי מדידת החרקים דרך רצפת BHI שקוף של הבקבוק.
   הערה: נימפות עשויות להיות ממוקמות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להאט את התנועה שלהם, ובכך להקל על מדידתם.

מיכלי מניות הוקמו כמתואר באיור 1. נקבות "בהריון" מזוהות על ידי הootheca המחוברות לבטן האחורית, כפי שמצולמו באיור 2. דגירה של oothecae על אגר BHI מאפשר בקרת איכות gnotobiotic בצורה לא הרסנית. במקרים מסוימים, הסטריליזציה אינה מצליחה, והצמיחה מופיעה סביב ה-oothecae כמו באיור 3B. oothecae אלה יש להסיר ולהשליך. בידינו נצפה שיעור כשל ממוצע של 10% לחיטוי (n = 51). oothecae בוקע בממוצע 34 ימים לאחר עיקור ללא צמיחה על המדיום, כפי שניתן לראות באיור 3A. ראינו שיעורי צוהר טיפוסיים של 41% (n = 46) עבור oothecae מעוקר, לא מזוהם, עם ממוצע של 11 נימפות לכל ootheca. נימפות גדולות יותר מועברות לבקבוקי BHI המכוסים בנייר כסף, כמו באיור 4. הרדיד מונע זיהום, ולנימפות יש מקום לגדול. RFLP של rDNA 16S מנימפה הומוגנית משמש לאישור מצב gnotobiotic. נימפות גנוטוביוטיות נצפו גדלות בקצב איטי יותר מעמיתיהן הלא סטריליים, כפי שמייצג איור 5. איור 6 מציג תוצאות מחרקים גנוטוביוטיים בהצלחה וכן מנימפות סטנדרטיות (לא סטריליות).

בעוד בדיקה זו עדיין לא זיהתה זיהום בהיעדר תוצאה תרבותית חיובית, צעד זה בוצע באופן שגרתי במהלך ניסויים קריטיים כדי לשלול את נוכחותם של מיקרואורגניזמים רגישים לחמצן או קיבה. צמיחה איטית יותר נצפתה במקקים gnotobiotic בהשוואה חרקים רגילים / לא סטריליים.

איור 1: הגדרת תרבות מלאי ג'וקים.
ניתן לראות צינורות קרטון מוערמים בקצה הרחוק של המיכל. מזון ומים נמצאים שניהם ליד חזית המיכל. כיסוי בד כותנה ותפס אלסטי הוסרו לנראות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ג'וק אמריקאי "בהריון".
החץ מציין את ה"אותקה". לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונות של נימפות גנוטוביוטיות בהצלחה בקעו ועוקרו ללא הצלחה oothecae על שיפונות BHI.
Oothecae היו מעוקרים ודגר כמתואר בפרוטוקול זה. (A)חוסר הצמיחה המיקרוביאלית בשיפיון BHI מצביע על כך שה חרקים נקיים מאורגניזמים זעירים. (B)Oothecae על שבלונים שתוצאתם היווצרות המושבה צריך להיות מושלך כמו מזוהם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מנגנון גידול גנוטוביוטי.
חרקים נשמרים בבקבוקים סטריליים מכוסים במכסה נייר כסף כדי למנוע זיהום. המיכל המשני (מכסה ירוק) מעוקר עם 2% אקונומיקה ואחריו 70% אתנול. זרימת האוויר אינה מוגבלת במיכל המשני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: נתוני קצב צמיחה מייצגים המשווים אורך גוף של נימפות גנוטיוטיות ולא סטריליות. שתי קבוצות החרקים קיבלו תזונה של מכרסמים אוטוקלאבים. חרקים Gnotobiotic (כאן: n = 105) נשמרים על BHI כמתואר. חרקים לא סטריליים (כאן: n = 50) חיים בבקבוקים עם מצעי עץ אוטומטיים עם מנות קטנות למים. נימפות לא סטריליות גדלות בקצב ממוצע של 0.059 מ"מ ליום, בעוד נימפות gnotobiotic לגדול ב 0.028 מ"מ ליום (p < 0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תמונת ג'ל מייצגת של תוצאות RFLP לבקרת איכות.
אמפליונים שלמים של גנים 16S התעכלו עם RsaI. DNA עבור PCR חולץ נימפות הומוגני ב 1x PBS. נתיבי "G נימפה" תואמים לנימפות גנוטוביות, בעוד נתיבי "conv nymph" תואמים לעמיתיהם הקונבנציונליים והלא סטריליים. בהתבסס על תקציר הגבלה וירטואלית, אנדוסימביונט (Blattabacterium) צפוי להיות להקות בגדלים 402 bp, 206 bp, ו 163 bp, עם מריחה של להקות בין 163 bp ו 148 bp. חרק גנוטוביוטי אמור להראות רק את תבנית הפסים של בלטבקטריום. קהילת חיידקים מעורבת צפויה להיות מריחה של להקות בגדלים שונים, שכותרתו כאן "שברי 16S חיידקיים אחרים". לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.