הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים

6.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61398

⸱

16 במאי 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

במאמר זה

סיכום

ויסות שלם של ספיגת גלוקוז בשרירים חשוב לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף. פרוטוקול זה מציג הערכה של ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ודגירה כאשר הם מתארים את ההשפעה של התערבויות פיזיולוגיות שונות על חילוף החומרים של גלוקוז בכל הגוף.

תקציר

שרירי השלד הם רקמה המגיבה לאינסולין ובדרך כלל תופסים את רוב הגלוקוז שנכנס לדם לאחר הארוחה. יתר על כן, דווח כי שרירי השלד עשויים להגביר את מיצוי הגלוקוז מהדם עד פי 50 במהלך פעילות גופנית בהשוואה לתנאי מנוחה. העלייה בספיגת הגלוקוז בשרירים במהלך פעילות גופנית וגירוי אינסולין תלויה בטרנסלוקציה של טרנספורטר גלוקוז 4 (GLUT4) מתאים תוך תאיים לקרום פני השטח של תאי השריר, כמו גם זרחון של גלוקוז לגלוקוז-6-פוספט על ידי הקסוקינאז II. בידוד ודגירה של שרירי עכבר כגון m. soleus ו- m. extensor digitorum longus (EDL) הוא מודל ex vivo מתאים לחקר ההשפעות של אינסולין והתכווצות חשמלית המושרה (מודל לפעילות גופנית) על ספיגת גלוקוז בשרירי השלד הבוגרים. לפיכך, מודל ה- ex vivo מאפשר הערכה של רגישות לאינסולין בשרירים ומאפשר להתאים את ייצור כוח השריר במהלך ההתכווצות ומבטיח גיוס אחיד של סיבי שריר במהלך מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים. יתר על כן, המודל המתואר מתאים לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על הרגישות לאינסולין בשרירים או עשויות להועיל כאשר מנסים להגדיר את המורכבות הרגולטורית של ספיגת גלוקוז בשריר השלד.

כאן אנו מתארים ומספקים פרוטוקול מפורט כיצד למדוד ספיגת גלוקוז מגורה של אינסולין והתכווצות בסולאוס מבודד ודגירה ותכשירי שרירי EDL מעכברים באמצעות רדיו-תווית [3H]2-deoxy-D-glucose ו-[14C] מניטול כסמן חוץ-תאי. זה מאפשר הערכה מדויקת של ספיגת גלוקוז בשרירי השלד הבוגרים בהיעדר גורמים מבלבלים שעלולים להפריע למודל החייתי השלם. בנוסף, אנו מספקים מידע על הכדאיות המטבולית של שרירי שלד עכברים מדוגרים, מה שמרמז על כך שהשיטה המיושמת כוללת כמה אזהרות בתנאים מסוימים בעת לימוד חילוף החומרים של אנרגיית השרירים.

מבוא

שרירי השלד הם בעלי יכולת לחלץ כמויות גדולות של גלוקוז מהחלל החוץ-תאי בתגובה לאינסולין ולפעילות גופנית. זה עוזר לשמור על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף ומבטיח אספקת גלוקוז בזמנים של ביקוש גבוה לאנרגיה. מאחר שהוכח כי ויסות שלם של ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד חשוב לבריאות הכללית ולביצועים הגופניים 1,2, מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים במהלך מצבים שונים זכו לתשומת לב רבה. בבני אדם ובבעלי חיים, המהדק ההיפר-אינסולינמי-אוגליקמי שימש כטכניקת תקן הזהב להערכת הרגישות לאינסולין in vivo 3,4. בניגוד לממצאים שהתקבלו מבדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה, טכניקת המהדק ההיפר-אינסולינמי-יוגליקמי אינה דורשת תפקוד שלם של מערכת העיכול או הפרשת אינסולין מהלבלב ובכך מאפשרת להשוות את תגובות האינסולין בין נבדקים המפגינים שינויים בתפקוד מערכת העיכול ו/או הלבלב. מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים in vivo במהלך פעילות גופנית בבני אדם בוצעו לעתים קרובות מאז שנות ה-60של המאה ה-20 5. תחילה על ידי שימוש בטכניקות איזון עורקים6 ומאוחר יותר על ידי שימוש בהדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) בשילוב עם אנלוגי פולט גלוקוז פולט פוזיטרון, למשל 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. במכרסמים, ספיגת גלוקוז בשריר מגורה פעילות גופנית in vivo מבוצעת בדרך כלל על ידי שימוש באנלוגי גלוקוז רדיואקטיביים או יציבים המסומנים באיזוטופים 8,9,10.

שיטה משלימה למדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים in vivo, היא לבודד ולדגום שרירים קטנים ממכרסמים ולאחר מכן למדוד את ספיגת הגלוקוז באמצעות אנלוגים רדיואקטיביים או יציבים בעלי תווית איזוטופית של גלוקוז 11,12,13. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק ואמין של שיעורי ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד הבוגרים וניתן לבצע אותה בנוכחות ריכוזי אינסולין שונים ובמהלך ההתכווצות המתעוררת על ידי גירוי חשמלי. חשוב מכך, מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירי שלד מבודדים ודגירה הן רלוונטיות כאשר חוקרים את הפנוטיפ המטבולי של השריר של עכברים שעברו התערבויות שונות (למשל תזונה, פעילות גופנית, זיהום, טיפולים). מודל שרירי השלד המבודדים הוא גם כלי מתאים לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על ספיגת הגלוקוז כשלעצמה ו/או לשנות את הרגישות לאינסולין 12,14. בדרך זו, ניתן לבחון ולהעריך את היעילות של תרכובות שנועדו לווסת את חילוף החומרים של הגלוקוז בשרירים בסביבה מבוקרת מאוד לפני ניסויי in vivo הבאים במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים.

בתנאים מסוימים, כדאיות מטבולית עשויה להוות אתגר במערכת מודל שרירי השלד המבודדת והדגירה. ואכן, היעדר מערכת הדם בשרירים המדגרים כרוך בכך שאספקת מצעים (למשל חמצן וחומרים מזינים) תלויה באופן מלא בדיפוזיה פשוטה בין סיבי השריר לסביבה. בהקשר זה, יש חשיבות לכך שהשרירים הדגירה הם קטנים ודקים ולכן, מהווים פחות מחסום לפיזור חמצן במהלך הדגירה15. במיוחד במהלך דגירה ממושכת במשך מספר שעות, מצבים היפוקסיים עלולים להתפתח עקב אספקת חמצן לא מספקת וכתוצאה מכך דלדול אנרגיית השרירים15. למרות שסמנים שונים של כדאיות מטבולית בשרירי חולדה דגירה דווחו בעבר לצד זיהוי משתנים חשובים המסייעים בשמירה על כדאיות שרירי החולדה15, הערכה מקיפה של הכדאיות המטבולית בשרירי עכברים דגירה קטנים עדיין מוצדקת. לפיכך, כיום, תכולת הגליקוגן שימשה בעיקר כסמן של כדאיות מטבולית בשרירי שלד עכבר דגירה16,17.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידת ספיגת גלוקוז מגורה בזאלי, אינסולין והתכווצות בסולאוס מבודד ומדגר ושרירי EDL מעכברים באמצעות סימון רדיו-תאי [3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז ומניטול [14C] כסמן חוץ-תאי. במחקר הנוכחי, ספיגת הגלוקוז נמדדה בפרק זמן של 10 דקות והשיטה מוצגת עם שימוש בריכוזי אינסולין תת-מקסימליים ויעילים ביותר, כמו גם פרוטוקול התכווצות יחיד. עם זאת, ניתן לשנות בקלות את הפרוטוקולים המתוארים כאן ביחס לזמן הדגירה, מינון האינסולין ופרוטוקול הגירוי החשמלי. יתר על כן, אנו מספקים אפיון יסודי של סמנים שונים של כדאיות מטבולית בסולאוס דגירה ושריר עכבר EDL. התוצאות מצביעות על כך שתוספת גלוקוז למאגר הדגירה חיונית כדי לשמור על הכדאיות המטבולית של השריר המדגר במשך שעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הליכים הכוללים חיות מחקר צריכים להתבצע בהתאם להנחיות הרלוונטיות ולחקיקה המקומית. כל הניסויים בבעלי חיים ששימשו למחקר זה עמדו באמנה האירופית להגנה על בעלי חוליות המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות ואושרו על ידי הפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים.

1. הכנת המנגנון הניסיוני ולולאות התפרים

הערה: לצורך מחקר זה, השתמש במערכת מיוגרפיה משולבת של רצועות שרירים עם ווים מותאמים אישית לדגירה של שרירי שלד עכברים מבודדים (איור 1). מערכת זו מאפשרת לשרירים להתרחץ בתמיסה פיזיולוגית עם חמצון מתמשך (95% O2 ו-5% CO2) ובטמפרטורה קבועה. אמבט רקמת השריר מוצמד למתמר כוח למדידת ייצור כוח השריר במהלך כיווץ. כדי לעורר ולתעד תגובות מיו-מכניות במהלך כיווץ, השתמש בממריץ דופק חשמלי ובתוכנית איסוף נתונים, בהתאמה. לעורר את השרירים המדוגרים להתכווץ על ידי אלקטרודות פלטינה הממוקמות במרכז ובשני צידי השריר.

  1. הפעל את מערכת המיוגרף ואת התאים החמים עד 30 °C (84 °F). פתח תוכנת איסוף נתונים התואמת למערכת המיוגרפיה וכייל מתמרים כוח כדי להבטיח יכולת השוואה בין מערכי נתונים.
  2. התחילו בחיתוך של כ-16 ס"מ גדילים של תפר ניילון כירורגי שאינו נספג. השתמש במלקחיים כדי ליצור לולאה בקוטר של כ-0.4 ס"מ מגדיל יחיד. חזור על כך עד שייווצרו מספיק לולאות. כל שריר זקוק לשתי לולאות - אחת לפרוקסימלית ואחת לגיד הדיסטלי.

2. הכנת פתרונות ומדיית דגירה

  1. הכנת מדיית דגירה בסיסית
    1. הכינו את תמיסות המלאי הבאות: 2.5 M נתרן כלורי (NaCl, 250 מ"ל), 0.5 M נתרן ביקרבונט (NaHCO3, 250 מ"ל), 0.5 M אשלגן כלורי (KCl, 50 מ"ל), 0.25 M סידן כלורי (CaCl2, 50 מ"ל), 0.25 M אשלגן דיהידרוגן פוספט (KH2PO4, 50 מ"ל), 0.25 M מגנזיום סולפט (MgSO4, 50 מ"ל), 110 mM נתרן פירובט (Na-Pyruvate, 100 מ"ל), 500 מ"מ D-מניטול (100 מ"ל), 1 M 2-דאוקסי-D-גלוקוז (4 מ"ל), תמיסה של 15% של אלבומין בסרום בקר (BSA) דיאליזציה נגד כרית קרבס-רינגר-הנסלייט (KRH) (המתוארת להלן בשלב 4) (100 מ"ל).
      הערה: נדרשים שני פתרונות למדידת ספיגת גלוקוז במנוחה ובהתכווצות. יתר על כן, כל ריכוז אינסולין יחיד המשמש להערכת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין דורש שתי תמיסות. לפיכך, בסך הכל יש צורך בשש תמיסות שונות למדידת ספיגת גלוקוז בזלתית, תת-מקסימלית, אינסולין תת-מקסימלי, ספיגת גלוקוז מגורה התכווצות בשרירי שלד עכברים מבודדים. בהמשך, 'מדיית הדגירה הבסיסית' מתייחסת למדיה ללא אינסולין או מעקבים רדיואקטיביים. 'מדיית הדגירה' מתייחסת למדיה המכילה אינסולין. 'מדיה לדגירה של ספיגת גלוקוז' מתייחסת למדיה המכילה 2-דאוקסי-D-גלוקוז ומעקבים רדיואקטיביים בנוסף לאינסולין בריכוז זהה לזה המשמש ב'מדיית הדגירה'.
    2. הכן חיץ KRH על ידי השלמת מים אולטרה-אפורים (ddH2O) עם NaCl (117 mM), NaHCO3 (24.6 mM), KCl (4.7 mM), CaCl2 (2.5 mM), KH2PO4 (1.2 mM) ו- MgSO4 (1.2 mM). לאחר מכן, גז את המאגר KRH עם 95% O2 ו 5% CO2 במשך 10 דקות לפחות. ה- pH הרצוי של מאגר ה- KRH צריך להיות בין 7.35-7.45 ב- 30 °C (84 °F). אם מתבצעת התאמת pH בטמפרטורת החדר, ה- pH של מאגר ה- KRH צריך להיות בין 7.25-7.35.
    3. הוסיפו את BSA (0.1%), Na-Pyruvate (2 mM) ו-D-mannitol (8 mM) לחיץ ה-KRH המותאם לגזים ומתואמים ל-pH כדי להשלים את מדיית הדגירה הבסיסית. אחסן את מדיית הדגירה הבסיסית במיכל אטום כדי למזער את הדה-גזיפיקציה של O2 ו- CO2 והניח מדיה ב-30 מעלות צלזיוס.
      הערה: בדרך כלל, האוסמולריות של תוספי ה-KRH (כלומר Na-Pyruvate, D-Mannitol ו-D-glucose) נשמרת קבועה לאורך כל הניסוי כדי למנוע התכווצות או התרחבות של תאי השריר. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באוסמולריות של 10 mM עבור תוספי ה- KRH. אם יש צורך במאגר המכיל גלוקוז, החליפו את תוספי ה-KRH כדי להתאים לצרכים, למשל 5 mM D-גלוקוז ו-5 mM D-mannitol.
    4. כדי להימנע ממזהמים אפשריים הקשורים ל-BSA במאגר הדגירה, דיאליזה BSA נגד KRH.
      1. כדי להפוך פתרון מניות BSA של 15% לחיוג מול מאגר KRH, התחל על ידי המסת 300 גרם של BSA ללא שומן בדרגה אנליטית ב-900 מ"ל של מאגר KRH. לאחר מכן, מרתיחים את צינור הדיאליזה במים אדומים עד שהצינורות רכים.
      2. מלאו את הצינורות בתמיסת BSA-KRH ואבטחו את קצוות הצינורות. הניחו את הצינורות עם BSA-KRH ב-5 ליטר של חיץ KRH והשאירו אותו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת החליפו את חיץ ה-KRH והשאירו את הצינורות עם BSA-KRH ב-KRH buffer למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
      3. לבסוף, אסוף את תמיסת BSA-KRH מהצינורות והוסף את מאגר KRH לנפח סופי של 2 ליטר (כלומר, 15% פתרון מניות BSA-KRH). חלקו את תמיסת המלאי BSA-KRH של 15% ל-aliquots ואחסנו במקפיא בטמפרטורה של כ-20 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת מדיית דגירה המכילה אינסולין
    1. עבור מדיית הדגירה המכילה ריכוז אינסולין יעיל באופן תת-מקסימלי, יש להוסיף 1 μL של תמיסת מלאי אינסולין של 100 mU/mL לכל מ"ל של מדיית הדגירה הבסיסית (100 μU/mL אינסולין).
    2. עבור מדיית הדגירה המכילה ריכוז אינסולין יעיל ביותר, הוסיפו 1 μL של תמיסת מלאי אינסולין של 10 U/mL לכל מ"ל של מדיית דגירה בסיסית (10 mU/mL אינסולין).
  3. הכנת מדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז
    אזהרה: טיפול בחומר רדיואקטיבי מותר רק באזור מוגבל ומבוקר על ידי כוח אדם מורשה וכמה אוניברסיטאות, מוסדות מחקר וחברות עשויים לדרוש רכישת "היתר שימוש ברדיואקטיביות". יש לטפל בחומרים ובפסולת על פי נהלים, הנחיות וחקיקה מקומיים מתאימים.
    1. בצע את אותו הליך כמתואר בסעיף 2.1.2.
    2. הוסיפו BSA (0.1%), Na-Pyruvate (2 mM), D-מניטול (7 mM) ו-2-deoxy-D-גלוקוז (1 mM) למאגר KRH המותאם לגזים ול-pH.
    3. הוסף [3H]2-deoxy-D-גלוקוז (0.028 MBq/mL) ו-[14C]מניטול (0.0083 MBq/mL) למאגר KRH המוסף כדי להשלים את מדיית הדגירה של ספיגת הסוכר. יש לאחסן בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. אם [3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז ו-[14C]מניטול מומסים באתנול יש להסיר את האתנול על ידי אידוי מתווך N2 לפני השימוש.
    4. עבור אמצעי הדגירה של ספיגת הגלוקוז המכילה ריכוז אינסולין יעיל באופן תת-מקסימלי, הוסיפו 1 μL של תמיסת מלאי אינסולין של 100 mU/mL לכל מ"ל של מדיית דגירה של ספיגת גלוקוז (100 μU/mL אינסולין).
    5. עבור מדיית הדגירה לספיגת גלוקוז המכילה ריכוז אינסולין יעיל ביותר, יש להוסיף 1 μL של תמיסת מלאי אינסולין של 10 U/mL לכל מ"ל של מדיית הדגירה לספיגת גלוקוז (10 mU/mL אינסולין).

3. בעלי חיים וכריתת סולאוס עכבר ושריר EDL לדגירה

הערה: יש לבצע הליכים הכוללים חיות מחקר בהתאם להנחיות הרלוונטיות ולחקיקה המקומית. ניתן להשתמש בהליך המתואר עם עכברים זכרים ונקבות מגודלים או זמינים מסחרית של זנים שונים ורקעים גנטיים שונים. ההליך הבא מסופק עבור נקבת עכברי C57Bl/6J המוזנים. בממוצע, העכברים היו בני 19 שבועות ומשקלם 25 גרם. העכברים נשמרו על מחזור בהיר-כהה של 12:12 שעות עם גישה חופשית לצ'או ולמים של מכרסמים סטנדרטיים. ניסויים בבעלי חיים החלו בסביבות השעה 9:00 בבוקר שעון מקומי וכל בעלי החיים הוקרבו תוך פרק זמן של שעתיים.

  1. הוסיפו 4 מ"ל של מדיית דגירה בסיסית שחוממה מראש (30 מעלות צלזיוס) לכל תא דגירה וודאו שמדיית הדגירה הבסיסית מחומצנת באופן רציף עם 95% O2 ו-5% CO2.
  2. הרדמה עכברים בזריקה תוך-צפקית של פנטוברביטל (משקל גוף של 10 מ"ג/100 גרם) או הרדמה זמינה אחרת (למשל טריברומואתנול).
    הערה: שים לב שבמדינות מסוימות ייתכן שיהיה צורך ברישיון לטיפול בפנטוברביטל ובתרופות הרדמה אחרות. לפני שניתן ליזום כריתת שרירים, הרדמה של כל בעל חיים חייבת להיות מושרית כראוי. כדי להבטיח זאת, נבדקים רפלקסים של זנב ורגליים. לקבלת תוצאות אופטימליות יש לתרגל את הניתוח היטב כדי למנוע פגיעה בשרירים במהלך ההסרה.
  3. מניחים עכברים מורדמים הנוטים למגש דיסקציה (למשל מכסה קלקר) ומצמידים את כפותיהם הקדמיות והאחוריות, לפי הצורך, באמצעות מחט.
  4. הסירו את העור מהרגל התחתונה וודאו שגם גיד אכילס וגם מפרק הברך נראים לעין.
    1. עבור ניתוח של שריר סולאוס, התחל על ידי הצמדת לולאת תפר אחת לגיד אכילס. הצמידו את מלקחי הפין לגיד אכילס באופן דיסטלי של לולאת התפר וחתכו כדי לשחרר את שרירי הסולאוס והגסטרוקנמיוס מהכף. החליקו בזהירות את מלקחי הפין על פני העכבר ובכך חשפו את שריר הסולאוס.
    2. הצמידו את מלקחי הפין והניחו לולאת תפר שנייה סביב הגיד הפרוקסימלי של שריר הסולאוס. לאחר מכן, חותכים את הגיד הפרוקסימלי ומנתחים את סולאוס (כולל שתי לולאות התפר המחוברות) ללא שרירי גסטרוקנמיוס. מקם במהירות את שריר הסולאוס בתא הדגירה על ידי הצמדת כל לולאת תפר לקרסים המתאימים.
  5. הסר את החיתולית המכסה את m. tibialis הקדמי (TA) באמצעות מלקחיים. אם נעשה נכון, גידים דיסטליים של שרירי TA ו- EDL צריכים להיות לבנים ברורים וגלויים; ומופרדים זה מזה.
  6. חותכים את הגיד הדיסטלי של שריר ה-TA ומנתחים את השריר לצורך ניתוחים מאוחרים יותר (למשל גנוטיפ). באמצעות מלקחיים, שחררו בעדינות את שריר ה-EDL מהרקמות הסובבות אותו אך השאירו את השריר שלם ואל תחתכו את הגידים. מניחים לולאת תפר אחת סביב הגיד הדיסטלי ואת לולאת התפר השנייה סביב הגיד הפרוקסימלי של EDL.
  7. לאחר מכן, חותכים את הגידים ומשחררים את שריר ה-EDL עם שתי לולאות תפר מחוברות ומניחים במהירות את השריר בתא הדגירה על ידי חיבור כל לולאת תפר לווים המתאימים. על מנת לא לאבד מתח במהלך הדגירה ובמיוחד במהלך התכווצות חשמלית של שרירי הסולאוס וה- EDL, יש חשיבות רבה לתקן את לולאות התפר סביב הגידים עם קשרים הדוקים.
  8. לבסוף, להרדים את החיה על ידי למשל נקע צוואר הרחם.
  9. לאחר שהשרירים נותחו והוכנסו לתאי דגירה, התאימו את מתח המנוחה של כל שריר לכ-5 mN והדגירו את השרירים למשך 10 דקות לפחות לפני תחילת פרוטוקול הניסוי.

4. ספיגת גלוקוז מגורה אינסולין בשרירי שלד עכברים מבודדים

  1. לאחר שלב 3.9 החליפו את מדיית הדגירה הבסיסית במדיית הדגירה המכילה אינסולין ללא אינסולין (אמצעי דגירה בסיסית), ריכוז אינסולין יעיל תת-מקסימלית או ריכוז אינסולין יעיל ביותר והשאירו בתאי הדגירה למשך 20 דקות. מרווחים כל תא דגירה בדקה אחת, ובכך מפנים זמן לקציר השרירים הבא.
  2. בסוף תקופת הגירוי של 20 דקות, החליפו את אמצעי הדגירה במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז המכילה ריכוז זהה של אינסולין והשאירו בתאי הדגירה למשך 10 דקות, שוב עם מרווח של דקה אחת בין כל תא דגירה.
  3. לאחר 10 דקות של דגירה במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז, הסירו בעדינות את השרירים מתאי הדגירה ושטפו אותם במדיית דגירה בסיסית קרה כקרח. לאחר מכן, ייבשו במהירות את השרירים על נייר מסנן לפני הסרת לולאות התפירה והשרירים מוקפאים בחנקן נוזלי. זה הכרחי כי השרירים דגירה נקטפים במהירות אם רוצים גם לחקור מטבוליטים תוך תאיים שונים ואיתות חלבונים בנוסף לספיגת גלוקוז.
  4. אספו 100 μL של מדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז מכל תא דגירה ואחסנו אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כמות הרדיואקטיביות בדגימות אלה תיכלל בחישוב ספיגת הגלוקוז בשרירים.

5. ספיגת גלוקוז מגורה התכווצות בשרירי שלד עכבר מבודדים

הערה: כדי לגרום להתכווצות של שרירי שלד עכברים מבודדים השתמש בפרוטוקול הבא: 1 רכבת / 15 שניות, כל רכבת באורך 1 שניות המורכבת מפולסים של 0.2 אלפיות השנייה המועברים ב - 100 הרץ. עם זאת, סביר להניח שגם פרוטוקולים דומים אחרים שמעוררים התכווצות של שרירי שלד של עכברים מבודדים יעבדו. חשוב לציין, יש להתאים את המתח כדי ליצור פיתוח כוח מקסימלי של השריר המדגר, התלוי במערך הניסוי. אם זה לא מובטח, אתה עלול להסתכן בכך שלא כל סיבי השריר מתכווצים. בתורו, זה עלול לגרום להטיה במערך הנתונים.

  1. לאחר שלב 3.9 מניחים את אלקטרודות הפלטינה במרכז ובשני צידי השרירים. ליזום התכווצות השרירים מיד לאחר החלפת מדיית הדגירה הבסיסית במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז. במידת האפשר, מרווחים כל תא דגירה בדקה אחת, ובכך מפנים זמן לקציר השרירים הבא. זכור להקליט ייצור כוח מכל שריר דגירה.
  2. לאחר 10 דקות של התכווצות במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז, הסירו את אלקטרודות הפלטינה, אספו בעדינות את השרירים מתאי הדגירה ושטפו אותם במדיית דגירה בסיסית קרה כקרח. לאחר מכן, ייבש במהירות את השרירים על נייר מסנן לפני שלולאות התפר מוסרות והשרירים קפואים בחנקן נוזלי. יש לבצע את כל הליך קצירת השרירים מהר ככל האפשר.
  3. אספו 100 μL של מדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז מכל תא דגירה ואחסנו אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כמות הרדיואקטיביות בדגימות אלה תיכלל בחישוב ספיגת הגלוקוז בשרירים.

6. הומוגניזציה ועיבוד של שרירי השלד

הערה: ההליך שניתן להלן להומוגניזציה של השריר מאפשר לקבוע הן את ספיגת הגלוקוז והן את האיתות המיוצלולרי על ידי כתם מערבי באותה קבוצה של דגימות שרירים.

  1. הומוגניזציה של כל שריר ב-400 μL של חיץ קר כקרח עם pH 7.5 המכיל 10% גליצרול, 20 mM נתרן-פירופוספט, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM פניל-מתיל-סולפונילפונילפלואוריד (מומס באיזופרופנול), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-גליצרופוספט, 10 mM נתרן פלואוריד (NaF), 1 mM חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA), 1 mM גליקולתרדיאמין חומצה טראומטית (EGTA), 10 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין, 10 מיקרוגרם/מ"ל לאופפטין, 3 mM בנזמידין ו-2mM נתרן-אורתובנדט באמצעות חרוזי פלדה ורקמות (2 x 45 שניות ב-30 הרץ). סובב את כל ההומוגנאטים מקצה לקצה במשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הם עוברים צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אספו את הליזאט (סופרנטנט) המשמש לקביעת ספיגת הגלוקוז בשרירים.

7. קביעת 2-דאוקסיגלוקז ומניטול בעלי תווית רדיו

  1. הוסיפו 150 μL של כל שריר lysate ו-25 μL של מדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז מכל תא דגירה כדי להפריד בקבוקונים של ספירת חרציות נוזלית המכילים 2 מ"ל של נוזל ספיגת סוכר. יתר על כן, להכין שני בקבוקוני בקרה עיוורים המכילים רק 3 מ"ל של נוזל scintillation נוזלי. סגרו את כל הבקבוקונים וערבבו היטב על ידי מערבולת כל בקבוקון במשך כ-5 שניות.
  2. ממקמים את הבקבוקונים במונה נצנוץ נוזלי ומודדים רדיואקטיביות של [3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז ומניטול [14C] בהתאם להנחיות היצרן. הקלט DPM (התפוררות לדקה) עבור כל בקבוקון נצנוץ נוזלי.

8. חישוב שיעורי ספיגת הגלוקוז בשרירים

  1. השתמשו בליזאט משלב 6.1 כדי למדוד את ריכוז החלבון הכולל בכל דגימת שריר באמצעות שיטות סטנדרטיות לכימות חלבונים (למשל, מבחני חומצה ביצ'ינצ'ונינית או ברדפורד). חשב את כמות החלבון (מ"ג) שנוספו לכל בקבוקון חרטום.
    הערה: קצב ספיגת הגלוקוז עבור כל דגימת שריר מחושב על-ידי הפחתת הכמות של [3H]2-deoxy-D-glucose הממוקמת בחלל החוץ-תאי מהכמות הכוללת של [3H]2-deoxy-D-glucose בדגימת השריר באמצעות [14C]mannitol כסמן חוץ-תאי. ההנחה היא כי [3H]2-deoxy-D-גלוקוז ו-[14C]mannitol מציגים תכונות דיפוזיה דומות בתוך רקמת השריר במהלך הדגירה. בצע את החישובים הבאים:
  2. התחל על ידי הפחתת [3H] ו- [14C] DPM של דגימות הבקרה העיוורות מכל דגימות השרירים והמדיה.
  3. קבע את המרחב החוץ-תאי של השריר ב-μL (μL-ECS):
    [14ג] שריר DPM / ([14C]DPMמדיה / Mvol)
  4. חישוב הכמות של [3H]DPM במרחב החוץ-תאי של השריר ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMמדיה / Mvol)
  5. חשב את הכמות של [3H]DPM במרחב התוך-תאי של השריר ([3H]DPMICS):
    [3ח] שריר DPM− [3H]DPMECS
  6. חשב את קצב ספיגת הגלוקוז בשרירים (μmol / g חלבון / שעה):
    [3ח] DPMICS / ([3H]DPMמדיה / Mvol) / [2-deoxy-D-גלוקוז])) / חלבון mg) / Th
    הערה: עבור כל המשוואות לעיל,
    [14ג] שריר DPM הוא כמות הרדיואקטיביות של מניטול [14C] בדגימת שריר;
    [14ג] מדיית DPM היא כמות הרדיואקטיביות של מניטול [14C] במדגם מדיה;
    [3ח] שריר DPM הוא הכמות של [3H]2-deoxy-D-גלוקוז רדיואקטיביות בדגימת שריר;
    [3ח] מדייתDPM היא כמות הרדיואקטיביות של [3H]2-deoxy-D-glucose במדגם מדיה;
    [3ח] DPMECS היא כמות הרדיואקטיביות של [3H]2-deoxy-D-גלוקוז במרחב החוץ-תאי של השריר;
    [3ח] DPMICS היא כמות הרדיואקטיביות של [3H]2-deoxy-D-glucose בחלל התוך-תאי של השריר;
    μL-ECS הוא המרחב החוץ-תאי של השריר ב-μL;
    Mvol הוא הנפח (μL) של מדיית הדגירה המשמשת לספירת חרציות (למשל '25' כאמור לעיל);
    Th הוא גורם הזמן המשמש לחישוב שיעורי ספיגה לשעה (כלומר, '1/6' בעת דגירה של שרירים עם מדיית ספיגת גלוקוז למשך 10 דקות)
  7. קחו בחשבון את החישוב לדוגמה זה. [3H] ו-[14C] DPM של דגימות הבקרה העיוורות (17 ו-6, בהתאמה) הופחתו מערכי ה-DPM שהוזכרו להלן.
    [14ג] שריר DPM: 343
    [14ג] DPMמדיה: 11846
    [3ח] שריר DPM: 4467
    [3ח] מדיה DPM: 39814
    Mכרך: 25
    חלבון מ"ג: 0.396 (ב 150 μL חלבון שריר lysate)
    [2-דאוקסי-D-גלוקוז]: 1 (מ"מ)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0.724 μL
    [3ח] DPMECS: 0.724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3ח] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    ספיגת גלוקוז: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0.396 מ"ג חלבון) / (1/6 שעה) = 31.53 מיקרומול / גרם חלבון / שעה

9. ניתוחי SDS-PAGE וכתמים מערביים

  1. מכינים את סולאוס ואת שרירי ה-EDL lysates ב-Laemmli buffer ומחממים במשך 5 דקות ב-96 מעלות צלזיוס.
  2. הפרד כמויות שוות של חלבון שריר על ידי SDS-PAGE על ג'לים יצוקים בעצמם והעביר את החלבונים לקרומי פלואוריד פוליווינילידן על ידי כתם סמי-דרי.
  3. לאחר מכן, דגירה של ממברנות ב-Tris-buffered מלוחים המכילים 0.05% Tween 20 ו-2% חלב רזה וממברנות בדיקה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים רלוונטיים.
  4. זהה חלבונים עם chemiluminescence והדמיית אותם על ידי מערכת הדמיה דיגיטלית.

10. גליקוגן שרירים, נוקלאוטידים, לקטט, קריאטין ופוספוקריאטין

  1. השתמש בחומצה פרכלורית כדי לחלץ דגימות שרירי EDL וסולאוס.
  2. לאחר מכן, נטרלו דגימות ונתחו אותן עבור לקטט, קריאטין ופוספוקריאטין כפי שתואר קודם לכן18.
  3. נתחו את תכולת הנוקלאוטידים בשריר ה-EDL והסולאוס על ידי HPLC בפאזה הפוכה לאחר מיצוי בחומצה פרכלורית.
  4. קבע את תכולת הגליקוגן של השריר בהומוגנט של שריר שלם כיחידות גליקוזיל לאחר הידרוליזה של חומצה בשיטה פלואורומטרית כפי שתואר קודם לכן18.

11. סטטיסטיקה

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנת ניתוחים סטטיסטיים.
  2. השתמש בניתוח דו-כיווני של מבחן השונות (ANOVA) כדי להעריך הבדלים סטטיסטיים בין ערכים המוצגים בטבלה 1.
  3. השתמש במבחני סטודנט t לא מותאמים כדי להעריך הבדלים סטטיסטיים בספיגת הגלוקוז בין EDL לסולאוס בתוך כל קבוצה המוצגת באיור 2. הצג נתונים כאמצעי ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שניתן לראות באיור 2, שיעורי ספיגת הגלוקוז הבסיסיים היו דומים בין סולאוס מבודד לבין שרירי EDL מנקבות עכברים. זה דווח גם כמה פעמים לפני 12,13,19,20. ספיגת הגלוקוז עלתה בכ-0.8 ופי 0.6 בקירוב והגיעה ל-12 ו-9 מיקרומול/גרם חלבון/שעה בסולאוס ובשריר ה-EDL, בהתאמה, בתגובה לריכוז אינסולין יעיל באופן תת-מקסימלי (100 μU/mL). עלייה זו הייתה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ויסות שלם של ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד חשוב לשמירה על הבריאות הכללית1. לפיכך, חקר ספיגת הגלוקוז בשרירים משמש לעתים קרובות כקריאה ראשונית בעת הערכת התערבויות שונות המשנות את הבריאות. כאן אנו מתארים שיטת ex vivo למדידת ספיגת גלוקוז בסולאוס מבודד ודגירה ושרירי EDL מעכברים בתגובה לאינסולין והתכווצויות חשמליות. השיטה מהירה ואמינה ומאפשרת שליטה מדויקת על הסביבה של השריר המדגר המאפשרת חקירות מדויקות של שיעורי ספיגת הגלוקוז בשרירים שבודדו מההשפעה המבלבלת הפוטנציאלית של הורמונים ומצעים שניתן למצוא בדם. השי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמועצה הדנית למחקר עצמאי - מדעי הרפואה (FSS8020-00288B) ומקרן נובו נורדיסק (NNF160C0023046). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק מחקר לרסמוס Kjøbsted מהאקדמיה הדנית לסוכרת, הממומנת על ידי קרן נובו נורדיסק, מענק מספר NNF17SA0031406. המחברים רוצים להודות לקרינה אולסן, בטינה בולמגרן ואיירין בק נילסן (המחלקה לתזונה, התעמלות וספורט, הפקולטה למדעים, אוניברסיטת קופנהגן) על הסיוע הטכני המיומן שלהן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[14C] D-מניטולAmerican Radiolabeled Chemicals, Inc.ARC 0127
[3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז American Radiolabeled Chemicals, Inc.ART 0103A
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD8375
4-0 USP תפר ניילון כירורגי לא סטרילימכשיר הרווארד51-7698
סטרפטווידין / HRP (מצומד)DAKOP0397משמש לאיתור חלבון ACC
נוגדן Akt2איתות תאים3063
AMPK α 2 נוגדניםSanta CruzSC-19131
aprotininSigmaA1153
benzamidineSigmaB6505
בקר סרום אלבומין (BSA)SigmaA7030
CaCl2Merck1020831000
ערכת כיול (כוח)טכנולוגיית Myo הדנית A/S300041
כימילומינסנציהMilliporeWBLUF0500
D-גלוקוזMerck1084180100
D-MannitolSigmaM4125
תוכנית איסוף נתוניםNational InstrumentsLabVIEW תוכנה גרסה 7.1
צינורות דיאליזהViskingDTV.12000.09 גודל מס' 9
מערכת הדמיה דיגיטליתBioRadChemiDoc MP
EDTASigma EDSE9884
EGTASigmaE4378
ממריץ דופק חשמליDigitimerD330 MultiStim System
גליצרולSigmaG7757
HEPESSigmaH7637
IGEPAL CA-630 SigmaI8896
אינסוליןנובו נורדיסקActrapid, 100 IE/mL
KClMerck1049361000
KH2PO4Merck104873025
לופפטיןSigmaL2884
MgSO4Merck1058860500
רצועת שריר מערכת מיוגרףדנית טכנולוגיית Myo A/Sדגם 820MS
ואורתובנאדטS6508
ופירופוספט221368
פירובטP2256
NaClMerck106041000
ו-SigmaS1504
ו- HCO3VWR27778260
pACC Ser212 נוגדןאיתות תאים3661
pAkt Thr308 נוגדןאיתות תאים9275
pAMPK Thr172 נוגדןאיתות תאים2531
פניל מתיל-סולפוניל פלואורידסיגמאP7626
אלקטרודות פלטינהדנית Myo Technology A/S300145
pTBC1D4 Ser588 נוגדןאיתות תאים8730
מונה נצנוץPerkin ElmerTri-Carb-2910TR
נוזל נצנוץ פרקין אלמר6013329
תוכנת ניתוחים סטטיסטייםSystatSigmaPlot גרסה 14
נוגדן TBC1D4Abcamab189890
TissueLyser II Qiagen85300
מים טהורים במיוחדMerckMilli-Q מערכת
ובטא;-גליצרופוספטSigmaG9422
F ייחוס A+

מקורות

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273(2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198(2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198(2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גירוי באינסוליןגירוי באמצעות כיווץשריר סולאוס של עכברשריר EDL של עכברגלוקוז מסומן רדיואקטיביתסנצילציה נוזליתאנליזת Western Blotדיסקציית שריר
מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.