יישום של מיקרו-דיסקציה בלייזר לחשיפת תעתיקים אזוריים ברקמת הכליה האנושית

Summary

אנו מתארים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בלייזר של תת-מקטעים של הכליה האנושית, כולל הגלומרולוס, צינורית פרוקסימלית, איבר עולה עבה, צינור איסוף ואינטרסטיציום. לאחר מכן, ה- RNA מבודד מהתאים המתקבלים ורצף ה- RNA מתבצע כדי לקבוע שינויים בחתימה התמלולומית בתוך כל מקטע משנה.

Abstract

ניתוח ביטוי גנים של רקמת כליה אנושית הוא כלי חשוב להבנת הומאוסטזיס ופתופיזיולוגיה של מחלות. הגדלת הרזולוציה והעומק של טכנולוגיה זו והרחבתה לרמת התאים בתוך הרקמה יש צורך. למרות שהשימוש ברצף RNA גרעיני יחיד ותא יחיד הפך נפוץ, חתימות הביטוי של תאים המתקבלים מדיסוציאציה של רקמות אינן שומרות על הקשר מרחבי. מיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD) המבוססת על סמנים פלואורסצנטיים ספציפיים תאפשר בידוד של מבנים ספציפיים וקבוצות תאים מעניינות עם לוקליזציה ידועה, ובכך תאפשר רכישה של חתימות תעתיקיות מעוגנות באופן מעוגן במים ברקמת הכליה. יש לנו אופטימיזציה מתודולוגיית LMD, מונחה על ידי כתם מבוסס פלואורסצנטיות מהירה, כדי לבודד חמישה תאים נפרדים בתוך הכליה האנושית ולבצע רצף RNA הבאים מדגימות רקמת כליה אנושית יקרות ערך. אנו מציגים גם פרמטרים לבקרת איכות כדי לאפשר הערכה של הלימות הדגימות שנאספו. זרימת העבודה המתוארת בכתב יד זה מראה את ההיתכנות של גישה זו לבודד חתימות תעתיק תת-מגזריות בביטחון רב. הגישה המתודולוגית המוצגת כאן עשויה לחול גם על סוגי רקמות אחרים עם החלפת סמני נוגדנים רלוונטיים.

Introduction

ההתקדמות הטכנולוגית בחקר דגימות רקמות שיפרה את ההבנה של מצב הבריאות והמחלות באיברים שונים. התקדמות כזו הדגישה כי פתולוגיה יכולה להתחיל באזורים מוגבלים או בסוגי תאים ספציפיים, אך יש לה השלכות חשובות על האיבר כולו. לכן, בעידן הנוכחי של רפואה מותאמת אישית, חשוב להבין את הביולוגיה הן ברמה התאית והן ברמה האזורית ולא רק בעולם¹. הדבר נכון במיוחד בכליה, המורכבת מתאים ומבנים מיוחדים שונים היוזמים ו/או מגיבים באופן דיפרנציאלי ללחץ פתולוגי. הפתוגנזה של סוגים שונים של מחלת כליות אנושית עדיין לא מובנת היטב. יצירת מתודולוגיה לחקר שינויים בביטוי גנים במקטעים צינוריים ספציפיים, מבנים או אזורים של interstitium בכליה האנושית תשפר את היכולת לחשוף שינויים ספציפיים באזור שיכולים ליידע על הפתוגנזה של המחלה.

דגימות ביופסיה של כליות אנושיות הן משאב מוגבל ויקר. לכן, טכנולוגיות לחקור transcriptomics ברקמת הכליה צריך להיות אופטימיזציה כדי להציע רקמות. השיטות הזמינות לחקר תעתיקים ברמה התאית והאזורית כוללות ריצוף RNA של תא יחיד (scRNaseq), RNaseq גרעיני יחיד (snRNaseq), בהכלאה מרחבית במקום, ומיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD). זה האחרון מתאים היטב לבידוד מדויק של אזורים או מבנים של עניין בתוך מקטעי רקמה, עבור רצף RNA במורד הזרם וניתוח^2,3,4,5. ניתן לאמץ LMD כדי להסתמך על זיהוי של סוגי תאים או מבנים ספציפיים המבוססים על סמנים מאומתים באמצעות דימות מבוסס פלואורסצנטיות במהלך הניתוח.

התכונות הייחודיות של מיקרו-דיסקציה בלייזר בסיוע תעתיקים אזוריים כוללות: 1) שימור ההקשר המרחבי של תאים ומבנים, המשלים טכנולוגיות תא יחיד שבהן תאים מזוהים על ידי ביטוי ולא על ידי היסטולוגיה; 2) הטכנולוגיה מודיעה ומעודכנה על ידי טכנולוגיות הדמיה אחרות מכיוון שסמן נוגדנים מגדיר חתימות ביטוי; 3) היכולת לזהות מבנים גם כאשר סמנים משתנים במחלה; 4) איתור תעתיקים בעלי ביטוי נמוך בכ-20,000 גנים; ו-5) כלכלת רקמות יוצאת דופן. הטכנולוגיה מדרגית לביופסיה בכליות עם עובי של פחות מ -100 מיקרומטר של ליבה הדרושה לרכישת RNA מספקת ומאפשרת שימוש ברקמה קפואה בארכיון, הזמינים בדרך כלל במאגרים גדולים או במרכזים אקדמיים⁶.

בעבודה שלאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את טכנולוגיית התמלולים האזורית והתפזורת, הממוטבת עם פרוטוקול מכתים פלואורסצנטי מהיר חדשני לשימוש עם רקמת כליות אנושית. גישה זו משפרת את חקר ה- LMD הקלאסי מכיוון שהיא מספקת נתוני ביטוי נפרדים עבור מקטעי המשנה interstitium ו- nephron לעומת ביטוי tubulointerstitial המצטבר. כלולים אמצעי אבטחת איכות ובקרה המיושמים כדי להבטיח הקפדה ושחזור. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של תאים ואזורים מעניינים, וכתוצאה מכך רכישה משביעת רצון של RNA מאזורים מבודדים אלה כדי לאפשר רצף RNA במורד הזרם.

Protocol

המחקר אושר לשימוש על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית (IRB) באוניברסיטת אינדיאנה.

הערה: השתמש בפרוטוקול זה עם רקמת כריתת כליות (עד 2 ס"מ בממדי X ו- Y) שהשתמרו בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 °C (60 °F). בצע את כל העבודה באופן המגביל זיהום RNA, להשתמש בכפפות חד פעמיות נקיות ומסכת פנים. להבטיח את הניקיון של כל המשטחים. הציוד שעבורו פרוטוקול זה היה אופטימיזציה היא מערכת מיקרודיסציה לייזר שמציעות לייזר UV פעמו.

1. קריוסקציה

1. לחשוף 1.2 מיקרומטר LMD PPS-קרום (פולי(p-פנילין סולפיד) שקופיות לאור UV (במכסה המנוע זרימה למינארי תרבית רקמות) במשך 30 דקות, מיד לפני cryosectioning. אחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר לצורך הדבקות אופטימלית ברקמות.
2. מצננים את ההקפאה ל-20 מעלות צלזיוס. נקה את משטחי העבודה והתקן להב חיתוך חדש.
3. מניחים תיבת שקופיות קטנה (ניקה עם פתרון טיהור משטח RNase) בתוך תא cryostat לאחסן שקופיות עם רקמה חתוכה טרי.
4. לדבוק את הדגימה ב OCT למחזיק רקמה ולאפשר לו לשוויון במשך כמה דקות כדי להגיע לטמפרטורת התא ולחזק את הדבקות בין בלוק OCT לבין המחזיק. לסייע לתהליך באמצעות מחלץ חום.
5. חותכים את הדגימה לעובי של 12 מיקרומטר ומדביקים אותה לשקופית LMD מיוחדת, באמצעות מתאם השקופית. כל שקופית מכילה מקטע כריתת כליות אחד לכל שקופית או עד שני מקטעי ביופסיה בכליות לכל שקופית. אחסן את השקופיות ב-80°C עם מחסנית מיובשת ובתוך שקית ניילון סגורה היטב כדי למנוע הצטברות של לחות עודפת בתוך תיבת השקופית.
6. סמן כל שקופית בתווית עם מזהה דגימה, תאריך ומספר שקופית.
7. השתמש בשקופיות עם דגימות בתוך 10 ימים מהתאריך הראשוני של cryosectioning.

2. מיקרו-דיסקציה בלייזר

1. מיד לפני הכתם, להכין את תערובת נוגדנים (Ab-Mix) ב 10% BSA ב PBS ללא RNase על ידי הוספת הדברים הבאים: 4 μL של FITC-Phalloidin, 1.5 μL של DAPI, 2 μL של נוגדן חלבון Tamm-Horsfall (THP) הודבק ישירות אלקסה פלואור 546, 3.3 μL של מעכב RNase, ו 89.2 μL של 10% BSA ב- PBS (כדי להגיע לנפח של 100 μL).
   הערה: ניתן להשתמש בנוגדנים חלופיים במקום נוגדן THP. לדוגמה, 2 μL של נוגדן megalin / LRP2, ישירות מצומד אלקסה פלואור 568, ניתן להשתמש כדי לתייג את tubule proximal. Ab-Mix מכיל נוגדן LRP2 או THP (כדי לדמיין או צינוריות פרוקסימליות או גפיים עולות עבות, בהתאמה). נוגדנים אחרים עשויים להיות מאומתים בהתאם לצרכי המשתמש.
2. לשטוף את המגלשה בקרח קר (-20 °C) 100% אצטון במשך 1 דקות ולהעביר אותו לתא הלחות.
3. שטפו את החלק העליון של השקופית עם PBS ללא RNase למשך 30 שניות.
4. שטפו את החלק העליון של השקופית עם 10% BSA ב-PBS נטול RNase למשך 30 שניות.
5. יש למרוח את ה-Ab-Mix למשך 5 דקות.
6. שטפו את החלק העליון של השקופית עם 10% BSA ב-PBS נטול RNase למשך 30 שניות.
7. אוויר לייבש את השקופית במשך 5 דקות ולהעמיס אותו על פלטפורמת חיתוך microdissection לייזר.
8. התקן את צינורות האיסוף (צינורות מיקרוצנטריפוגה אוטומטיים של 0.5 מ"ל) המתאימים לעבודת PCR, המכילים 50 μL של מאגר מיצוי מערכת הבידוד RNA.
9. המשך עם LMD. השלם כל הפעלת LMD תוך שעתיים לכל היותר.
   1. לאסוף תמונות אימונופלואורסצנטיות לפני ואחרי LMD, באמצעות מצלמת המיקרוסקופ כדי לאמת את הניתוח עבור שונות בין מפעילים, כמו גם מטרות ארכיון, אימון והערכת איכות של הפרוטוקול המבוצע. על מנת להשיג 0.5 – 1 ng של RNA, מינימום של 500,000 מיקרומטר² שטח נדרש. זה לעתים קרובות מחייב את השימוש של עד 8 x12 μm קטעים עבים כדי לקבל כמות מספקת של חומר עבור כל תת מקטעי עניין.
   2. לזהות אזורים מעניינים על ידי כתמים, מורפולוגיה ומיקום ולגרש אותם באמצעות כוח לייזר גדול מ 40.
      הערה: להלן קריטריוני הניתוח. הצינורית הפרוקסימלית מוגדרת על ידי תיוג FITC-פאלודין ו- LRP2. האיבר העולה העבה מוגדר על-ידי תיוג THP. צינור האיסוף מוגדר על ידי מורפולוגיה גרעינית (DAPI) והיעדר כתמים אחרים. הגלומרולוס מוגדר על ידי FITC-פאלודין ומורפולוגיה. האינטרסטיציום מוגדר כאזור שבין צינוריות מוכתמות.
10. השג חתימת ביטוי חתך בצובר על-ידי הדבקת שני מקטעי μm של 12 μm בשקופית LMD וניתוח המקטעים כולו למאגר החילוץ.
11. עם השלמת תהליך ה- LMD, סגור את צינורות המיקרוצנטריפוגה הנאספים והזז אותו במרץ כדי להבטיח שהתוכן יעבור מהמכסה לתחתית הצינור
12. צנטריפוגה הצינורות ב 3,000 x g עבור 30 s.
13. דגירה את הצינורות ב 42 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך 30 דקות.
14. צנטריפוגה הצינורות ב 3,000 x g במשך 2 דקות.
15. להעביר את supernatant לצינור חדש 0.5 מ"ל ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.

3. בידוד RNA

הערה: עבור פרוטוקול בידוד RNA זה, התאמנו פרוטוקול מערכת בידוד RNA מסחרית. פרוטוקול היצרן השתנה כדי לעמוד בדרישות בקרת האיכות שהוגדרו עבור הפרוייקט.

1. הוסף 250 μL של חוצץ מותנה (CB) לכל עמודת טיהור RNA (PC) והדגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. צנטריפוגה כל המחשבים במשך 1 דקות ב 16,000 x g.
3. הוסף 50 μL של 70% אתנול (מסופק בערכה) לתוך הצינורות עם דגימות רקמה. מערבבים היטב את הדגימות על ידי pipetting למעלה ולמטה. אל תעשה מערבולת. אל צנטריפוגה.
4. העבר את התערובת למחשבים מותנים וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב- 100 x גרם (כדי לאגד RNA), בצע במהירות עם צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 16,000 x g (כדי להסיר זרימה דרך). חזור על שלב זה אם יותר מצינור אחד עם דגימות רקמה זמינים עבור כל תת-קטע נתון.
5. הוסף 100 μL של חוצץ לשטוף 1 (WB1) למחשבים וצנטריפוגה במשך דקה אחת ב 8,000 x גרם.
6. הכן 40 μL של DNase לכל מדגם (הוסף 5 μL של DNase ל 35 μL של מאגר RDD). לאחר מכן להוסיף 40 μL של התערובת ישירות על הממברנה של המחשב ואת הדגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הוסף 40 μL של WB1 על הממברנה של המחשב, וצנטריפוגה עבור 15 s ב 8,000 x g.
8. הוסף 100 μL של חוצץ לשטוף 2 (WB2) על הממברנה של המחשב, וצנטריפוגה במשך 1 דקות ב 8,000 x גרם.
9. הוסף 100 μL של WB2 על הממברנה של המחשב, צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 16,000 xg , מיד אחרי צנטריפוגה במשך 1 דקות ב 16,000 xg .
10. העבר את המחשב לצינור חדש של 0.5 מ"ל.
11. מוסיפים 12 μL של חוצץ Elution (EB) על הממברנה והדגירה במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר. לכן, הנפח הסופי של כל דגימות רקמה מנותח במאגר הוא 12 μL לכל תת פלח.
12. צנטריפוגה הדגימות במשך 1 דקות ב 1,000 x g ולאחר מכן במשך 2 דקות ב 16,000 x גרם.
13. העבר 2 μL לתוך צינור טרי לניתוח Bioanalyzer (כדי למנוע אירועי הפשרה בהקפאה).
14. יש לאחסן את כל הצינורות ב-80°C עד לקבלת עיבוד נוסף.

4. רצף RNA

1. להעריך כל מדגם, המיועד לריצוף, לאיכות באמצעות Bioanalyzer מסחרי שבב המוקדש למדידת כמויות קטנות של RNA.
2. פרמטרים הבאים בקרת איכות (QC) לפני הכנה לספריה רצף נדרשים: כמות RNA גדול מ 4 ng עבור בצובר וגדול מ 0.5 - 1 ng עבור כל תת פלח; אחוז התמלילים העולים על 200 נוקלאוטידים (DV200) נדרש להיות גדול מ- 25% עבור דגימות LMD (אופטימלית > 75%).
3. בצע הכנת ספרייה עם ערכת הכנה מסחרית לספריית cDNA המיועדת לכמויות קטנות של RNA מושפל. עבור הערכה המסחרית המפורטת בתוספת, אנו מציעים להשתמש באפשרות 2, הדורשת DV200 מינימלי של 25% וללא פיצול. טכנולוגיות רצף מסוימות עשויות לדרוש סף DV200 מינימלי גבוה יותר, כגון 30%⁷.
4. הוסף מתאמים ואינדקסים של cDNA.
5. לטהר את ספריות RNAseq באמצעות טכנולוגיית חרוזים מגנטיים.
6. רוקן את ה-cDNA הריבוזומלי באמצעות ערכת הסרת rRNA מסחרית לפני שלב ההגברה של ספריית RNAseq.
7. לטהר את ספריית RNAseq הסופית באמצעות טכנולוגיית חרוז מגנטי בריכוז ספריית cDNA 2 ng/μL.
8. בצע רצף RNA של 75 bp מזווג קצה על מערכת רצף מסחרי עם 30 מיליון קריאות / מדגם עבור בצובר ו 100 מיליון קריאות / מדגם עבור מקטעים תת-מגזריים.
9. השתמש RNA הפניה (25 מיקרוגרם) עם כל ריצוף לרוץ כדי לאפשר שליטה על אפקט אצווה. הריכוז הראשוני של RNA הייחוס שלנו הוא 1 מיקרוגרם / μL, בעוד הריכוז הסופי מנוצל ברצף הוא 25 ng/μL. הפעל את RNA הפניה כדוגמה נפרדת במהלך הכנת הספרייה ולהפעיל עם כל דגימות LMD בכל פעם.
10. בצע ניתוח נתונים תוך שימוש ביישום FastQC כדי להעריך את איכות הרצף, הקריאות הבין-גניות והמיטוכונדריות ולקבוע קריאות המיוחסות לגן.
11. השתמש במציג הגנומיקה האינטגרטיבית (IGV) ליישור ו- edgeR/rbamtools עבור מידות ביטוי תעתיק.
12. הסר דוגמאות עם פחות מ- 100,000 קריאות. Quantile לנרמל את הקריאות גלם בערכת הנתונים לאחר סינון החוצה גנים מבוטאים נמוכה על סף מוגדר על ידי המשתמש.
13. כימת את הביטוי כיחס בין מקטע המשנה של הריבית לממוצע של כל מקטעי המשנה האחרים וההמרה של log2. ביטוי יחסי של אותו גן ניתן להשוות על פני תת מקטעים ודגימות; עם זאת, אין זה אידיאלי להשוות ביטוי יחסי בין שני גנים שונים בשל הבדלים פוטנציאליים השפלה על פני גנים ומינים RNA.
14. בצע ניתוח העשרה כדי להשוות ביטוי גנים עבור קבוצה של יצרנים ספציפיים לכל תת-מקטע של nephron, בעוד שדגימות RNA של Reference מושווות בין אצוות. אפקט אצווה בתוך סטיית תקן אחת של ביטוי ממוצע עם ערך R > 0.9 נחשב מקובל. נדרש נורמליזציה נוספת עבור ציון אפקט אצווה גבוה יותר. ניתן לסמן בדגל כל הפעלה הסוטה מאפקט האצווה המקובל. ה- Q30 צריך להיות גדול מ- >90% עבור כל ריצוף.

Results

דגימות

אנו מציגים נתונים מתשעה ניתוחים nephrectomies (3 דגימות שהושגו באוניברסיטת אינדיאנה ו 6 דגימות שהושגו באמצעות פרויקט רפואה דיוק כליות), ניצול פרוטוקול כתמי פלואורסצנטיות מהירה כדי לבודד מקטעי nephron כליות ואזורים ביניים. הסעיפים בהם נוצלו בתהליך זה התקבלו מתורמי כליות שנפטרו או מרמת כליות לא מושפעת. לדגימות אלה לא היו ראיות פתולוגיות למחלות כפי שדמיינו בכתם H&E שנלקח מחלקים רציפים (איור 1A).

בקרת איכ...

Discussion

תעתיקים מבוססי LMD היא טכנולוגיה שימושית המעגנת ביטוי גנים לאזורים ספציפיים בתוך הרקמה. הבסיס של טכנולוגיה זו ואת היישום הפוטנציאלי שלה בכליה תוארה בעבר⁸. עם זאת, אופטימיזציה, מודרניזציה וייעול של ניתוח מבוסס פלואורסצנטיות שמטרתו במיוחד ניתוח דיוק גבוה עבור רצף RNA במורד הזרם הוא פחות בכל מקום. מכיוון שמתודולוגיה זו מעוגנת באופן מעופש בתוך הרקמה, יש לה פוטנציאל לחשוף סמנים חדשניים או לא מוערכים במבני רקמות, במיוחד במצבי מחלה. למעשה, סמנים נפוצים רבים של תאים עשויים להשתנות עם המחלה, ומכאן להסתמך ר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אצטון	סיגמא-אולדריץ'	270725-1L
AMPure חרוזים	בקמן קולטר	A63880
ביואנלייזר	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
מחסנית ייבוש	Bel-Art	F42046-0000
מאגר DNAse	Qiagen	79254	RDD כלול
במיקרוסקופ מיקרוסקופ לייזר	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 נוגדן	Abcam	ab76969	מצומד ישירות לצינורות מיקרוצנטריפוגה Alexa Fluor 568
	ThermoFisher	AB-0350
מצלמת מיקרוסקופ	Leica	DFC700T
PBS ( ללא RNAse)	VWR	K812-500ML
פלואידין (אורגון ירוק 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure ערכת בידוד RNA	יישומי ביו-מערכות KIT0204
שקופיות ממברנת PPS	Leica
qPCR התייחסות אנושית סך הכל RNA 25 ומיקרו; g	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
מעכב RNAse	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq או NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer תקוע סך RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech
נוגדן חלבון Tamm-Horsfall	D Systems	AF5144	מצומד ישירות ל-Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583