הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

סיכום

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

תקציר

תאים יונקים נחשפים כל הזמן כימיקלים, קרינה, ומוצרי משנה מטבוליים המתרחשים באופן טבעי, אשר יוצרים סוגים ספציפיים של עלבונות DNA. סוכנים גנוטוקסיים יכולים לגרום נזק לעמוד השדרה של הדנ"א, לשבור אותו, או לשנות את האופי הכימי של בסיסים בודדים. בעקבות עלבון DNA, מסלולי תגובה נזק DNA (DDR) מופעלים חלבונים המעורבים בתיקון מגויסים. שפע של גורמים מעורבים בחישת סוג הנזק והפעלת תגובת התיקון המתאימה. כישלון בהפעלה נכונה וגיוס גורמי DDR יכול להוביל לחוסר יציבות גנומית, אשר בבסיס פתולוגיות אנושיות רבות כולל סרטן. מחקרים של חלבוני DDR יכולים לספק תובנות לתגובה לתרופות גנוטוקסיות ומנגנונים תאיים של עמידות לתרופות.

ישנן שתי דרכים עיקריות לדמיין חלבונים בvivio: תצפית ישירה, על ידי תיוג החלבון של עניין עם חלבון פלורסנט ואחריו על ידי הדמיה חיה, או חיסון עקיף על דגימות קבועות. בעוד הדמיה של חלבונים מתויגים פלורסנט מאפשר ניטור מדויק לאורך זמן, תיוג ישיר N- או C-terminus יכול להפריע למיקום מחדש של חלבון או פונקציה. התבוננות בחלבונים בגרסה אנדוגנית שלא שונה שלהם עדיפה. כאשר חלבוני תיקון DNA מגויסים עלבון ה-DNA, הריכוז שלהם גדל באופן מקומי והם יוצרים קבוצות, או "foci", שניתן לדמיין על ידי אימונו-לודיזם עקיף באמצעות נוגדנים ספציפיים.

למרות זיהוי של חלבון foci אינו מספק הוכחה מוחלטת של אינטראקציה ישירה, התאמה חברתית של חלבונים בתאים מצביעה על כך שהם להתארגן מחדש לאתר של נזק יכול להודיע על רצף האירועים הנדרשים להיווצרות מורכבת. ניתוח זהיר של חפיפה מרחבית foci בתאים המביעים סוג בר או גרסאות מוטנט של חלבון יכול לספק רמזים יקרים על תחומים פונקציונליים חשובים עבור פונקציית תיקון DNA. לבסוף, התאמה ישירה של חלבונים מצביעה על אינטראקציות ישירות אפשריות שניתן לאמת על ידי שיתוף ערך חיסוני בתאים, או משיכה ישירה באמצעות חלבונים מטוהרים.

מבוא

תאים אנושיים נחשפים כל הזמן למגוון של סוכני DNA מזיקים ממקורות שונים. מקורות אקסוגניים מורכבים בעיקר מחשיפה לקרינה, כימיקלים (כולל חומרים כימותרפיים וכמה אנטיביוטיקה), ווירוסים, בעוד המקורות האנדורניים העיקריים כוללים שגיאות בשכפול DNA ומתח חמצוני. ההשפעות הישירות של חשיפה גנוטוקסית יכול לנוע מבסיס שונה לשבור DNA קטלני פוטנציאלית דו גדיל (DSB), בהתאם ללחץ ואת מינון החשיפה. בסופו של דבר, נזק DNA לא מתוקן או שלא תוקן כהלכה יכול להוביל להצטברות של מוטציות, סידורים מחדש גנומיים, חוסר יציבות הגנום ובסופו של דבר להוביל קרסינוגנזה¹. תאים יונקים פיתחו מסלולים מורכבים כדי לזהות סוגים ספציפיים של נזק DNA^2,,

פרוטוקול

1. תרבות תאי HeLa

1. כיסויי זכוכית עגולים לפני טיפול עם 1 M HCl ב 50 מעלות צלזיוס במשך 16-18 שעות. לשטוף עם ddH₂O ולאחסן ב 100% ETOH.
2. הכן את תרבות התאים בינונית: הוסף 10% (v/v) FBS למדיום DMEM.
3. לגדול 4.0 x 10^{4 תאים} / גם בצלחת סטרילית 12-גם עם כיסוי זכוכית עגולה 18 מ"מ ב 37 ° C ו 5% CO₂ באינקובטור לח. לגדל תאים 80% confluency (כ 24 שעות).

2. טיפול בתא עם קרינה (IR)

1. כדי לגרום להיווצרות של הפסקות דו-גדיליות, לחשוף תאים 4 Gy ơ-eradiation (שליטה: אין הקרן, t = 0). בתא גמא -40, זה מתאים 4.54 דקות, ב 0.815 Gy לשעה.
2. דגירה תאים ב 37 °C ו 5% CO₂ באינקובטו....

תוצאות

ביום 2, או 24 שעות לאחר תאי זריעה על כיסויים, תאים עברו חלוקה אחת והם 80% confluent. דפיקות ספציפיות או מוטציות בחלבונים תיקון DNA יכול להגדיל את זמן ההכפלה, או לרגיש תאים לטיפול genotoxic, צפיפות זריעה, כמו גם מינונים טיפול צריך להיות מותאם בהתאם. כדי לקבוע את תנאי העבודה הטובים ביותר, ניתן לקבוע את התזמון של תגובת נזקי ה-DNA על ידי ההתנפחות המערבית של ωH2AX לאורך זמן, ורגישות להקרה ניתן לזהות על ידי מושבה ויוצרים assay.

תאים לא מטופלים עם תערוכת הקדמה מעט, אם בכלל, ơH2AX foci

דיון

ניתוח התזמון והיעילות של תיקון נזקי DNA על ידי מיקרוסקופיה הוכיח חיוני כדי להבין איך מכונות תיקון DNA מתפקדות, בתאים נורמליים בפתולוגיות אנושיות כגון סרטן.

הפיתוח של נוגדנים ספציפיים המאפשרים זיהוי של חלבונים פעילים בגרסה הזרחן שלהם (כגון ơH2AX, pRPA, pRAD50^{ואחרים 10,23,39,43)}שיחק תפקיד מרכזי בהשגת הבנה טובה יותר של תזמון תיקון DNA של אירועים וסנכרון שלה עם מחזור התא.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסה מימית של 16% (v/v) paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710	איכות המיקרוסקופיה של ה-PFA מבטיחה את התמונות הטובות ביותר. אם משתמשים ב"PFA תוצרת בית", יש לסנן לפני השימוש.
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A3059	שבר הלם חום מומלץ, כדי למנוע משקעים/רקע.
Coverglass #1, עגול 18 מ"מ (כיסויים)	Neuvitro	NC0308920	לנקות ולעקר את הכיסויים לפני השימוש, עם HCl או אתנול.
DMEM, גלוקוז גבוה [(+) 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, (+) L-גלוטמין, (-) נתרן פירובט]	Gibco	11965118	התאם את מצע הגידול לצרכי קו התאים המשמש.
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום	Gibco	14190144	PBS לתרבית רקמות.
אתילן גליקול-ביס(&בטא;-אתר אמינואתיל)-N,N,N&פריים;,N&פריים;-חומצה טטראצטית (EGTA)	מוצרי מחקר בינלאומיים	E57060	מאגר מיצוי גרעיני.
סרום בקר עוברי (FBS)	Life Technologies	104370028	ניתן להעריך את איכות ה-FBS על ידי בדיקת היווצרות מוקדי gH2AX. אם קיימים עקבות של אנדוטוקסין גנוטוקסי באצווה, gH2AX יהיה חיובי בהיעדר לחץ.
מגנזיום כלוריד (MgCl2)	מוצרי מחקר בינלאומיים	M24000	מאגר מיצוי גרעיני.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	מוצרי מחקר בינלאומיים	P40150	מאגר מיצוי גרעיני.
במקום זאת ב-SlowFade Diamond Antifade Mountant עם DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI עם VECTASHIELD Antifade Mounting Medium.
נתרן כלורי (NaCl)	מוצרי מחקר בינלאומיים	S23020	מאגר מיצוי גרעיני.
סוכרוז	מוצרי מחקר בינלאומיים	S24060	מאגר מיצוי גרעיני.
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות	פישרברנד	1255015	פוליסין ניתן להשתמש במקום.
צלחות באר מרובות שטופלו ב- TC, גודל 12 בארות	Costar	3513	זריעה על כיסויים נעשית בצלחת 12 בארות.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	מאגר מיצוי גרעיני.
במקום זאת באנזים TrypLE Express (1X), ללא פנול אדום	Gibco	12604021	טריפסין-EDTA.
בטריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום	Gibco	15400054	TrypLE במקום.

יש ניתן להשתמש ניתן להשתמש ניתן להשתמש