מאמר שיטה

כימות צבירת חלבונים בלתי מסיסים ב-Caenorhabditis elegans במהלך ההזדקנות עם זרימת עבודה חדשה של רכישה בלתי תלויה בנתונים

DOI:

10.3791/61366

⸱

7 באוגוסט 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Buck Institute for Research on Aging

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת עבודה חדשנית זו מחלצה ומבודדת ביעילות חלבונים בלתי מסיסים SDS (insolublome) מ-Caenorhabditis elegans עם חומר התחלתי מינימלי לניתוח פרוטאומי דיפרנציאלי כמותני. הפרוטוקול משתמש בניתוח ספקטרומטריית מסה מקיף שאינו תלוי בנתונים כדי לכמת את הניתוח האינסולובלום והביואינפורמטי כדי לקבל תובנות ביולוגיות לגבי מנגנוני הזדקנות ופתולוגיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו ואחרים הראינו שתהליך ההזדקנות מביא להצטברות של חלבונים בלתי מסיסים בכל רחבי הפרוטאום. הפלת גנים המקודדים את החלבונים הבלתי מסיסים במשך 40% מהזמן מביאה להארכת תוחלת החיים של C. elegans, מה שמרמז על כך שרבים מהחלבונים הללו הם גורמים מרכזיים בתהליך ההזדקנות. בידוד וזיהוי כמותי של חלבונים בלתי מסיסים אלה חיוניים להבנת תהליכים ביולוגיים מרכזיים המתרחשים במהלך ההזדקנות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שונה ומשופר המפרט כיצד לחלץ ולבודד את החלבונים הבלתי מסיסים SDS (insolublome) מ- C. elegans בצורה יעילה יותר כדי לייעל זרימות עבודה ספקטרומטריות מסה באמצעות ניתוח פרוטאומיקה כמותי חדש ללא תוויות. פרוטוקול משופר זה משתמש בסוניקטור יעיל ביותר לליזיס תולעים שמגביר מאוד את היעילות למיצוי חלבון ומאפשר לנו להשתמש בפחות חומר התחלתי (כ-3,000 תולעים) מאשר בפרוטוקולים קודמים (בדרך כלל משתמשים ב-40,000 תולעים לפחות). ניתוח פרוטאומי כמותי לאחר מכן של האינסולובלום בוצע באמצעות רכישה תלוית נתונים (DDA) לגילוי וזיהוי חלבונים ורכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA) לכימות חלבון מקיף ומדויק יותר. ניתוח ביואינפורמטי של חלבונים כמותיים מספק מועמדים פוטנציאליים שניתן לעקוב אחריהם בקלות עם שיטות מולקולריות אחרות ב- C. elegans. עם זרימת עבודה זו, אנו מזהים באופן שגרתי יותר מ-1000 חלבונים ומכמתים יותר מ-500 חלבונים. פרוטוקול חדש זה מאפשר סינון יעיל של תרכובות עם C. elegans. כאן, אימתנו ויישמנו את הפרוטוקול המשופר הזה על זן C. elegans N2-Bristol מסוג בר ואישרנו שתולעי N2 בגיל 10 הראו הצטברות גדולה יותר של האינסולובלום מאשר תולעים צעירות ביום השני.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הומאוסטזיס חלבון יורד בהדרגה עם ההזדקנות ומביא לצבירת חלבון מוגברת 1,2,3. צבירת חלבונים קשורה למספר מחלות נוירודגנרטיביות כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון וטרשת אמיוטרופית צידית4. הזדקנות נחשבת לגורם סיכון עיקרי להופעת הפרעות ניווניות הקשורות לצבירת חלבונים. חלבונים הנוטים ליצור אגרגטים בלתי מסיסים קשורים לעתים קרובות לרעילות תאית ולתפקוד לקוי של רקמות, מה שעלול להאיץ עוד יותר את הצבירה של חלבונים אחרים 5,6,7. לחלופין, אגרגטים של חלבונים בלתי מסיסים עשויים להפעיל מנגנוני הגנה תאיים כדי להסיר את הצורות האוליגומריות הרעילות של החלבון מהמערכת. הפלת גנים נבחרים המקודדים חלבונים בלתי מסיסים מווסתת את תוחלת החיים של Caenorhabditis elegans (C. elegans) בהקשר של מחלה הקשורה לגיל והזדקנות נורמלית 5,8,9. לפיכך, חקר המנגנונים התאיים והמולקולריים של צבירת חלבונים הוא חיוני להבנת ההזדקנות ובסופו של דבר עשוי להוביל לגישות לטיפול במחלות ניווניות.

הנמטודה C. elegans הפכה לאחד מאורגניזמי המודל הנפוצים ביותר לחקר צבירת חלבונים בהזדקנות ובמחלות הקשורות לגיל בשל המאפיינים הייחודיים שלה, כגון תוחלת חיים קצרה יחסית (כשבועיים), קלות גידול ומניפולציה גנטית.

היכולת לחלץ ולאפיין חלבונים בלתי מסיסים מילאה תפקיד קריטי בקביעת השינויים הקשורים לגיל הקשורים לצבירת חלבונים במודלים של C. elegans. כדי לחקור את התרומה של צבירת חלבונים לתהליכי הזדקנות נורמליים, אנו5 ואחרים2 בעבר מיצינו ועיכולנו פרוטאוליטית את האינסולובלום של C. elegans צעירים לעומת מבוגרים, שסומנו כימית באמצעות ריאגנטים iTRAQ ('תיוג איזוברי לכימות יחסי ומוחלט'), ולאחר מכן כימתנו בשיטות מבוססות MS. באמצעות שיטת תיוג איזוברית ו-120 מ"ג תולעים רטובות (כ-40,000 תולעים), הצלחנו להשיג עומק וכיסוי משמעותי של חלבון אינסולובלום5. ניתוח כמותי הראה כי 203 מתוך 1200 חלבונים שזוהו הועשרו באופן משמעותי באינסולובלום של C. elegans מזדקנים בהשוואה לשברי אינסולובלום דומים מתולעים צעירות5. באופן עצמאי, דיוויד ועמיתיו השתמשו גם בזרימת עבודה של iTRAQ LC-MS/MS כדי לבחון שינויים באגרגטים של חלבונים עם הזדקנות רגילה2. החל מכ-300 מ"ג תולעים, הם זיהו ~1000 חלבונים בלתי מסיסים באמצעות שני שכפולים ביולוגיים וקבעו כי ~700 מתוך כ-1000 חלבונים הצטברו פי 1.5 או יותר עם הגיל בהשוואה לתולעים צעירות2. בסך הכל, תוצאות בלתי תלויות אלה מצביעות על כך שחוסר מסיסות וצבירה נרחבים של חלבונים הם חלק אינהרנטי מהזדקנות נורמלית ועשויים להשפיע הן על תוחלת החיים והן על שכיחות מחלות ניווניות 2,5.

חקר האינסולובלום אפשר לנו לקבוע כיצד השפעות סביבתיות יכולות להאיץ או להאט את תהליך ההזדקנות. Klang et al. הקימו תהליכי עבודה פרוטאומיים ללא תוויות ב- C. elegans כדי לחקור את תפקיד המטאלוסטזיס באריכות ימים10. במחקר זה, לפחות 40,000 תולעים שימשו למיצוי האינסולובלום10. הנתונים הראו שרמות הברזל, הנחושת, הסידן והמנגן עולות עם ההזדקנות וכי האכלת תולעים בתזונה עם ברזל גבוה האיצה משמעותית את ההצטברות הקשורה לגיל של חלבונים בלתי מסיסים10. תוך שימוש באותו תהליך עבודה כדי לבחון את ההשפעות של ויטמין D על האינסולובלום של C. elegans, 38 חלבונים כומתו בתולעים צעירות (יום 2) ו-721 חלבונים בתולעים מבוגרות (יום 8). הזנת ויטמין D הפחיתה משמעותית את האינסולובלום של תולעים מבוגרות מ-721 ל-371 חלבונים11. חקירה נוספת גילתה כי הזנת ויטמין D דיכאה את אי המסיסות של החלבון עם הגיל, קידמה הומאוסטזיס של חלבון והאריכה את תוחלת החיים בתולעים מסוג בר C.elegans N211. לפיכך, חקר האינסולובלום יכול לסייע בזיהוי מודולטורים חדשים של הזדקנות ומחלות הקשורות לגיל.

בעוד שחקר האינסולובלום לא יסולא בפז בקידום ההבנה של תהליך ההזדקנות, הוא נפגע על ידי הדרישה לאיסוף כמויות גדולות של חומר דגימה התחלתי. Groh et al. הציגו לאחרונה זרימת עבודה של כימות פרוטאומי ללא תווית כדי לחקור שינויים טבועים בצבירת חלבונים ב - C. elegans עם ההזדקנות; עם זאת, זה דרש כמויות גדולות של חומר התחלתי (350 מ"ג תולעי קרקע)12. בדוח הנוכחי, הקמנו פרוטוקול מיצוי ובידוד חדש משופר (איור 1). השימוש בסוניקטור היעיל ביותר במהלך ליזיס תולעים שיפר משמעותית את יעילות החילוץ וכתוצאה מכך הפחית את כמות חומר המוצא הדרושה, מ-40,000 ל-3,000 תולעים. שילוב פרוטוקול בידוד אינסולובלום חדשני זה עם זרימת עבודה ספקטרומטרית של רכישה בלתי תלויה בנתונים ללא תוויות (DIA) שיפר משמעותית את עומק החלבון ואת הכיסוי. הפרוטוקול המוצג כאן הוא חסכוני וניתן לשינוי בקלות כדי לאפשר ביצוע של ניתוחי אינסולובלום במערכות מודל אחרות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: להבנה טובה יותר של הליך הניסוי, ראה איור 1 לסכימה של זרימת העבודה.

1. תרבית המונית של הזדקנות מסונכרנת C. elegans

  1. הכנת צלחת
    1. יוצקים 30 מ"ל אגר NGM עם או בלי 50 מ"מ פלואורודאוקסיורדין (FUdR) לכל צלחת 90 מ"מ ונותנים לצלחות להתייבש במשך יומיים במכסי תרבית.
    2. ביום שלפני זריעת צלחת האגר של NGM, יש לחסן 50 מיקרוליטר של מלאי גליצרול קפוא של זן חיידקי OP50 לתוך 1 ליטר של מדיום LB שעבר חיטוי מראש בבקבוק של 2 ליטר.
    3. גדלו את החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-250 סל"ד למשך 16 שעות.
    4. לאחר 16 שעות, צנטריפוגה את תרביות החיידקים במהירות של 5,000 x גרם למשך 10 דקות.
    5. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת החיידק לחלוטין ב-40 מ"ל של תמיסת S-בזאלית חיטוי (המכילה 50 מ"מ K3PO4, 100 מ"מ NaCl במים) כדי ליצור תרבית OP50 E. coli מרוכזת פי 25.
    6. יש להוציא 2 מ"ל מתרבית החיידקים המרוכזת פי 25 על כל צלחת אגר NGM ולפזר באופן שווה כך שתרבית החיידקים תכסה את כל משטח האגר.
    7. הסר את המכסים מהצלחות במכסה המנוע לתרבית חיידקים למשך 2-3 שעות עד לייבוש הצלחות כראוי.
      הערה: הקפד לפזר את החיידקים באופן שווה על ידי סיבוב הצלחות כל 15 דקות. זה חשוב מכיוון שחיידקים נוטים להתרכז בצד אחד של הצלחת וכתוצאה מכך אזורים עם צפיפות חיידקים נמוכה.
    8. לאחר ייבוש הצלחות, סגרו את המכסים והשאירו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות כדי להבטיח ייבוש מלא של מקור המזון OP50 E. coli .
      הערה: ניתן להכין צלחות שבועיים מראש ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. תחזוקה והכנה של קבוצות מסונכרנות של C. elegans
    1. כדי להשיג את הקלט הנדרש של חלבון ליזאט (1.0-1.5 מ"ג) לבידוד החלק הבלתי מסיס SDS, השתמש בכ-3,000 תולעים מסונכרנות לכל דגימה.
    2. העבירו ~100 N2 תולעים בוגרות מסוג בר לצלחת זרעי NGM 25x OP50 E. coli ושמרו על התולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך ~72 שעות עד שהצלחת מלאה בתולעים בוגרות גרבידיות.
    3. פיפטה ~ 10 מ"ל של תמיסת S-בזאלית על כל צלחת ואוספים את כל התולעים לצינור של 15 מ"ל.
      הערה: חשוב להשתמש בקצות עם שמירה נמוכה או בפיפטות פסטר במהלך זה ובכל השלבים העתידיים הכרוכים באיסוף תולעים כדי למנוע כל אובדן של תולעים עקב היצמדות למשטחי הקצה.
    4. סובב את הדגימה ב-520 x גרם למשך 30 שניות. הסר את הסופרנטנט לאחר הסחיטה. כדי לחסל כל OP50 E. coli, הוסף 10 מ"ל של תמיסת S-basal לגלולה וסובב שוב ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט. חזור על שלב זה.
    5. הוסף 10 מ"ל של תמיסת הלבנת נתרן היפוכלוריט (המכילה 0.5 M KOH ו-0.48% נתרן היפוכלוריט במים) לכדור התולעת בצינור חרוטי של 15 מ"ל ומערבולת במרץ למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. צנטריפוגה ב-520 x גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לסובב את כל גופי התולעים והביצים המומסים באופן לא מלא. ואז הסר את הסופרנטנט.
    7. חזור על שלבים 1.2.5 ו-1.2.6 כדי להבטיח הסרה מלאה של כל גופי התולעים ושחרור הביציות (צפה בצינור במיקרוסקופ כדי להבטיח).
    8. שטפו את כדור הביצה לפחות 4 פעמים עם 10 מ"ל תמיסת S-basal כדי להבטיח הסרה מלאה של תמיסת האקונומיקה.
      הערה: הסרה מוחלטת של אקונומיקה חשובה מכיוון ששארית אקונומיקה עלולה לעכב את בקיעת הביצים.
    9. השאירו ביצים תלויות ב-5 מ"ל של מדיה S-בזאלית בצינור של 15 מ"ל והניחו ברוטור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לאפשר לביצים לבקוע.
    10. לאחר 24 שעות, קחו 10 מיקרוליטר של תמיסת זחלי S-basal כדי לספור את מספר התולעים בה. השתמש לפחות בשלוש מנות נפרדות של 10 מיקרוליטר של תמיסת זחלי S-basal לשכפול ספירת התולעים. חשב את הממוצע של שלושת ריכוזי הזחלים. בהתבסס על הריכוז הממוצע, יש לדלל את תמיסת התולעת כדי לקבל ~3,000 זחלים לכל 200 מיקרוליטר תמיסה.
      הערה: הקפד לנער את הצינור בעדינות על ידי היפוך מכיוון שהזחלים נוטים להתיישב אם הם נשארים ללא הפרעה וזה יכול להשפיע על ספירת הזחלים.
    11. מערבבים היטב ומוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסת זחלי S-basal על כל אחת מהצלחות הזרוע של חיידקי NGM בגודל 90 מ"מ.
      הערה: הוסף טיפות של תמיסת זחלי S-basal לאורך הצלחת לפיזור אחיד של הזחלים כדי למנוע דלדול חיידקים מנקודות מסוימות.
    12. הניחו לתמיסת ה-S-basal להתייבש ולאחר מכן הניחו צלחות הפוכות באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
    13. לאחר 48 שעות, אספו את התולעים מהצלחת בתמיסה S-בזאלית והעבירו אותן לצלחת זרעי NGM טרייה המכילה 50 מ"מ FUDR ודגרו צלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
      הערה: חשוב להעביר תולעים בשלב מוקדם בשלב L4 כדי להבטיח יעילות FUDR.
    14. אסוף דגימות של בוגרים צעירים ביום השני לאחר 48 שעות על ידי הוספת 10 מ"ל של תמיסת S-basal על הצלחת והעברת התמיסה לצינור של 15 מ"ל. אפשר לתולעים להתיישב על ידי כוח הכבידה והסר את תמיסת ה-S-basal לאחר שהיא מתבהרת.
    15. שטפו את כדור התולעת 2-3x ב-5 מ"ל של תמיסת S-basal כדי להסיר את כל החיידקים המחוברים. הסר כמה שיותר תמיסת S-basal והקפיא את כדור התולעת (בצינורות של 15 מ"ל) באמבט קרח יבש/אתנול. דגימות קפואות מאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    16. העבירו תולעים לדוגמה לצלחת NGM OP50 E. coli טרייה המכילה FUDR כל יום לסירוגין עד היום ה-10. אסוף והקפיא תולעים כמתואר בשלבים 1.2.14 ו- 1.2.15.
      הערה: התחל עם מספר גבוה יותר של תולעים עבור דגימות יום 10 כדי להסביר כל אובדן במספר התולעים עקב העברה ומחילה.

2. מיצוי חלק בלתי מסיס SDS מתולעים

  1. הפשירו את כדור התולעת הקפוא על קרח בנוכחות 900 מיקרוליטר של קוקטייל חיץ ליזה של תולעים קרות כקרח המכיל 20 מ"מ בסיס טריס, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgCl2 ומעכב פרוטאז ללא EDTA. בקצרה דגימות מערבולת כדי להבטיח השעיה מלאה של כדור התולעת במאגר הליזיס.
  2. הנח את צינורות 15 מ"ל באמבט הסוניקציה והגדר ל-10 מחזורי סוניקציה (30 שניות דולקות ו-30 שניות כבוי לכל מחזור) בעוצמה גבוהה. חזור על הפעולה עד חמישה מחזורים (ודא שהתולעים עוברות ליזה מלאה).
  3. סובב את הליזאט ב -3,000 x גרם למשך 4 דקות בחדר הקירור. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הגלולה המכילה פסולת תולעים והעבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגה טריים של 1.5 מ"ל מקוררים מראש על קרח.
  4. כמת את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA. העבירו אליקוטים של ליזאט, המכילים בדרך כלל כ-1 מ"ג חלבון, לתוך צינורות צנטריפוגה טריים של 1.5 מ"ל מקוררים מראש.
  5. צנטריפוגה החלבון ליזאט למשך 15 דקות ב-20,000 x גרם בחדר הקירור.
  6. מבלי להפריע לגלולה, העבירו את הסופרנטנט לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל ושמרו אותו כחלק החלבון המסיס במימיים.
  7. שטפו את הגלולה מהשלב הקודם ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזיס תולעים המכיל 1% SDS בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט ושמור כחלק המסיס ב-SDS. חזור על שלב כביסה זה פעמיים כדי להסיר כל חלק מסיס SDS. הגלולה שנותרה לאחר סבב הכביסה השלישי מוגדרת כחלק החלבון הבלתי מסיס SDS של 1%.
  8. השעו מחדש את גלולת החלבון הבלתי מסיס SDS ב-60 מיקרוליטר של 70% חומצה פורמית ומערבולת במרץ כדי להמיס את החלבונים. חזור על מערבולת נמרצת כמה פעמים שצריך כדי להמיס את הגלולה.
  9. סוניקטור את הגלולה למשך 30 דקות באמבט מים אולטראסוניקטור בטמפרטורת החדר.
    הערה: הגלולה הבלתי מסיסה SDS בדרך כלל קשה להמיס במאגר. עם זאת, בסופו של דבר יש להמיס את כל הגלולה בשלב זה.
  10. יבש את הדגימות ברכז ואקום למשך שעה אחת כדי להסיר לחלוטין את תמיסת החומצה הפורמית.
  11. הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר ג'ל דגימת LDS 1x לגלולה המיובשת וחמם את הדגימה ל-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערבולת קצרה וסובב את הדגימות. טען 13 מיקרוליטר על ג'ל 4-12% NUPAGE Bis-Tris והפעל את הג'ל. מכתים את הג'ל בכתם חלבון פלורסנט להדמיה. שמור את שאר המדגם לניתוח ספקטרומטריית מסה (MS).
  12. טען את הדגימה הנותרת בג'ל ביס-טריס 4-12% והפעל במשך כ-20 דקות לעיכול טרשת נפוצה בג'ל.

3. עיכול בתוך ג'ל עם טריפסין פרוטאז לבידוד חלבונים לניתוח טרשת נפוצה

  1. הכן את התמיסות הבאות (טריות): 25 מ"מ NH4HCO3 (pH 7-8), 25 מ"מ NH4HCO3 ב-50% אצטוניטריל (ACN, pH 7-8), ו-50% ACN ב-5% חומצה פורמית.
  2. חותכים כל פרוסת ג'ל לקוביות קטנות (בדרך כלל <1 מ"מ2) ומניחים אותן בצינורות סיליקון של 0.65 מ"ל.
  3. הוסף כ-100 מיקרוליטר (או מספיק כדי לכסות) של תמיסת ACN של 25 מ"מ NH4HCO3/50% ומערבולת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מחלצים את הסופרנטנט ומעבירים לצינור נפרד (להשלכה). חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
  4. יבש את חתיכות הג'ל לחלוטין ברכז ואקום (~20 דקות).
  5. הכינו תמיסות טריות והוסיפו ~100 מיקרוליטר (או מספיק לכיסוי) של 10 מ"מ DTT ב-25 מ"מ NH4HCO3 לחתיכות הג'ל המיובשות (השתמשו ב-NH4HCO3 טרי). מערבולת וסיבוב קצר. אפשר לתגובה להמשיך ב-56 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ועם טלטול ב-1400 סל"ד במיקסר.
  6. הסר את הסופרנטנט והוסף 100 מיקרוליטר של 55 מ"מ יודואצטמיד (IAA) ב-25 מ"מ NH4HCO3 לחתיכות הג'ל. מערבולת וסיבוב קצר. אפשר לתגובה להמשיך בחושך למשך 45 דקות ב-RT.
  7. יש להסיר את החומר הנוזלי ולהשליך. שטפו את חתיכות הג'ל על ידי הוספת ~100 מיקרוליטר של 25 מ"מ NH4HCO3 ומערבולת למשך 10 דקות. סובב בקצרה והסר את הסופרנטנט, והשליך את האחרון.
  8. ייבשו את חתיכות הג'ל על ידי הוספת ~100 מיקרוליטר (או מספיק לכיסוי) של 25 מ"מ NH4HCO3 ב-50% ACN לחתיכות הג'ל והמערבולת למשך 10 דקות. לאחר מכן סובב בקצרה כדי להסיר ולזרוק את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעמיים או אפילו שלישית אם חתיכות הג'ל אינן יבשות למדי כפי שמעיד גודל קטן יותר של חתיכות הג'ל וצבע לבן מעונן.
  9. יבש את חתיכות הג'ל לחלוטין ברכז ואקום (~20 דקות).
  10. בתחילה הוסיפו 15 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין (250 ננוגרם טריפסין) לכל דגימה, ולאחר מכן הוסיפו מספיק 25 מ"מ NH4HCO3 כדי לכסות את חתיכות הג'ל (~100 מיקרוליטר). מערבולת למשך 10 דקות. לאחר מכן סובב בקצרה ודגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחדר הקירור למשך 30 דקות ללא ערבוב.
  11. הוסף 25 מ"מ NH4HCO3 לפי הצורך כדי לכסות לחלוטין את חתיכות הג'ל. סובב ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות ב-1400 סל"ד במיקסר.
  12. למחרת, מערבולת קצרה וסובב את העיכול. הוסף כ-100 מיקרוליטר מים בדרגת HPLC, סובב, פרפילם את הצינור וסוניקט ברציפות למשך 10 דקות. ספין לזמן קצר לאחר סוניקציה.
  13. העבירו את תמיסת העיכול, המייצגת את המיצוי הימי, לתוך צינור סיליקון נקי של 0.65 מ"ל.
  14. הוסף ~100 מיקרוליטר של 50% ACN / 5% חומצה פורמית לחתיכות הג'ל (מספיק כדי לכסות אותן), מערבולת 10 דקות בטמפרטורת החדר, סובב קצרות ואסוף את התמיסה, וחזור פעם אחת. אסוף את כל התמיסות המכילות את הפפטידים שחולצו משלב זה ומשלב 3.13 הקודם יחד לצינור אחד.
  15. מערבולת העיכול שחולץ. יבש את הפפטידים לחלוטין ברכז ואקום (~2 שעות).
  16. הוסף 30 מיקרוליטר של 0.2% חומצה פורמית כדי להשהות את הפפטידים במיקסר בחדר הקירור למשך 10 דקות.
  17. סובב את הדגימות ב -1850 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. שאפו את תמיסת הפפטיד ועברו לצינור סיליקון חדש ונקי של 0.65 מ"ל. לאחר מכן יש להמליח את תמיסת הפפטידים באמצעות קצות התפלה C18 (ראה להלן).

4. התפלת פפטידים מעוכלים עם קצה התפלה C18

  1. הגדר את הפיפטה ל-10 מיקרוליטר והצמד את קצה ההתפלה C18. הרטיבו את קצה ההתפלה על ידי פיפטינג של 10 מיקרוליטר של 100% ACN ולאחר מכן השלכתו. חזור על שלב זה פעמיים.
  2. שטפו את קצה ההתפלה C18 על ידי פיפטינג של 10 מיקרוליטר של 50% ACN, 49.8% מים ו-0.2% FA ולאחר מכן השלכתו. חזור על שלב זה פעמיים.
  3. אזנו את קצה ההתפלה C18 על ידי פיפטינג של 10 מיקרוליטר של 0.2% FA במים ולאחר מכן השלכתו. חזור על שלב זה פעמיים.
  4. הגדר את הפיפט ל-10 מיקרוליטר וטען את הפפטידים מהתמיסה לשרף על ידי פיפטינג של הפפטידים המעוכלים דרך השרף למעלה ולמטה פי 15.
    הערה: הפעולה החוזרת תבטיח קשירה של כל הפפטידים לשרף של קצות ההתפלה.
  5. יש להמליח את הפפטידים המעוכלים הקשורים לשרף על ידי פיפטינג של 10 מיקרוליטר של 0.2% FA במים ולאחר מכן השלכתו. חזור על שלב זה 4 פעמים כדי להשלים את שלב ההתפלה.
  6. בשפופרת חדשה, הסירו את הפפטידים עם 10 מיקרוליטר של 50% ACN, 49.8% מים ו-0.2% FA על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פי 10. חזור על שלב זה פעם אחת כדי לסלק את עיכול החלבון בפעם השנייה באותו צינור.
  7. יבש את הפפטידים המומלחים לחלוטין ברכז ואקום (~20 דקות).
  8. השעו מחדש פפטידים ב-15 מיקרוליטר של פפטידים של 0.2% FA + 1 μL iRT (זמן שמירה באינדקס). Voxtex למשך 10 דקות, צנטריפוגה ב-12,000 x g למשך 2 דקות, ולאחר מכן העברה לבקבוקון דגימה אוטומטית לניתוח MS (ראה להלן).

5. ניתוח ספקטרומטריית מסה של פפטידים מעוכלים באמצעות DDA ו-DIA

הערה: ניתן לנתח דגימות בשיטות DDA או DIA LC-MS/MS. במחקר זה, הדגימות נותחו באמצעות מערכת HPLC ננו-LC 2D בשילוב עם ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.

  1. השתמש במערכת HPLC בשילוב עם מערכת HPLC מבוססת שבב המחוברת ישירות לספקטרומטר מסה של זמן טיסה מרובע (ניתן להשתמש גם בתצורות ומערכות LC-MS אחרות).
  2. נתח דגימות באמצעות HPLC-ESI-MS/MS בשלב הפוך.
    1. בנה את פרוטוקול הכרומטוגרפיה כדי לטעון דגימת פפטידים על שבב טרום-עמודה C18. שטפו והמליחו את הפפטידים הטעונים עם ממס טעינה (0.1% חומצה פורמית) למשך 10 דקות בקצב זרימה של 2 מיקרוליטר לדקה.
    2. העבירו את הפפטידים לשבב C18 בעמודה אנליטית והעבירו אותם בקצב זרימה של 300 ננוטרל/דקה עם שיפוע של 3 שעות באמצעות פאזה ניידת A (2% אצטוניטריל, 0.1% חומצה פורמית) ו-B (98% אצטוניטריל, 0.1% חומצה פורמית). שלב הפליטה הראשון מורכב משיפוע ליניארי מ-5% B ל-35% B לאורך תקופה של 80 דקות.
    3. הגדל את שלב B הנייד ל-80% במשך 5 דקות, ולאחר מכן שמור על שלב B הנייד ב-80% למשך 8 דקות לפני שתשנה ל-5% B כדי לאזן מחדש את העמודה למשך 25 דקות.
  3. הגדר שיטת מכשיר MS עבור DDA והגדר את פרמטרי המכשיר כדלקמן.
    1. השתמש בפרמטרים הבאים לסריקת יונים מקדימה של ניסוי 1:MS1 מ-m/z 400-1500 (זמן הצטברות של 250 אלפיות השנייה); הגדר את סף העוצמה כדי להפעיל סריקות MS/MS עבור יונים של מצבי מטען 2-5 עד 200 ספירות; הגדר את ההדרה הדינמית של יוני מבשר ל-60 שניות).
    2. השתמש בפרמטרים הבאים עבור ניסוי 2: סריקות יונים של מוצר MS/MS עם סריקת MS2 נעות בין m/z 100-1500 (זמן הצטברות של 100 אלפיות השנייה לכל אחת מ-30 סריקות יוני מוצר למחזור); הגדר את התפשטות אנרגיית ההתנגשות ל-CES=5, וסמן את הביקורת 'מצב סריקת יונים של מוצר ברגישות גבוהה'.
      הערה: שיטת רכישת DDA משמשת לבניית ספריות ספקטרליות כמתואר בשלב 6.3 (ראה להלן). כאן, הוא ירכוש ספקטרום MS/MS עבור 30 יוני המבשר הנפוצים ביותר לאחר כל סריקת MS1 לכל מחזור; זמן המחזור הכולל הוא כ-3.3 שניות.
  4. השג DIA. הגדר שיטת מכשיר MS עבור DIA והגדר את הפרמטרים האינסטרומנטליים באופן הבא.
    1. השתמש בפרמטרים הבאים עבור ניסוי 1: סריקת יונים מקדימה MS1 מ-m/z 400-1250 (זמן הצטברות של 250 אלפיות השנייה).
    2. השתמש בפרמטרים הבאים עבור ניסוי 2: סריקות יונים של מוצר MS/MS עבור 64 מקטעי SWATH משתנים עם טווח סריקת MS2 בין m/z 100-1500 (זמן צבירה של 45 msec לכל אחת מ-64 סריקות יונים של מוצר למחזור); הגדר את התפשטות אנרגיית ההתנגשות ל-CES=10, סימן ביקורת 'מצב סריקת יונים של מוצר ברגישות גבוהה'.
      הערה: השתמש בשיטת רכישת DIA/SWATH של 64 משתנים כפי שתוארה על ידי Schilling et al.13 כדי לבצע כימות ללא תווית עם זמן מחזור כולל של כ-3.2 שניות. עבור רכישת DDA, במקום להשתמש ב-Q1 quadrupole כדי להעביר יון מבשר של טווח מסה צר לתא ההתנגשות, נעשה שימוש בטווח של רוחב חלון משתנה (לדוגמה m/z 5-90) כדי לדרוך בהדרגה על הטווח המלא של m/z (m/z 400-1250) עם 64 מקטעי SWATH, זמן צבירה של 45 אלפיות השנייה עבור כל מקטע, והתוצאה היא זמן מחזור של 3.2 שניות, הכולל סריקת MS1 אחת עם זמן צבירה של 250 אלפיות השנייה. רוחב החלון המשתנה מותאם בהתאם למורכבות זרם היונים הטיפוסי של MS1 שנצפה בטווח m/z מסוים באמצעות אלגוריתם 'מחשבון חלונות משתנה' של SCIEX13 (חלונות צרים יותר מוחלים על טווחי m/z 'עסוקים', חלונות רחבים יותר מוחלים על טווחי m/z עם מעט יונים מבשרים נמלטים). בפלטפורמות MS אחרות, ניתן ליישם גם אסטרטגיות חלופיות לבחירת חלונות DIA.

6. ניתוח נתונים

הערה: יש להתאים הגדרות מסוימות של ניתוח נתונים לתנאי ניסוי ספציפיים. לדוגמה, מסד הנתונים של החלבונים (קובץ fasta) שנבחר יהיה תלוי במין שממנו הוכנה הדגימה (בפרוטוקול זה השתמשנו ב-C. elegans).

  1. השתמש במנוע חיפוש של מסד נתונים MS כדי לנתח רכישות DDA ולזהות חלבונים. צור שיטת מנוע חיפוש darabase באופן הבא:
    1. עבור פרמטרים של תיאור לדוגמה, בחר זיהוי; תחת סוג מדגם, בחר חומצה יודואצטית; תחת אלקילציה של ציסטאין, בחר טריפסין; תחת עיכול (בהנחה שמחשוף C-terminal בליזין וארגינין), בחר את שם ספקטרומטר המסה תחת מכשיר; ובחר Caenorhabditis elegans תחת מינים.
    2. לפרמטרים ספציפיים של עיבוד, בדוק שינויים ביולוגיים; תחת ID Focus, בחר SwissProt; תחת מסד נתונים, בדוק מזהה יסודי; תחת מאמץ חיפוש, בחר 0.05 (10%) תחת סף חלבון שזוהה; וסמן את הפעל ניתוח שיעור גילוי כוזב תחת איכות תוצאות. שמור את שיטת מנוע החיפוש ושלח את קבצי MS raw למנוע החיפוש של מסד הנתונים לעיבוד, בשיטה שנוצרה.
      הערה: בתהליך איטרטיבי, כל סריקות MS ו-MS/MS כוילו מחדש באופן אוטומטי על ידי מנוע החיפוש על סמך הערות ותוצאות ראשוניות.
  2. לחץ על ייצוא סיכום פפטידים עם השלמת החיפוש וסנן את כל תוצאות זיהוי הפפטידים לפי סף הביטחון של 99 באקסל (שיעור גילוי שגוי (FDR) = 1%).
  3. בנה ספריות ספקטרליות של MS/MS להמשך עיבוד של קובץ הנתונים הגולמיים של DIA, ולכימות נתונים יחסי נוסף.
    1. פתח את תוכנת הניתוח הכמותי של DIA. בחר בכרטיסייה ספרייה ולאחר מכן (בתחתית הדף) לחץ על צור ספרייה ספקטרלית מ"מנוע חיפוש מסד נתונים" ופתח דוח FDR "מנוע חיפוש מסד נתונים" (קובץ הגיליון האלקטרוני *FDR.xlsx) שנוצר אוטומטית כחלק מתהליך החיפוש במסד הנתונים של קבצי הנתונים הגולמיים של DDA.
    2. לחץ על הבא, בחר את סכימת הגדרות הספרייה ולחץ על הבא. בחר Uniprot_Caenorhabditis elegans _proteome כמסד הנתונים ולאחר מכן לחץ על סיום, הספרייה הספקטרלית תיווצר.
  4. השתמש בתוכנת הניתוח הכמותי DIA כדי לנתח רכישות DIA לכימות חלבון יחסי מקיף. צינור ניתוח נתוני DIA מתואר כדלקמן.
    1. כדי לנתח ולכמת פפטידים, פתח את תוכנת הניתוח הכמותי DIA כדי להגדיר סכימת ניתוח באמצעות סכימת התבנית. סכימת התבנית זמינה בתוכנה על ידי לחיצה על הגדרות, לאחר מכן ניתוח DIA ולבסוף הגדרות היצרן של BGS.
    2. הגדר את הפרמטרים בסכימת התבנית באופן הבא:
      1) תחת זיהוי בחר לוקליזציה של PTM (חיתוך הסתברות = 0.75).
      2) תחת כמות, בחר כמות קבוצה עיקרית ככמות סכום פפטיד, הגדר קבוצה ראשית N כמקסימום 7 ומינימום 1, בחר כמות קבוצה משנית ככמות מבשרת סכום, והגדר קבוצה משנית N כמקסימום 10 ומינימום 1, ובחר סינון נתונים כ-Qvalue דליל ואל תבחר נורמליזציה של ריצה צולבת.
  5. לבצע ניתוח כימות יחסי.
    1. בחר את הכרטיסייה צינור , לחץ על הגדר ניתוח DIA מקובץ, פתח את הקבצים הגולמיים המעניינים של MS DIA (לדוגמה: דוגמה ובקרה), לחץ על הקצה ספריה ספקטרלית, בחר את הספריה שנוצרה ב- 6.3, לחץ על טען ולבסוף לחץ על הבא.
    2. בחר את סכימת הניתוח שהוגדרה ב- 6.5.1 ולחץ על הבא. בחר את קובץ ה-fasta המתאים של מסד הנתונים (בפרוטוקול זה: Uniprot_Caenorhabditis elegans_proteome) ולחץ על הבא. הגדר את הגדרת התנאי והקצה את התנאים השונים בהתאם לדוגמאות ולחץ על הבא.
    3. סקור את סקירת הניתוח (סיכום הגדרת הניסוי) ואתר את ספריית הפלט ולחץ על סיום. לבסוף, לחץ על הפעל צינור כדי לבצע את הניתוח הכמותי ללא תוויות.
      הערה: מודולים סטטיסטיים ב'תוכנת הניתוח הכמותי של DIA' מבצעים באופן אוטומטי ניתוח FDR, מייצרים מפות חום ועלילות הר געש המשווים את התנאים השונים, מייצרים רשימות של פפטידים וחלבונים מזוהים ומכומתים ומספקים ערכי Q יחד עם שינויי קיפול יחסיים בהשוואה לתנאים שונים. כאן הגדרת תנאי הדגימה כללה תולעים מבוגרות ביום 10 עם שני שכפולים ביולוגיים ותולעים צעירות ביום 2 עם שני שכפולים ביולוגיים כביקורת.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לשיטות ליזיס תולעים מסורתיות יש חסרונות שונים. לדוגמה, שיטות סוניקציה ומקצף חרוזים מבוססות בדיקה מייצרות חום מוגזם על ידי מתן אפשרות למגע של קצה המתכת או החרוזים ישירות עם הדגימות, וכתוצאה מכך התאוששות חלבון משתנה ודה-נטוריזציה של חלבון. טחינת חנקן נוזלי ואחריה סוניקציה במאגר ליזה, יכולה להיות גוזלת זמן ודורשת מספר רב של תולעים. בשל המגבלות של שיטות ליזיס תולעים מסורתיות, זרימות עבודה קודמות של טרשת נפוצה, כגון שיטות התיוג iTRAQ או שיטות ללא תוויות ששימשו היסטורית במערכת המודל C. elegans כדי להשיג מידע כמותי על האינסולובלום, דורשות קלט גדול של חומר התחלתי (לפחות 40,000 תולעים). נדרשת עבודת תרבית תולעים מאומצת כדי להשיג את מספרי התולעים הללו. יתר על כן, שיטות התיוג דורשות תוויות כימיות איזובריות יקרות. שיטות כימות ללא תוויות הן חסכוניות ויש להן שיטות הכנת דגימות ותיוג קלות ופשוטות יותר, אך דורשות מספר גדול משמעותית של תולעים כדי להשיג כיסוי מספיק של ניתוח טרשת נפוצה.

הסוניקטור בו השתמשנו מגביר מאוד את היעילות והשחזור של ליזיס תולעים על ידי ליזר מספר דגימות תולעים בו זמנית בסוניקטור אמבט מים מבוקר טמפרטורה ללא זיהום צולב14, ובכך להפחית משמעותית את כמות חומר התולעת ההתחלתי הנדרש. בשילוב שיטת הסוניקציה היעילה ביותר וגישת הטרשת הנפוצה הכמותית ללא תוויות DIA, הצלחנו לכמת בצורה חזקה את האינסולובלום של תולעים מבוגרות וצעירות באמצעות ~3,000 תולעים. כאן בדקנו ואימתנו את יעילות הפרוטוקול והשווינו את האינסולובלום של תולעים מבוגרות וצעירות מזן תולעים מסוג בר, N2-Bristol C. elegans. יישמנו פרוטוקול זה כדי לחלץ ולבודד את האינסולובלום מ~3,000 N2 C. elegans מבוגרים וצעירים (שני שכפולים ביולוגיים לכל מצב), ואחריו ניתוח MS עם ספקטרומטר מסה של זמן טיסה מרובע או מערכות MS אחרות תוך שימוש בשילוב של רכישה תלוית נתונים (DDA) ורכישות בלתי תלויות נתונים (DIA/SWATH) לזיהוי וכימות חלבונים. החלבונים הבלתי מסיסים נותחו תחילה על ג'ל שיפוע Bis-Tris 4-12% כדי לקבוע את כמות החלבון בכל דגימת אינסולובלום. כפי שמודגם באיור 2, בדגימת האינסולובלום מתולעים בגיל N2 (נתיבים 2 ו-3, ניסויי שכפול ביולוגי) יש הרבה יותר חלבון מאשר דגימות מתולעים צעירות N2 (נתיבים 1 ו-4, ניסויי שכפול ביולוגי).

לאחר עיכול בתוך הג'ל, פרופילי החלבון של האינסולובלום נותחו על ידי HPLC-MS. באמצעות זרימת עבודה זו, אנו יכולים בדרך כלל לזהות 1000-1500 חלבונים ולכמת 500-1,000 חלבונים מהחלק הבלתי מסיס SDS עם יכולת שחזור גבוהה (נתונים שלא פורסמו). כאן הצלחנו לכמת 989 חלבונים מהאינסולובלום של N2-Bristol C. elegans על ידי ניתוח נתוני ה-DIA והסרת יתירות: 768 חלבונים הועשרו באופן משמעותי ו-27 חלבונים ירדו משמעותית באינסולובלום של תולעת N2 מבוגרת (יום 10) בהשוואה לצעירים (יום 2) באמצעות שינוי קיפול של לפחות 1.5 וערך Q של פחות מ-0.01 (איור 3A). כפי שניתן לראות בתרשים ההיסטוגרמה (איור 3B), שינוי הקיפול של חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מראה התפלגות נורמלית. תולעים מבוגרות הוכחו כמועשרות באופן משמעותי עבור האינסולובלום: השינוי הגדול ביותר שנצפה הראה ששפע החלבון היחסי באינסולובלום גבוה פי 592 בתולעים זקנות לעומת צעירות; ועבור 32 חלבונים, שפע החלבון היחסי באינסולובלום היה גבוה פי >250 בתולעים זקנות לעומת צעירות, מה שמצביע על שינויים דרמטיים באינסולובלום עם הגיל.

לאחר חילוץ רשימת החלבונים הבלתי מסיסים הגדלים משמעותית בתולעים המזדקנות ומזוהים על ידי בסיס התולעת (WS271), בוצעו ניתוח מסלול KEGG ואונטולוגיה גנטית (GO) כדי לקבוע את המסלולים המועשרים באינסולובלום המזדקן כדי לקבל תובנות ביולוגיות לגבי האופן שבו הם קשורים להזדקנות. ניתוח מסלול KEGG של חלבונים שזוהו במחקר זה מראה העשרה של מספר מסלולים הכוללים ריבוזומים, מיטוכונדריה, פרוטאזום וספלייסוזום (איור 4A). הניתוח האונטולוגי של הגנים מראה כי האינסולובלום מתולעים מבוגרות מורכב מחלבונים רבים בקטגוריות מסוימות כולל חלבונים מיטוכונדריים, התפתחותיים, קובעים של תוחלת חיים בוגרת וחלבונים ריבוזומליים (איור 4B וטבלה משלימה 1A). לאחר מכן השווינו את רשימת החלבונים שזוהו במחקר זה עם עבודות שפורסמו בעבר של David et al.2 ו-Mark et al.11 כפי שהודגם בדיאגרמות Venn (איור 5A,5B). ההשוואה הראתה חפיפה משמעותית של חלבונים שזוהו 394/721 ו-444/721 עם מחקר David et al (איור 5A) ו-Mark et al. (איור 5B), בהתאמה. המסלולים הביולוגיים שנחשפו על ידי ניתוח KEGG של אינסולובלום ממחקר זה זוהו גם בעבר ובכך מאמתים את המתודולוגיה שלנו (טבלה משלימה 1B). זיהוי המסלולים והחלבונים הללו מצביע על כך שהם עשויים לשמש מועמדים למחקר ביולוגי נוסף בנוגע לתפקודם בהקשר של הזדקנות.

לסיכום, השימוש בשיטת הסוניקציה היעילה מאפשר ליזה של דגימות תולעים מרובות בו זמנית בסביבה עם טמפרטורות מבוקרות היטב וזיהום צולב מופחת כדי להשיג כיסוי חלבון גבוה עם פחות חומר תולעת התחלתי משמעותית. שילוב שיטת הסוניקציה היעילה עם זרימת עבודה לכימות חלבון ללא תווית DIA סיפק תוצאות אמינות וניתנות לשחזור לכימות חלבוני תולעת בלתי מסיסים.

figure-results-1
איור 1. זרימת עבודה ניסיונית של הפרוטוקול. C. elegans תורבו ונאספו בימים שונים. לאחר ליזיס תולעת עם סוניקטור, חלק החלבון הבלתי מסיס SDS 1% (insolublome) חולץ ובודד מהליזאט. לאחר מכן עוכל האינסולובלום באמצעות עיכול טריפסין בתוך הג'ל וכומת באמצעות ספקטרומטריית מסה DIA, ולאחר מכן ניתוח ביואינפורמטי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2. ג'ל SDS-PAGE של האינסולובלום בודד תולעים צעירות לעומת זקנות של זן N2-Bristol. המסיסים של תולעים צעירות לעומת מבוגרות מזן N2-Bristol נותחו על ידי SDS-PAGE כדי לקבוע את כמות החלבון הקיימת. הג'ל SDS-PAGE נצבע בכתם חלבון פלואורסצנטי כדי להמחיש רצועות חלבון. נתיבים 1 ו-4: Insolublome משני ניסויי שכפול ביולוגי של תולעי N2 צעירות (יום 2). נתיבים 2 ו-3: Insolublome משני ניסויי שכפול ביולוגי של תולעי N2 מיושנות (יום 10). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3. מועמדים לחלבון זוהו כמראים שינוי משמעותי באינסולובלום הזקן לעומת הצעיר ובהתפלגות שינוי הקפל שלהם. (A) חלקת הר געש לכימות ה-insolublome של תולעי N2-Bristol מבוגרות לעומת צעירות. מועמדים עם שינוי קיפול מוחלט >=1.5 וערך Q <0.01 מוצגים כנקודות אדומות. (B) תרשים היסטוגרמה להתפלגות שינוי קיפול של חלבונים בלתי מסיסים SDS מועשרים משמעותית בדגימות תולעים מבוגרות לעומת צעירות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4. מסלול KEGG וניתוח אונטולוגיה גנטית (GO). (A) ניתוח מסלול KEGG של האינסולובלום של יום 10 מסודר לפי ערך p עם מסלול משמעותי ביותר שמוצג בחלק העליון. (B) ניתוח אונטולוגיה של גנים מראה כי אינסולובלום של תולעים מבוגרות מועשר עבור חלבונים רבים בקטגוריות מסוימות כולל חלבונים מיטוכונדריאליים, התפתחותיים, קובעים של תוחלת חיים בוגרת וחלבונים ריבוזומליים. תצוגת תרשים הפיזור מדמיינת את מונחי ה-GO ב"מרחב סמנטי" שבו המונחים הדומים יותר ממוקמים קרוב יותר זה לזה. צבע הבועה משקף את ערך ה-p שהתקבל בניתוח STRING, בעוד שגודלו משקף את הכלליות של מונח ה-GO במסד הנתונים של UniProt-GOA. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5. חפיפה של חלבון Insolublome זוהתה ביום ה-10 של insolublome בהשוואה למחקר זה עם (A) David et al.2 ו-(B) Mark et al.11 . אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1 (קשורה לאיור 4 ואיור 5).(A) אונטולוגיה גנטית (תהליך ביולוגי) שנותחה באמצעות מסד נתונים STRING. (B) רשימה מפורטת של חלבונים ומסלולי KEGG שזוהו במחקר זה עם קודי צבע המתארים את החפיפה שלהם עם העבודה שפורסמה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מדווחים על שיטת הכנת דגימה משופרת למיצוי חלבונים בלתי מסיסים מ- C. elegans. על ידי החלפת ליזיס תולעים מסורתי (למשל, סוניקציה של בדיקה או טכניקות מקצף חרוזים) בסוניקטור היעיל, הגדלנו את התפוקה של מיצוי החלבון הבלתי מסיס והפחתנו את מספר התולעים הדרושות לניתוח MS ללא תווית מ-40,000 תולעים ל-3,000 תולעים. מנוע חיפוש מסד נתונים שימש לזיהוי חלבונים מנתוני DDA והספרייה הספקטרלית C. elegans נבנתה באמצעות 'תוכנת הניתוח הכמותי של DIA' ותוצאות החיפוש המקבילות של מסד הנתונים DDA (ייבוא דוחות קבצי FDR שנוצרו על ידי מנוע החיפוש של מסד הנתונים). כימות יחסי של נתוני C. elegans insolublome מבוגרים וצעירים בוצע באמצעות 'תוכנת הניתוח הכמותי של DIA' כדי לעבד את מערך הנתונים החדש של DIA ואת הספרייה הספקטרלית שנוצרה.

מספר שלבים הם קריטיים בפרוטוקול. תוחלת החיים הקצרה של C. elegans הופכת אותו למערכת אידיאלית לחקר הזדקנות, בהשוואה לאאוקריוטים אחרים כגון תאי יונקים, אך חיוני לבודד אוכלוסייה הומוגנית של תולעים בעת חקר תופעות הקשורות להזדקנות. FUDR שימש בפרוטוקול זה להשגת תולעים מזדקנות מסונכרנות. חשוב להעביר תולעים בשלב מוקדם של L4 שלהן לצלחת זרעי NGM המכילה FUDR כדי להבטיח את יעילותה. במהלך ליזיס תולעים באמצעות הסוניקטור היעיל, יש להגדיר את טמפרטורת אמבט המים ל-4 מעלות צלזיוס ואת הסוניקציה ל-30 שניות ON ו-30 S OFF כדי למנוע התחממות יתר של הדגימות. לאחר סבב הסוניקציה הראשון במשך 10 מחזורים (10 דקות), חשוב לבדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שכל התולעים עברו ליזה יעילה. אם לא, יש צורך במחזורי סוניקציה נוספים. במהלך תהליך העיכול בתוך הג'ל, יש לחתוך כל פרוסת ג'ל לקוביות לחתיכות בגודל המתאים (<1 מ"מ2) - אם הן קטנות מדי, הן עלולות ללכת לאיבוד בתהליך הכנת הדגימה, ואם הן גדולות מדי, העיכול עלול להיות לא מספק.

הצורך בהרבה פחות חומר התחלתי מפחית משמעותית את העבודה המאומצת הקשורה לתרבית תולעים להשגת דגימות לניתוחי אינסולובולום. עם זאת, מיצוי ובידוד של חלק החלבון הבלתי מסיס SDS 1% כרוך במספר שלבי כביסה ונדרש טיפול זהיר בדגימה כדי למנוע אובדן דגימה ולהבטיח תוצאות הניתנות לשחזור. כמות החומר שנוצרה לניתוח טרשת נפוצה מספיקה לזריקות ~3 לניתוח DDA ו-DIA עוקבות, אך לא כדי לחסוך לניסויים עתידיים. יתר על כן, למרות השפעותיו המבלבלות הפוטנציאליות15, השתמשנו בריכוז הנמוך ביותר האפשרי של FUdR כדי לעקר תולעים במהלך תהליך ההזדקנות. מחקרים עתידיים עשויים לעקוף את השימוש ב-FUdR על ידי שימוש במוטציות סטריליות או על ידי העברה ואיסוף ידני של תולעים.

השימוש בסוניקטור היעיל ביותר לליזה של תולעים מאפשר מיצוי יעיל של האינסולובלום המאפשר כיסוי חלבון טוב וניתוח DIA MS חסכוני ללא תוויות כדי לכמת את האינסולובלום באמצעות מספר מופחת מאוד של תולעים. זה מפחית משמעותית את עומס העבודה ומאפשר סינון ליותר תנאים לכל ניסוי. בנוסף, זרימת העבודה ללא תוויות של MS DIA היא חסכונית ומספקת עומק וכיסוי חלבון ברמות דומות לשיטות תיוג כולל iTRAQ, TMT או SILAC. מודל C. elegans הוא מערכת סינון מהירה לחקר ההזדקנות. ניתן לשנות וליישם בקלות את זרימת העבודה כדי לחקור הזדקנות ומחקר מחלות הקשורות לגיל באורגניזם זה ובאורגניזמים אחרים. לדוגמה, במחקרים מתמשכים אנו מיישמים את זרימת העבודה הזו כדי לחקור פרופילי חלבון של אינסולובלום ופרוטאוסטזיס במודלים שונים של מחלת אלצהיימר (AD) C. elegans כולל תולעי Abeta, tau ותולעי Abeta/tau כפולות עם או בלי התערבויות תרופתיות שונות לבדיקת תרופות עתידיות בתפוקה גבוהה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מכשור משותף של NIH עבור מערכת TripleTOF (1S10 OD016281, מכון באק), מענק NIH, RF1 AG057358 (GJL, JKA) ומענק NIH U01AG045844 (GJL). XX נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט T32 (מענק NIH 5T32AG000266, PI: ג'ודית קמפיסי וליסה אלרבי). MC נתמכת על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מקרן לארי ל. הילבלום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>זנים בשימוש
Esherichia coli OP50Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (בריסטול)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Buffer/Solution
NGM (Nematode Growth Media)מתכון: 3  גרם/ליטר NaCl, 23  g/L אגר; 2.5&דק; גרם/ליטר פפטון; 1&דק; mM CaCl2, 5  כולסטרול מ"ג/ליטר, 1  mM MgSO4, 25  mM KH2PO4
מתכון לתמיסת5.85 גרם/ליטר NaCl, 1 גרם/ליטר K2HPO4, 6 גרם/ליטר KH2PO4, H2O עד 1 ליטר
אקונומיקה נתרן היפוכלוריטמתכון: מערבבים 0.5 מ"ל 5 N NaOH עם 1 מ"ל נתרן היפוכלוריט (5%) ויוצרים נפח ל-5 מ"ל עם H20.
<חזק>חומר/ציוד
אגרDifco אגר מגורען, BD Biosciences90000-782
Bioruptor Plus מכשיר סוניקציהDiagenode, ארה"בB01020001
כולסטרולסיגמאc8503
2'-deoxy-5-fluorouridineVWRTCD2235
גליצרולMillipore Sigma356350-1000ML
מרק LB, מילרMillipore Sigma60801-450
נתרן דודציל סולפט (SDS?SigmaL4509-250G
נתרן כלוריסיגמא59888
M880 אמבטיה אולטרסאונד, 117 V, מכיל 5.5 ליטרVWR, ארה"ב89375-458
מגנזיום סולפטSigmaM506
מגנזיום כלורידסיגמא208337
NGM אגר צלחתVWR כלי פטרי חד פעמיים25384-342
NuPAGE LDS מאגר דגימה (4X)NuPAGE Thermo Fisher ScientificNP0007
4-12%InvitrogenNP 0335BOX
קוקטייל פרוטאז (PIC)Roche11836170001
Pierce BCA AssayThermo Fisher Scientific23225
נתרן היפוכלוריט 5%VWRJT9416-1
SYPRO רובי חלבון ג'ל כתםתרמו פישר סיינטיפיקS12000
MS סעיף
אצטוניטריל, בורדיק וג'קסון LC-MSHoneywell International Inc., שארלוט, קרוליינה הצפונית, ארה"ב36XL66
Agilent Zorbax 300Extend C18 עמודהAgilent Technologies Inc., סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב770995-902
אמוניום ביקרבונטסיגמא אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב9830 (1 ק"ג)
דיתיותרייטול (DTT)סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בD9779-5G
Eppendorf Thermomixer CompactEppendorf AG, המבורג, גרמניהT1317-1EA
חומצה פורמיתסיגמא אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בF0507-500ML
תקן פפטיד נורמליזציה של זמן שימור אינדקס (iRT)Biognosys AG, שלירן, ציריך, שוויץKi-3002-2
יודואצטמיד (IAA)סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בI1149-25G
מתנול, HPLC GradeHoneywell International Inc., שארלוט, קרוליינה הצפונית, ארה"ב34885
מלכודת ננו cHiPLC ChromXP C18-CL, 200 אום x 6 מ"מ, 3 אום, 120A. (שבב טרום עמודה) (שבב 200 אום x 6 מ"מ ChromXP C18-CL, 3 אום, 300 A)Sciex LLC, פרמינגהם, MA, ארה"ב804-00006
ננו cHiPLC ChromXP 75 אום על 15 ס"מ, C18-CL, 3 אום, 120 A (שבב עמודה אנליטית)Sciex LLC, פרמינגהם, MA, ארה"ב804-00001
אורתוגנול מרובע זמן טיסה (QqTOF) TripleTOP 6600 ספקטרומטר מסהSciex LLC, פרמינגהם, MA, ארה"בלפי הצעת מחיר
ProteinPilot 5.0Sciex LLC, פרמינגהם, MA, ארה"בהורדת תוכנה Sciex
Savant SPD131DDA Speedvac ConcentratorThermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"בSPD131DDA-115
ריצוף ליופיליזציה בדרגת ריצוף טריפסיןLife Technologies23225
SpectronautBiognosys AG, שלירן, ציריך, שוויץSw-3001
SWATH 2.0 לתוך PeakView 2.2Sciex LLC, פרמינגהם, MA, ארה"בהורדת תוכנה Sciex
מערכת HPLC Ultra Plus nano-LC 2DSciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, ארה"בדגם # 845
Water, Burdick and Jackson LC-MSHoneywell International Inc., שארלוט, קרוליינה הצפונית, ארה"ב600-30-76
Waters 1525 מערכת משאבות HPLC בינאריתWaters Corp., מילפורד, MA, ארה"בWAT022939
Waters 2487 גלאי UV באורך גל כפולWaters Corp., מילפורד, MA, ארה"בWAT081110
Waters 717plus AutosamplerWaters Corp., Milford, MA, USAWAT022939
Waters Fraction Collector IIIWaters Corp., Milford, MA, USA 186001878
S-בסיס: תמיסת ג'ל חלבון , תוסף

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. , 919-932 (2015).
  2. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).
  3. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. (1), 435-464 (2013).
  4. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. , 10-17 (2004).
  5. Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging Cell. 11 (1), 120-127 (2012).
  6. Ayyadevara, S., et al. Proteins that accumulate with age in human skeletal-muscle aggregates contribute to declines in muscle mass and function in Caenorhabditis elegans. Aging. 8 (12), 3486-3497 (2016).
  7. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, (2019).
  8. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes and Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  9. Morimoto, R. I., Cuervo, A. M. Protein homeostasis and aging: Taking care of proteins from the cradle to the grave. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (2), 167-170 (2009).
  10. Klang, I. M., et al. Iron promotes protein insolubility and aging in C. elegans. Aging. 6 (11), 975-991 (2014).
  11. Mark, K. A., et al. Vitamin D Promotes Protein Homeostasis and Longevity via the Stress Response Pathway Genes skn-1, ire-1, and xbp-1. Cell Reports. 17 (5), 1227-1237 (2016).
  12. Groh, N., et al. Methods to study changes in inherent protein aggregation with age in caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (129), 1-12 (2017).
  13. Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers. Proteomics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).
  14. Walther, D. M., et al. Widespread proteome remodeling and aggregation in aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  15. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), 759-769 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SDS
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים