הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

Summary

ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.

Abstract

חומרי הרדמה משפיעים על התודעה בין השאר באמצעות פעולותיהם על מעגלים תלמוקורטיים. עם זאת, המידה שבה חומרי הרדמה נדיפים משפיעים על רכיבים סלולריים ורשתיים שונים של מעגלים אלה עדיין אינה ברורה. פרוסות מוח Ex vivo מספקות אמצעי שבאמצעותו חוקרים יכולים לחקור רכיבים בדידים של רשתות מורכבות ולנטרל מנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות. כדי לבודד השפעות פוטנציאליות של תרופות ספציפיות לסוג התאים ולמסלולם בפרוסות מוח, חוקרים חייבים להיות מסוגלים להפעיל באופן עצמאי מסלולי סיבים אפרינטיים, לזהות אוכלוסיות תאים שאינן חופפות ולהחיל חומרי הרדמה נדיפים על הרקמה בתמיסה מימית. בפרוטוקול זה מתוארות שיטות למדידת תגובות אופטוגניות המעוררות לשני מסלולים אפירניים בלתי תלויים לניאוקורטקס בפרוסות המוח ex vivo. תגובות חוץ-תאיות נרשמות כדי לבחון את פעילות הרשת, והקלטות ממוקדות של מהדקי טלאים של תאים שלמים מתבצעות באינטרנורונים חיוביים לסומטוסטטין ופרוולבומין. מתוארת אספקה של ריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של איזופלוראן דרך נוזל השדרה המוחי המלאכותי כדי לווסת את תגובות התאים והרשת.

Introduction

חומרי הרדמה נדיפים נמצאים בשימוש בכל מקום במגוון מסגרות קליניות ואקדמיות במשך יותר ממאה שנה. לסוגים שונים של חומרי הרדמה יש מטרות מולקולריות ייחודיות, לעתים קרובות לא חופפות ^1,2,3, אך כמעט כולן מייצרות חוסר הכרה. בעוד שההשפעות ההתנהגותיות שלהם צפויות למדי, המנגנונים שבאמצעותם חומרי הרדמה גורמים לאובדן הכרה אינם ידועים במידה רבה. הרדמה עשויה בסופו של דבר להשפיע הן על רמת התודעה והן על תכניה באמצעות פעולות על מעגלים קורטיקותלמיים, ולשבש את שילוב המידע לאורך ההיררכיה הקורטיקלית 4,5,6,7,8,9^. באופן רחב יותר, אפנון של מעגלים קורטיקותלמיים עשוי למלא תפקיד בניסוי 10 או^{פרמקולוגית 11} מצבי תודעה משתנים, ועשוי להיות מעורב גם בשינה 12 ובהפרעות פתופיזיולוגיות של תודעה^13,14.

את החמקמקות של המנגנונים העומדים בבסיס אובדן והחזרת ההכרה במהלך ההרדמה ניתן לייחס באופן חלקי לפעולות לא ליניאריות וסינרגטיות של חומרי הרדמה ברמה התאית, הרשת והמערכות¹⁵. איזופלוראן, למשל, מדכא פעילות באזורי המוח שנבחרו 16,17,18, פוגע בקישוריות בין אזורי מוח מרוחקים ^{19,20,21,22,23}, ומפחית תגובות סינפטיות באופן ספציפי למסלול ^24,25 . עדיין לא ברור אילו השפעות של חומרי הרדמה, מהרמה המולקולרית ועד לרמה המערכתית, הכרחיות או מספיקות כדי לגרום לאובדן הכרה. בנוסף למחקרים קליניים מהותיים של התודעה תוך שימוש בטכניקות לא פולשניות 19,20,26^, חשוב שהנסיינים יבקשו לנטרל את האינטראקציות התאיות והרשתיות המובחנות המשרתות את החוויה המודעת.

על ידי פישוט האינטראקציות המורכבות שנמצאות במוח השלם, פרוסות המוח ex vivo מאפשרות לחקור מרכיבים מבודדים של המערכות הדינמיות של המוח⁹. הכנת פרוסה מופחתת משלבת את היתרונות של מבנים אנטומיים שלמים יחסית של מעגלים עצביים מקומיים עם הרבגוניות של מניפולציות במבחנה. עם זאת, עד לאחרונה, אילוצים מתודולוגיים מנעו את חקר התכונות הסינפטיות והמעגלים של קלטים ארוכי טווח בפרוסות מוח^27,28; הנתיב המפותל של דרכי סיבים קורטיקותלמיים הפך את ההפעלה של מסלולים אפירניים עצמאיים לבלתי אפשרית על ידי גירוי חשמלי.

חקירת ההשפעות של חומרי הרדמה על תכשירי פרוסות המוח מציבה אתגרים נוספים. בהיעדר מערכת נשימה ומחזור דם תקינה, יש למרוח חומרי הרדמה באמבטיה, ולהתאים את הריכוזים בקפידה לריכוזי ההשפעה המשוערים באתר. עבור חומרי הרדמה תוך ורידיים רבים, קצב שיווי המשקל האיטי ברקמה הופך את החקירות הפרמקולוגיות המסורתיות למייגעות^{של 29,30.} חקירת ההשפעות של הרדמת גזים נדיפים בתכשירי ex vivo היא נוחה יותר, אך גם מציבה אתגרים. אלה כוללים המרת מינוני לחץ חלקי בשאיפה לריכוזים מימיים, ואת הצורך במערכת אספקה שונה של התרופה לרקמה באמצעות נוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי³¹.

כאן מתוארות שיטות שבאמצעותן חוקרים יכולים לנצל את התכונות הפיסיקוכימיות המתועדות היטב של איזופלורן ההרדמה הנדיף להעברת תרופות לפרוסות מוח ex vivo, להפעיל קלטים ספציפיים למסלול ולשכבה לאזור עניין בקליפת המוח עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, ולבצע הקלטות למינריות בו-זמניות והקלטות מהדקי טלאים ממוקדות מאוכלוסיות נבחרות של נוירונים. יחד, נהלים אלה מאפשרים לחוקרים למדוד שינויים הנגרמים על ידי הרדמה נדיפה במספר תכונות תגובה אלקטרופיזיולוגיות נצפות, מרמת הסינפטית ועד לרמת הרשת המקומית.

Protocol

כל ההליכים המערבים בעלי חיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון והוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים לבריאות הציבור.

1. גידול עכברים לביטוי חלבון מדווח פלואורסצנטי בתת-אוכלוסיות בין-כוכביות

1. זוג עכבר זכר הומוזיוגי, תלוי CreTomato עם נקבה הומוזיגוטית SOM-Cre או עכבר נקבה PV-Cre הומוזיגוטי.
   הערה: אוכלוסיות נוירונים ספציפיות אחרות עשויות להיות ממוקדות על ידי שימוש בקווי Cre המתאימים.
2. אפשרו לצאצאים הטרוזיגוטיים להבשיל עד גיל 3 שבועות לפחות לפני שתמשיכו. עבור ניסויים המתוארים כאן, גנוטיפ אינו הכרחי, שכן הורים הומוזיגוטיים מייצרים צאצאים שכולם הטרוזיגוטיים הן עבור רקומבינאז Cre ספציפי לסוג התא והן עבור אללים מדווחים תלויי Cre.

2. ביצוע הזרקה סטריאוטקסית חד צדדית של מבנה ויראלי

1. התאם את ההגדרות של מושך המיקרופיפטה לפיפטות הזרקה כפי שמצוין במדריך למשתמש של המכשיר (ראה טבלה 1 להגדרות המומלצות). משוך את הזכוכית micropipette.
2. לשבור את הקצה החד של פיפטה כך קוטר הקצה הוא כ 30 μm עם התחדדות מינימלית על פני כמה מילימטרים.
3. באמצעות נהלים שתועדו בעבר, להחליט על titer המתאים ואת נפח הנגיף להיות מוזרק. בניסויים המתוארים כאן, 1.0 μL (טיטר: 3.1-5.7 TU/mL) שהוזרק באופן חד צדדי הניב תוצאות טובות.
4. למלא בחזרה את מלוא נפח הפיפטה בשמן מינרלי. העמיסו את הפיפטה על המיקרו-מזרק והזרימו כמות קטנה של שמן מינרלי דרך הקצה כדי לוודא שהקצה אינו סתום.
5. מילוי קדמי של לפחות 1.0 μL של מבנה ויראלי. הווקטור הנגיפי הרקומביננטי הקשור לאדנו ששימש בניסויים אלה היה AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. סדרו וילונות סטריליים באזור ניתוח. לעקר כלים עבור הליך סטריאוטקסי ולהניח אותו על הווילון.
7. הרדמת SOM-tdTomato או PV-tdTomato heterozygous animal באמצעות איזופלורן (3% להשראה, 1.5-2% לתחזוקה) ותערובת חמצן. מעת לעת לאשר רמה כירורגית של הרדמה עם צביטה הבוהן לאורך כל הניתוח. ודא שבעל החיים אינו חורג מהתוכנית הכירורגית של הרדמה על ידי ניטור הנשימות כל 10-15 דקות.
8. לגלח את החלק העליון של ראש החיה. יש למרוח 70% אלכוהול איזופרופיל ותמיסה על בסיס יוד בנדיבות על אזור הניתוח ומשחת עיניים על ארובות העיניים כדי למנוע ייבוש של הממברנה. יש לתת בופיווקאין/לידוקאין (יחס של 1:1, 1.0 מ"ג/ק"ג) באופן תת עורי לאתר הניתוח לצורך הרדמה מקומית.
9. התאימו את החיה למסגרת סטריאוטקסית.
10. השתמש באזמל כדי לבצע חתך לאורך ציר sagittal של העור מעל פני השטח הגביים של הגולגולת. יש לסגת מהעור באמצעות מלקחיים. לחות את הגולגולת עם 0.9% מלוחים לפי הצורך.
11. על פני השטח של הגולגולת, לסמן קלות את הצומת של קואורדינטות קדמיות לרוחב עם צלב בעיפרון. קדחו חור בקואורדינטות המתאימות במישור הרוחבי (במ"מ יחסית לברגמה, להזרקת פיתול החגורה (Cg): קדמי 0.2, לרוחב 0.3; להזרקת תלמוס אחורית (Po): אחורית 2.25, לרוחב 3.4).
    הערה: הסימונים צריכים להתרחב מעבר לגבולות חור הבור כדי לספק הנחיות למיקום מדויק של פיפטה.
12. הפעל ואזן את שולחן האוויר.
13. מקם מחדש את מניפולטור האלקטרודות של המסגרת הסטריאוטקסית ב-0° להזרקות לתוך Cg, או 45° במישור הכתר להזרקות לתוך Po.
14. חבר את משאבת המזרק למניפולטור האלקטרודה. חבר את בקר משאבת המיקרו-מזרק למשאבת המזרק.
15. נווט בקצה הפיפטה ליד (אך לא נוגע) בפני השטח של המוח, בצומת הסימונים שנוצרו בשלב 2.11. מקדמים את הפיפטה במהירות של כ-1 מ"מ/שנייה לאורך ציר האורך שלה לתוך המוח ב-0.9 מ"מ (הזרקה ב-Cg) או ב-3.1 מ"מ (הזרקה ב-Po). המתן 10 דקות לפני שתמשיך.
16. להזריק 1.0 μL של מבנה ויראלי במשך תקופה של 10 דקות (100 nL/min). אם נצפתה התפרצות של הנגיף מאתר החדרת פיפטה, האטו את קצב ההזרקה ל-50 nL/min.
17. לאחר ההזרקה, המתן 10 דקות לפני שתסיג באיטיות את פיפטה ההזרקה.
18. תפר לסגירת החתך בקרקפת ומתן 2-5 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם תת עורית.
19. יש להפסיק את השימוש באיזופלוראן ולנטר את פעילות בעלי החיים במהלך היציאה מההרדמה. אפשר להתאושש בהתאם להליכים המתוארים על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המוסד, כולל מתן נוסף של משככי כאבים.

3. הכנת פרוסות מוח חריפות

1. אפשר לפחות 3 שבועות לביטוי של מבנה ויראלי לפני קצירת רקמות.
2. הכן 1 ליטר של נוזל שדרה מוחי מלאכותי להליך חיתוך (חיתוך נוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי, sACSF). ראה טבלה 2 למרכיבים.
3. לאורך כל הליך החיתוך, ספק ל- sACSF תערובת מומסת של 95% O 2/5% CO₂, המועברת באמצעות צינור פיזור גז.
4. הכינו אמבט קר כקרח למיקרוטום להב רוטט. הרכיבו את שלב הדגימה הקר כקרח על מיקרוטום וקבעו את להב הספיר במקומו לחיתוך רקמות.
5. הרדימו עכבר עם 3% איזופלוראן וחמצן עד לאובדן רפלקס התיקון.
6. ערפו את העכבר באמצעות גיליוטינה ומיד טבלו את הראש ב-4°C sACSF. כדי לשמור על בריאות הרקמה, השלם את השלבים הבאים במהירות האפשרית.
7. פתח את חלל הגולגולת על ידי ביצוע חתך קטן בבסיס הגולגולת והסרה עדינה של כל צלחת גולגולת. יש להסיר בעדינות את הדורה מאטר שמתחת.
8. בזמן שהמוח עדיין נמצא בחלל הגולגולת, השתמש בסכין הגילוח כדי להסיר את המוח הקטן. בצע חתך אנכי שני לאורך המישור הסגיטלי בחצי הכדור השמאלי, רק לרוחב לקו האמצע.
9. הכן בלוק רקמות לחתך.
   1. הרימו בעדינות את המוח מחלל הגולגולת. הניחו את המוח על נייר הסינון כשהמישור השטוח והסגיטלי כלפי מטה. הנחו את נייר הסינון מעל תבנית החסימה והתאימו את המוח לקווי המתאר של התבנית שמתחתיה (איור משלים 1).
   2. בצע שני חיתוכים מקבילים במישור הכתר כפי שמצוין על ידי הקווים בתבנית. הוסיפו טיפה קטנה של sACSF כדי לשמור על נייר סינון רטוב, במידת הצורך.
   3. הניחו את גוש הרקמה ב-sACSF בטמפרטורה של 4°C לזמן קצר בזמן ביצוע שלב 3.8.4.
   4. יש למרוח כמות קטנה של דבק-על על שלב הדגימה הקרה כקרח.
   5. הרם את בלוק הרקמה מ- sACSF קר. השתמשו בפינה של מגבת סופגת כדי לנבול עודפי sACSF. הדביקו את המישור הקורונלי האחורי של בלוק הרקמה לשלב הדגימה, כאשר המשטח הגבי של המוח פונה ללהב הספיר.
10. אספו פרוסות מוח קורונליות בעובי 500 מיקרומטר. הניחו פרוסות מעניינות על רשת ניילון (איור משלים 2) ב-34°C sACSF ואפשרו למיכל להגיע לטמפרטורת החדר.
    הערה: עבור ניסויים שתוארו כאן, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות נאספו מחתך קורונלי שמרכזו בערך 2.25 מ"מ אחורי לברגמה כדי לחקור אזור חושי לא ראשוני, קליפת המוח הראייתית המשנית המדיאלית (V2MM).

4. הכנת שקיות ניסיוניות של נוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי (eACSF) המכילות איזופלורן בהרדמה נדיפה מומסת

1. הכן 300 מ"ל של תערובת מלאי של 3.0% isoflurane.
   1. בשקית גז polytetrafluoroethylene אטומה, להוסיף ~ 100 מ"ל של 95% O 2/5% CO_{2 תערובת גז ל} 20-30 מ"ל של isoflurane נוזלי כמות קטנה של 0.9% מלח. יש להמתין לפחות 30 דקות כדי לאפשר שיווי משקל של איזופלוראן בין פאזות נוזל וגז.
   2. קבע את כמות הגז האיזופלורן הרווי, V_sat, כדי להוסיף לשקית המניות באמצעות המשוואה הבאה:
      
      כאשר P%_stock הוא הרכב היעד של גז המניות (3% במקרה זה),_מלאי V הוא הנפח הסופי של שקית הגז של המניה, P איזופלוראן הוא הלחץ החלקי של_{איזופלוראן} בטמפרטורת החדר (~ 240 מ"מ כספית), ו_{- P סה"כ} הוא הלחץ האטמוספרי (~ 760 מ"מ כספית).
   3. הוסף את הכמות המחושבת של גז רווי לשקית גז ריקה ומלא את השקית בנפח של 95% O 2/5% CO_{2 תערובת גז כדי} להביא את הנפח הכולל של שקית המלאי ל -300 מ"ל.
2. הכן 2 ליטר של נוזל שדרה מוחי מלאכותי לזילוף הפרוסה במהלך הניסוי (ACSF ניסיוני, eACSF). ראה טבלה 2 למרכיבים. ממיסים 95% O 2/5% CO_{2 תערובת גזים} לתמיסה.
3. הכינו שתי שקיות נפרדות של תמיסות בקרה ואיזופלורן.
   1. לשקית גז פוליטטרפלואורואתילן ריקה, הוסף 600 מ"ל eACSF ו 600 מ"ל של 95% O 2/5% CO_{2 תערובת גז.} תייג תיק זה כ'שליטה'.
   2. לשקית גז פוליטטרפלואורואתילן ריקה אחרת, הוסף 300 מ"ל של eACSF. תייג שקית זו כאיזופלורן.
   3. בחר ריכוז פאזת גז שיווי משקל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של איזופלורן. הניסויים נערכו באמצעות ריכוזי גזים השווים ל-1.3% איזופלורן. עכברים מאבדים את רפלקס הימין, וככל הנראה את ההכרה, ב-0.9% איזופלורן בשאיפה.
   4. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את ריכוז פאזת הגז המקביל בטמפרטורת החדר, P%(_{T room})³¹:
      
      כאשר P%(_גוף T) הוא ריכוז פאזת הגז הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית שנבחר בשלב 4.3.3,_חדר T הוא 25 מעלות צלזיוס,_וגוף T הוא 37 מעלות צלזיוס.
   5. השתמש במשוואה הבאה כדי לקבוע את נפח הגז משקית גז מלאי,_מלאי V, כדי להוסיף לתמיסת איזופלורן.
      
      כאשר_תמיסת V היא נפח ה-eACSF בשקית ISOFLURANE (300 מ"ל), P%(_חדר T) מוזן ממשוואה (2), λ הוא מקדם החלוקה של אוסטוולד מלוח/גז של איזופלורן (λ = 1.2³²), _ו-P %stock הוא ריכוז שלב הגז של שקית הגז במלאי (P%_stock = 3.0%).
   6. לשקית התמיסה Isoflurane, הוסף את נפח הגז_משקית הגז של המלאי, מלאי V, המחושב בשלב 4.3.5.
   7. לשקית התמיסה של איזופלורן, הוסף נפח של 95% O 2/5% תערובת גז CO₂ כדי להביא את נפח הגז הכולל בשקית התמיסה של איזופלוראן ל -300 מ"ל.
4. יש לנער את שקיות קונטרול ואיזופלוראן על השייקר למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר שיווי משקל פאזה של איזופלורן.
5. לאחר איסוף כל הנתונים, ניתן לאמת את הריכוז הנכון על ידי שימוש במוניטור גז הרדמה כדי למדוד ריכוז גז שווה של איזופלוראן מעל התמיסה הנותרת בשקית.
6. דווח על ריכוזים ניסיוניים של גזים נדיפים ביחידות מימיות, שכן ריכוזי מילימולרים חזקים יותר לשינויים בטמפרטורה. השתמש במשוואה הבאה כדי להמיר את ריכוז פאזת הגז בטמפרטורת החדר, P%(_חדר T), לריכוז מימי שווה ערך (C_מימי, ב-mM)³¹:
   
   כאשר α הוא מקדם החלוקה של בונזן מלוח/גז עבור איזופלוראן ב-25°C³².

5. הכנת חומרה ותוכנה להקלטות רב ערוציות

1. הגדר מערכת איסוף נתונים של 16 ערוצים בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: ניתן להשתמש במספר מגברים ומערכות איסוף נתונים הזמינים מסחרית כדי לאסוף הקלטות רב-ערוציות. בניסויים המתוארים כאן, אותות אנלוגיים מועברים באמצעות לוח ייחוס אלקטרודות לשני מגברים, שם הם מוגברים (2000x) ומסוננים (0.1-10kHz). כניסות אנלוגיות למערכת רכישת הנתונים עוברות דיגיטציה במהירות של 40 קילו-הרץ.
2. הדקו את מתאם 16 הערוצים המתאים למיקרומניפולטור מיקרוסקופ. כוון את המתאם כך שיציאות המחבר הנשי פונות כלפי מטה.
3. התאם את זווית הפעולה של מיקרומניפולטור זה כך שהוא מכוון כלפי מטה לכיוון תא ההקלטה, בזווית של כ-70° ביחס לאופקית.
4. חבר את כניסת headstage לבדיקה בגודל 16 x 1 עבור אלקטרופיזיולוגיה חוץ גופית באמצעות מתאם headstage המעוגן למיקרומניפולטור.
5. חבר את מחבר יציאת headstage למערכת איסוף הנתונים.
6. התקן תוכנה מתאימה לרכישת נתונים. הגדר 15 ערוצי קלט כך שיתאימו לאותות קלט מ-15 אנשי הקשר הראשונים של הבדיקה הרב-ערוצית. הגדר את הערוץ הנותר לקבלת קלט מהאלקטרודה התוך-תאית.
   הערה: הקפד לשקול מפות אלקטרודות ומתאם בעת איסוף וניתוח נתונים, כדי לוודא שהאות המתאים תואם למגע האלקטרודה שממנו הוא נאסף.

6. תצורה של פרוטוקולי גירוי אור

1. הגדר מערכת משלוח אור והתקן את התוכנה הנלווית.
2. פתח את התוכנה. בחר תצורת חיווט חומרה שבה מקור הדק (Digital/TTL Out) מספק אות Trigger In למערכת העברת האור, ומערכת העברת האור מספקת אות Trigger Out לנורית LED של 470 ננומטר.
3. הרכב עדשה אובייקטיבית בעוצמה גבוהה. באמצעות מצלמה דיגיטלית, כיול מטרה בהספק גבוה לשימוש עם מערכת אספקת אור.
4. צור רצף פרופילים חדש של פרופילי גירוי אור.
   1. צור תבנית של בחירה. בניסויים המתוארים כאן, מעגל בקוטר 150 מיקרומטר משמש כדי לאפשר הפעלה ספציפית לשכבה של מסופי אקסון.
   2. כדי לבנות רצף פרופילים, העתק והדבק פרופיל זה עבור כל אחד ממספר כלשהו של גירסאות ניסיון.
   3. צור רשימת צורות גל המכילה צורות גל בכל עוצמת אור, משך פולס או מספר פולס.
   4. הקצה באופן אקראי צורות גל לכל פרופיל. כל פרופיל עם צורת הגל שהוקצתה לו מתאים לפעימת הדק אחת מקלט TTL דיגיטלי, או לגרסת ניסיון אחת.
   5. שמור את רצף הפרופילים.
5. בתוכנת רכישת הנתונים, צור פרוטוקול חדש.
   1. הגדר את מספר הניסויים כך שיהיה שווה למספר הפרופילים ברצף הפרופילים שנוצר זה עתה.
   2. בחר כניסות אות שיתאימו לאלה שהוגדרו בשלב 5.6. הגדר פרוטוקול המספק פלט TTL דיגיטלי יחיד, המקליט מ-16 ערוצי קלט אלה למשך פרק זמן מתאים לפני ואחרי ההדק הדיגיטלי.

7. הצבת בדיקה רב ערוצית בפרוסת רקמת המוח ex vivo

1. eACSF מבעבע של Perfuse (לא בשקיות אטומות) במהירות של 3-6 מ"ל/דקה.
2. מעבירים את פרוסת המוח המכילה את אזור העניין לרשת הרשת בתא הזלוף של המיקרוסקופ. עוגן עם נבל פלטינה (ראו איור משלים 3).
3. סובב את רשת השינוי כך שקו מגעי האלקטרודה בקצה הדיסטלי של הגשושית הרב-ערוצית יהיה בערך בניצב למשטח הפיניאלי.
4. תחת תאורת שדה רחב ותחת שליטה עדינה של המיקרומניפולטור, הורידו את הבדיקה הרב-ערוצית לכיוון פני השטח של הפרוסה.
5. סובב את צריח קוביית המסנן כדי להפעיל את קוביית המסנן המתאימה להדמיה של חלבון הכתב הפלואורסצנטי המתבטא בהדקים אקסונים של אפרנטים קליפתיים. במידת הצורך, סובבו את הפרוסה כדי ליישר את הבדיקה בצורה מדויקת יותר עם משטח הפיאל.
6. מקם את הגשושית ממש מעל מישור הפרוסה, ~ 200 מיקרומטר פחות ממיקום המטרה הסופי לאורך ציר ה- x, והשאר לפחות ערוץ אחד מחוץ לגבול אזור הרקמה המתועד
7. הכנס באיטיות את הבדיקה לתוך הפרוסה על ידי הזזת המניפולטור לאורך ציר האורך שלה. כדי למזער את הנזק לרקמה, קדמו את הבדיקה רק במידה שהקצוות החדים נראים רק מתחת לפני השטח של הרקמה. זה ימזער את הנזק לרקמה תוך הקפדה על מגעי האלקטרודה במגע עם הרקמה.

8. תיקון הידוק נוירונים ממוקדים וקבלת תצורה של תאים שלמים

1. החלף את מקור eACSF לפתרון בקרה בתיק.
2. זהה תא עם תווית פלואורסצנטית להקלטת מהדק טלאי ממוקד.
   1. הגבל את דיאפרגמה קשתית הצמצם לקוטר הקטן ביותר. השתמש בעדשה אובייקטיבית בעלת עוצמה נמוכה והבא את הרקמה למיקוד.
   2. מרכז את האור על פני אזור רקמה הסמוך (אך לא חופף) לבדיקה הרב-ערוצית.
   3. הפעל את מטרת טבילת המים בעוצמה גבוהה (פי 40 או 60x), תוך נקיטת משנה זהירות כדי להימנע ממגע בין הבדיקה הרב-ערוצית לעדשה האובייקטיבית.
   4. סובב את צריח קוביית המסנן כדי להפעיל את ערכת המסננים המתאימה כדי לאפשר הדמיה של תאים המבטאים סמן פלואורסצנטי תלוי Cre.
   5. זהה תא המסומן באופן פלואורסצנטי כיעד להקלטת מהדק טלאי. הרימו את העדשה האובייקטיבית כדי ליצור מספיק מקום להנמכת פיפטה של טלאי.
3. טען פיפטה טלאי (ראה טבלה 1) עם תמיסה פנימית (טבלה 2) והרכב פיפטה למחזיק אלקטרודה. באמצעות מזרק 1 מ"ל, להחיל לחץ חיובי המתאים ~ 0.1mL אוויר.
4. פיפטה טלאי תחתון לתוך התמיסה. הבא את קצה הפיפטה למיקוד בהנחיה חזותית.
5. השג הקלטה של תא שלם מתא היעד באמצעות השלבים שהודגמו קודם^{לכן 33}.
6. אם אתם מתכננים להעריך שינויים בתכונות הפנימיות של התא (למשל, התנגדות קלט, קצב ירי פוטנציאלי בתגובה לצעדים הנוכחיים), ערכו הקלטות אלה. אחרת, עבור לפרוטוקול גירוי האקסון להלן.

9. הפעלה אופטוגנטית ספציפית לשכבה של מסופי אקסון

1. טפל בשדה הראייה במישור x-y כדי ליישר את פרופיל גירוי האור למיקום הרצוי על הפרוסה.
2. טען פרוטוקול גירוי קל והכן את מערכת העברת האור לקבלת דופק TTL דיגיטלי.
3. הפעלה אופטיגנטית של הדקים של האקסון תוך רישום בו-זמנית של פוטנציאלי שדה חוץ-תאיים ותנודות של ממברנות תוך-תאיות.
4. החלף את מקור eACSF לתמיסת איזופלורן ושטף את התרופה למשך 15 דקות. במידת הצורך, לאסוף הקלטות ספונטניות במהלך השטיפה.
5. חזור על שלב 9.2-9.3.
6. החלף מקור eACSF לתמיסת בקרה ושטוף את התרופה במשך 20 דקות. במידת הצורך, אסוף הקלטות ספונטניות במהלך השטיפה.
7. חזור על שלב 9.2-9.3.

Results

ציר זמן של שלבים המתוארים בפרוטוקול מוצג באיור 1. לקלטים קליפתיים המגיעים מאזורים בקליפת המוח מסדר גבוה יותר או מגרעינים תלמיים שאינם ראשוניים יש שדות סופניים חופפים חלקית בשכבה 1 של קליפת המוח הראייתית הלא ראשונית²⁴. כדי לבודד מסלולים תלמוקורטיים או קורטיקוקורטיים בלתי תלויים, הוזרק וקטור נגיפי המכיל ChR2 וכתב פלואורסצנטי eYFP ל-Po או ל-Cg. תאים ברדיוס ההזרקה קולטים את הווקטור הנגיפי, ולאחר 2-4 שבועות, מבטאים את ערוץ הקטיון הלא ספציפי ChR2 ואת הכתב הן באקסונים הסומא ...

Discussion

בכתב יד זה מתואר פרוטוקול להערכת תגובות תוך-תאיות וחוץ-תאיות למסלולים אפרנטיים המופעלים באופן סלקטיבי בפרוסות מוח ex vivo.

השימוש בכלים אופטוגנטיים ובשיטות הקלטה מקבילות מאפשר לחוקרים לחקור תגובות של אוכלוסיות מקומיות לתשומות מאזורי מוח מרוחקים, תוך הקלטה בו-זמנית מאוכלוסיות ממוקדות של אינטרנורונים. השימוש בטכנולוגיה אופטוגנטית מאפשר לשמר ולהפעיל טרמינלים אקסוניים של הקרנות אפרנטיות למרות שגופם התאי אינו מחובר עוד. זה מקל על הגבלות גיאומטריות שהוטלו בעבר על פרוסות ex vivo , שכן שימור ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5x עדשת אובייקטיבית רחבת שדה	אולימפוס	MPLFLN2.5X
40x עדשת אובייקטיבית טבילה במים	אולימפוס	LUMPLFLN40XW
95% O2/5% תערובת CO2	Airgas	Z02OX95R2003045
A16	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	בדיקה 16 ערוצים
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	מעבדת קארל דיסרות', UNC
(POET II)	Criticare	602-3A
ATP, מלח מגנזיום	סיגמא אולדריץ'	A9187	תמיסה תוך-תאית
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	מעבדת ג'קסון	007914	עכבר tdTomato B6 תלוי Cre
; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	מעבדת ג'קסון	008069	PV-Cre עכבר
רקדנית בטן שייקר	תומאס סיינטיפיק	1210H86-TS	לשיווי משקל של שקיות גז אטומות
תמיסת בטדין	מותג
Bleach	Generic מותג		לכסף כלוריד תיקון מהדק אלקטרודה
Bupivicaine
סידן כלורי (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
זכוכית נימית (הקלטות מהדק תיקון)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	בורוסיליקט, ID: 1.1 מ"מ, OD: 1.7 מ"מ, אורך: 90.0 מ"מ
זכוכית נימית (זריקות ויראליות)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3.5 אינץ'
בקרה על מיקרומניפולטור זוטר	לואיגס ונוימן	SM8	לשליטה במיקרומניפולטור זוטר
בקרת מניפולטורים ושולחן הזזה	Luigs ו-Neumann	SM7	לשליטה באלקטרודה רב-ערוצית ו שולחן הזזה
Digidata 1440A + Clampex 10	התקנים מולקולריים	1440A	דיגיטייזר ותוכנה
צינורות E-3603	Fisher Scientific	14171208	לאספקת תערובת גז CO2 95% O2/5% לתא הדגירה + הפעלת לחץ במהלך הידוק תיקון
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	פתרון תוך-תאי
ERP-27 EEG פאנל התייחסות/תיקון	Neuralynx	פרש
מילוי	מחט World Precision Instruments	50821912	למילוי תיקון מהדק פיפטות
קוביית סינון להדמיה EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
נייר סינון	פישר סיינטיפיק	09801E	להניח על תבנית פרוסה במהלך הכנת בלוק רקמות
חולץ מיקרופיפטה בוער/חום	מכשיר סאטר	P-1000	2.5x2.5 קופסה נימה
צינור פיזור גז	סיגמא אולדריץ'	CLS3953312C
מזרק זכוכית (100 מ"ל)	סיגמא אולדריץ'	Z314390	למילוי שקיות אטומות בגז
חומצה גלוקונית, מלח אשלגן (K-גלוקונאט)	תמיסה תוך תאית	DSG37020	גלוקוז סיינטיפיק
	DSG32040		ACSF
GTP, נתרן מלח	Sigma Aldrich	G8877	תמיסה תוך-תאית
מתאם	NeuroNexus	A16-OM16	לחיבור בדיקה 16 ערוצים לכניסת headstage
מלקחיים המוסטטיים	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, תמיסה תוך-תאית
HS-16 Headstage	Neuralynx	בדימוס
איזופלורן	פטרסון וטרינרי	07-893-1389
איזופרופיל אלכוהול (70%)	VWR International	101223-746
מיקרומניפולטור זוטר	לואיגס ונוימן	210-100 000 0090-R	למניפולציה של אלקטרודה מהדק
תיקון מודול בקרת מקור אור	LED Mightex	BLS-PL02_US	בקרת מקור אור אופטוגנטי
Lidocaine
Lynx-8 מגבר	Neuralynx	פרש
Lynx-8 ספק כוח	Neuralynx	פרש
מגנזיום סולפט (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, טקסס קוביית מסנן אדומה	Chroma	49008	להדמיה tdTomato פלואורסצנטי מדווח
Meloxicam
מחזיק מיקרופיפטה	פישר סיינטיפיק	NC9044962
משאבת מיקרומזרק	מכשירים מדויקים בעולם	UMP3-4
שמן מינרלי	מותג
גנרי MultiClamp 700A	מכשירים מולקולריים/Axon Instruments	700A	מגבר
חנקן (לשולחן אוויר)	Airgas	NI200
רשת ניילון	פישר סיינטיפיק	501460083	נמתח על פרסה של חוט פלטינה שטוח, פרוסה מונחת על גבי זה במהלך ההקלטות
ניילון, חתוך מגרביונים	חתיכה קטנה של מותג		ליצירת פלטפורמת פרוסות בתא הדגירה, סיבים בודדים ליצירת נבל פלטינה
משחה עיניים	פישר סיינטיפיק	NC1697520
פיפטה	Dot Scientific	307	להעברת רקמה למתקן
חוט פלטינה	VWR International	BT124000	2 ס"מ, שטוח, לייצור נבל פלטינה
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	מערכת אספקת אור אופטוגנטית, מגיע עם תוכנת PolyScan2
אשלגן כלורי (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
אשלגן פוספט (KH2PO4)	Dot Scientific	DSP41200	ACSF
סכין גילוח	Fisher Scientific	12-640
להב ספיר (לוויברטום)	VWR International	100492-502
להב אזמל	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
שקית גז אטומה	פישר סיינטיפיק	109236
שולחן הזזה למיקרוסקופ	לואיגס ונוימן	380FMU
נתרן ביקרבונט (HCO3-)	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
נתרן כלורי (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020	ACSF, תמיסה תוך-תאית
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)	מעבדת ג'קסון	013044	עכבר SOM-Cre
מכשיר סטריאוטקסי	Kopf	דגם 902	סופר כפולות של בעלי חיים קטנים
		886833	לקיבוע בלוק רקמה לשלב הדגימה במהלך הכנת הפרוסה
מקדחה כירורגית	RAM Products Inc.	מזרק DIGITALMICROTORQUE	Microtorque II
(1 מ"ל) עם קצה LuerLock	Fisher Scientific	309628	להפעלת לחץ במהלך הידוק
תיקון מזרק (1 מ"ל) עם קצה החלקה	WW Grainger, Inc.	19G384	למילוי פיפטות מהדק תיקון
מסנני מזרק	VWR International	66064-414
מיקרוסקופ זקוף	אולימפוס	BX51
מיקרוטום רוטט	Leica Biosystems	VT1000S
מגבות Wypall	פישר סיינטיפיק	19-042-427