גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

סיכום

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

תקציר

תפוקה גבוהה להמרה ופרופיל אפיגנום דורש הכנה של תא יחיד או השעיית גרעין יחיד. הכנת ההשעיה עם תא או גרעינים שלמים כרוכה בדיסוציאציה ובחדירות, צעדים שיכולים להציג רעש לא רצוי ונזק בלתי רצוי. במיוחד, סוג תא מסוימים כגון נוירונים הם מאתגרת לנתק לתוך תאים בודדים. בנוסף, החדירות של הקרום התאי כדי לשחרר גרעינים דורש אופטימיזציה על ידי ניסוי ושגיאה, אשר יכול להיות זמן רב, עבודה אינטנסיבית ומבחינה כספית לא קיימא. כדי לשפר את החוסן ואת הגישה של הכנה לדוגמה עבור רצף תפוקה גבוהה, אנו מתארים אנזים מהיר ונטול כביסה בידוד גרעיני שיטת הבידוד. הפרוטוקול מאפשר בידוד יעיל של גרעינים מן המוח כולו דג בתוך 20 דקות. גרעין מבודד להציג מורפולוגיה גרעינית שלמים ונטייה נמוכה לצבור. יתר על כן, הזרימה cy, לנסות מאפשר העשרה גרעינים והרשאה של פסולת תאית עבור יישום במורד הזרם. הפרוטוקול, אשר צריך לעבוד על רקמות רכות ותאים מתורבתים, מספק שיטה פשוטה ונגישה עבור הכנה לדוגמה שניתן לשימוש עבור פרופיל תפוקה גבוהה, פישוט השלבים הדרושים עבור מוצלח של גרעין יחיד RNA-seq ו-ATAC-seq ניסויים.

מבוא

תא בודד RNA-seq (scRNA-Seq) ו-ATAC-seq הם כלי רב-תכליתי לחקר מערכות ביולוגיות מורכבות ברזולוציה של תא בודד. הם מנוצלים באופן נרחב כדי להגדיר תת תאים ומדינות, רשתות גנים כדי להעריך טרוגניות הסלולר. תנאי מוקדם לביצוע scRNA-seq הוא הכנת תא השעיה בודד על ידי הדיסוציאציה של רקמת. בשל הווריאציה של הרכב מטריצה החילוץ ותכונות מכניות, רקמות בודדות דורשות אופטימיזציה של פרוטוקול הדיסוציאציה להכנת השעיית תא בודד.

דיסוציאציה של רקמות לתוך תאים בודדים בדרך כלל כרוך טיפול עם אנזימי העיכול, כולל קולגן, dispase או טריפסין, ב 37 ° c^1,2,3,4. כאשר המכונות הטרסטיות נשארות פעילות ב-37 ° c, הדיסוציאציה האנזימטית יכולה להציג את הממצאים של mrna ביטוי ורעש^5,6. בעיקר, דגירה ממושכת יכול לגרום למתח התגובה הגנים ותגובת הלם חום באופן לא אחיד-המוביל לשונות טכנית בניסוי⁷.

עוד חיסרון של יצירת תא הבולם היחיד הוא הקושי להשיג תאים ושלמים של מסוג תא עם מורפולוגיות מורכבות. בפרט, נוירונים, אדיפוציטים ופודוקציטים מאתגרים לבודד^8,9,10,11. למשל, וו ועמיתיו הפגינו העדר פודוקציטים בscRNA פרופילים של כלייה של עכבר למבוגרים¹². מתצפיות דומות שאינן אופטימליות נעשו בנוגע להתאוששות של נוירונים מחוברים מרקמת^{8המוח 8,13,14}. בסיכום, פרוטוקולי דיסוציאציה יכולים להחדיר הטיית זיהוי לכיוון קל יותר לנתק סוגי תאים, המובילים לייצוג מוטעה של הארכיטקטורה התאית של האיבר.

כדי להתגבר על רעש טכני הטיה הציג במהלך הכנת לדוגמה ב-scRNA-Seq., בידוד ופרופיל הגרעין מספק חלופה אטרקטיבית. כמו מורפולוגיה גרעינית דומה בין סוגי תאים שונים, בידוד של גרעינים להקיף את הנושא של בידוד תאים שלמים וקיימא עם מורפולוגיות מורכבים. למשל, וו ועמיתיו הפגינו פרופיל מוצלח של podocytes הפקעיות עם גרעין יחיד RNA-Seq. (snRNA-Seq.) של כליה עכבר למבוגרים, אשר היה חסר scRNA-Seq¹². שליט, מחקרים השוואתיים בין תא יחיד ו-בודד בגרעין RNA-seq הציעו ירידה האינדוקציה של מתח והחום התגובה גנים עם snRNA-Seq¹². המחקרים נוספים מצביעים על קורלציה גבוהה בין הגנים המזוהים בשתי השיטות. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה על מיקרוגלייה האדם נכשל לזהות הפעלה גנטית במחלת האלצהיימר¹⁵. כך בהקשרים מסוימים, snrna-Seq הוא חלופה מתאימה עבור scRNA-seq^16,17. בנוסף, הבידוד הגרעיני יכול להיות מנוצל עבור תא יחיד ATAC-Seq., מתן מידע על האזורים של כרומטין פתוח בתוך תאים בודדים.

הפרוטוקול עבור בידוד גרעינים כולל שלושה שלבים עיקריים: i) מבוסס על אבקת כביסה של קרום התא כדי לשחרר את הגרעין; ii) רקמת הומוגון באמצעות מכשיר הומוגניזה; ו iii) העשרת גרעינים והסרת פסולת תא באמצעות הדרגתי צנטריפוגה או זרימה cy try^{18,19,20,21,22}. בין השאר, שני השלבים הראשונים תלויים בסוג הרקמה וצריכים להיות ממוטבים באופן אמפירי. תכשיר ניקוי מתון מוביל לקרע חלקי של קרום התא ולאחזור לא יעיל של גרעינים מרקמת²³. מצד שני, רמה גבוהה של חומרי ניקוי והומוגון קשה מוביל לקרע בקרום הגרעיני ולאבדן שלהם^24,25. גרעיני מקרע נוטים להתאחד וליצור אגרגטים, אשר אם לא יוסרו יכול להוביל לחפצים בניסוי הפרופיל במורד הזרם.

כדי לעקוף את הבעיות הקשורות לאופטימיזציה של חומרי ניקוי עבור בידוד גרעינים, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד גרעינים שלמים מדגימות טריות באמצעות שיטה נטולת כבלי ניקוי ומבוססת-עמודה. הפרוטוקול מניב גרעינים מאיבר שלם בתוך 20 דקות, ומגביל את האינדוקציה של התמלול העובדתי. גרעיני מבודד יכול להיות מועשר עם FACS עבור גרעין יחיד RNA-Seq. ו-ATAC-seq, מתן שיטה פשוטה ואוניברסלית המאפשרת פרופיל תפוקה גבוהה וללא החזקה.

פרוטוקול

כל ההליכים שהוצגו להלן בוצעו בהתאם למוסדות המוסדיים (אוניברסיטת ליברה בריסל (ULB)) והנחיות האתיקה הלאומית והבעלי החיים, שאושרו על ידי הוועדה האתית לרווחת בעלי חיים (סייבי) מאוניברסיטת ליברה דה בריסל (פרוטוקולים 578N-579N).

1. הכנה לפני ניתוח רקמות

1. הכינו 0.2% מהפתרון של טריקיין ב-PBS למען המתת החסד. לצנן את הפתרון על הקרח.
2. הכינו צלחת פטרי של 30 מ"מ לצורך הכנת הרקמה.
3. הכן קרח קר 1x PBS (10 מ ל לכל דגימת רקמה).
4. מצננים את הצנטריפוגה עד 4 ° c.
5. לבידוד גרעינים, השתמש בערכת לבידוד גרעינים ללא חומרי ניקוי (טבלת חומרים).
6. לפני תחילת הפרוטוקול, מאגר לפני הצינון A ו-B סיפק בערכה על ידי הצבת אותם על הקרח לפחות 30 דקות לפני הבידוד גרעינים.
7. לטיפול בגרעינים מבודדים, המעיל ריאגנטים פלסטיק כגון צינורות טיפים פיפטה עם 5% הפתרון BSA. בשביל זה, להכין את הפתרון על ידי המסת 2 גרם של BSA ב 40 mL של PBS. ציפוי פריטים פלסטיק עם 5% BSA מפחית את גרעין הדבקים פלסטיק. שלב זה מגביר את ההחלמה של גרעינים מבודדים.
8. מעיל את עצות הפיפטה על ידי ליטוף 5% הפתרון BSA 2-3 פעמים. מייבשים את הטיפים לשעתיים. להכין 10 טיפים פלסטיים לכל מדגם.
9. מעילים את הצינורות עבור אוסף של גרעינים על ידי מילוי אותם עם 5% BSA. היפוך הצינורות 3 פעמים כדי להבטיח ציפוי יעיל. הסר את הפתרון ואת האוויר-יבש את הצינורות הפוך על נייר טישו נקי במשך 2 שעות. לדוגמה, מעיל צינור אוסף אחד המסופק בערכה. בנוסף, הכינו מצופה צינורות 1.5 mL לאיסוף גרעינים לאחר FACS.
   הערה: עצות זכוכית הן חלופה מומלצת מאוד לעצות הפיפטה פלסטיק כדי למזער את הדבק.

2. חיתוך של מוח הדגים

1. למען המתת החסד של דג הזברבפיש, הכינו צלחת פטרי 90 מ"מ עם 25 מ ל של תמיסת הקרח קר Tricaine.
2. בזהירות, לקחת את הדגים מן הטנק באמצעות רשת דיג ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי.
3. המתת חסד הדג על ידי השארת אותו בטריקיין למשך 5 דקות.
4. הוא העלה את ראשו של החיה. עם סכין גילוח חדה
5. באמצעות מלקחיים, לשבור בעדינות לפתוח את הגולגולת ולהסיר רקמות רכות, עור ועצמות מהצד הגוחוני והרך של הגולגולת.
6. בעדינות, להעביר את המוח לתוך מאכל חדש 30 מ"מ המכיל קרח קר PBS.
7. הגבר את המוח לחתיכות קטנות באמצעות להב תער כדי להקל את טעינת המדגם על הטור ספין.

3. בידוד גרעינים בודדים

1. העבר את הרקמה הקצוצה למחסנית הפילטר המסופקת בערכת בידוד גרעינים והוסף 200 μL של מאגר קר כדי לרגישות הרקמה. לטחון את הרקמה באמצעות מוט הפלסטיק המסופק על ידי הערכה עבור 2 דקות.
2. הוסף 300 μL של מאגר קר A ומארג את מחסנית המסנן על הקרח עם כובע פתוח במשך 10 דקות.
3. כסה את המחסנית והשהה מחדש את הרקמה על-ידי היפוך הצינורית 5 פעמים.
4. צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 30 s. בשלב זה, התאים מתבקגים כאשר עוברים דרך המסנן ומוחלים כוח צנטריפוגלי במהירות גבוהה. הזרימה מכילה גרעינים שלמים, הנמצאים בתחתית הצינורית.
5. להיפטר המסנן ולהשעות מחדש את הגלולה על ידי vortexing במרץ עבור 10 s.
6. גלולה הגרעין על ידי תפרידו את הפתרון ב 500 x g עבור 3 דקות. להיפטר supernatant בזהירות כמו הגלולה גרעיני הוא חסר צבע.
7. השהה מחדש את הגלולה ב 0.8 mL של מאגר קר B ו צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות. בשלב זה, הגרעינים מופרדים פסולת קרום. הגלולה חסר הצבע המתקבל מכילה גרעינים מבודדים.
8. השהה מחדש את הגרעינים המבודדים ב-500 μL של PBS עם 5% BSA. לשמור על גרעיני ההשעיה על קרח לבצע FACS לאחר כימות.

4. הדמיה של מורפולוגיה של גרעינים

1. מאשרים מורפולוגיה גרעינית. על ידי כתמים מואכסט בשביל זה, להסיר את 100 μL של גרעין יחיד ההשעיה בצינור חדש באמצעות מצופה BSA טיפים. כדי להכתים את הגרעינים, להוסיף 0.1 μL של הואכסט (1 מ"ג/mL). . הצינור מערבולת בעדינות
2. להעביר את ההשעיה גרעינים לצלחת התחתונה זכוכית עבור הדמיה.
3. תמונה של גרעיני באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית עם עירור הגדרות לייזר של ~ 405 ננומטר (סגול) אורך הגל.

5. מבוסס FACS העשרת גרעינים

1. לפני ביצוע facs, לסנן את גרעיני באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר לתוך צינור מצופה bsa.
2. לדלל את ההשעיה מסוננים על ידי הוספת PBS עם 5% BSA לנפח הסופי של 1,000 μL.
3. התווית 2 עגול התחתון FACS צינור כמו ' בקרת ' ו ' ויטראז '. השפופרת ' שליטה ' יכיל גרעיני בלתי מוכתם, בעוד הצינור ' ויטראז יהיה הופסט גרעיני ויטראז '.
4. העברת 250 μL של גרעיני ההשעיה לתוך שפופרת ' שליטה ' באמצעות מצופה BSA בקצה הצנרת.
5. העבר את הפתרון הנותר 750 μL לצינור FACS המסומן כ ' ויטראז ' ולהוסיף 1 μL של צבע Hoechst כדי להכתים את הגרעינים. מערבבים על ידי איטי הורטקסנג.
6. טען את דגימת הבקרה הבלתי מוכתמת לסדרן התאים. . להקליט 5000 אירועים
7. לטעון את דגימות מוכתם ולהקליט 5000 אירועים.
8. ציירו שערי FACS המאפשר זיהוי של גרעין יחיד. גרעינים ניתן לבחור על ידי השוואת אות הזריחה הופסט בין שליטה ומוכתם דגימה.
9. מיון Hoechst גרעיני חיובי מן הצינור המוכתמת לתוך צינור 1.5 mL חדש המכיל 50 μL של PBS עם 5% BSA.
   הערה: ניתן לאסוף גרעינים מבודדים לתוך המדיום הרצוי בהתאם לדרישות האפליקציה במורד הזרם.

תוצאות

-הפרוטוקול המתואר לעיל שימש להפקת גרעין יחיד ההשעיה ישירות מרקמת המוח דג זברה. הבידוד דורש בדרך כלל 20 דקות ולהימנע משימוש בחומרי ניקוי או באנזים העיכול. סכמטי המסכם את הצעדים הבודדים של הפרוטוקול מסופק באיור 1, אשר ניתן להדפיסו כדי לשמש להדרכה.

איור 1: סכמטית של שיטת ניקוי-עמודות ללא כביסה לבידוד גרעינים.
ייצוג גרפי של הצעדים הבודדים שבוצעו במהלך הפקת גרעינים מרקמת המוח הטרייה של הדגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ויזואליזציה של מורפולוגיה גרעינית

לקבלת אישור איכותי של המבנה הגרעיני, הגרעין המבודד הוכתם במוסט ודמיינו שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הגרעין הופיע ללא פגע, עגול ומופרד היטב (איור 2). וחשוב מכך, צבירה גרעינית, סימן. לקרע בקרום הממברנה, נעדר

איור 2: גרעינים בודדים בידוד מן המוח דג זברה.
. מפגינים שלמים סרגל קנה מידה: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

העשרת מבוססי FACS של גרעין שלם

העשרה של גרעינים מבודדים והסרת פסולת סלולרית בוצעה על ידי הcy, הזורם באמצעות הזרימה על נוכחות של אות של זריחה הופסט. האות Hoechst זוהה על עירור עם סגול, 405 nm, לייזר (סגול מבריק 421 – BV421). גרעיני בלתי מוכתם הציג ברקע ניאון (איור 3a, המשלים איור 1a), בעוד גרעיני מוכתם הציגו אות פלורסנט חזק (איור 3A, המשלים איור 1a). כפי שמודגם באיור 3C, המוכתמים והגרעינים המוכתמים הופולסט היו הפרדה היטב בערוץ הסגול.

איור 3: גרעינים מבודדים להציג אות פלורסנט הופסט חזק וספציפי בזרם cy, הזרמה.
חלקות היסטוגרמה להשעיית גרעינים בודדים המציגה את התפלגות ההכתמים. Hoechst נרגש על ידי סגול, 405 nm, לייזר (סגול מבריק 421 – BV421). הדגימה הבלתי מוכתמת (A) מציגה אות בטווח של 10⁰-10³, בעוד כופסט גרעיני ויטראז (ב) פולטים אות בטווח 10³-10⁵ . כיסוי של עוצמה פלואורסצנטית הנפלטת מדגימות בלתי מוכתמות (אפורות) ומוכתמות (C) מדגים הפרדה ברורה בין שתי האוכלוסיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: הזרימה cy, try האסטרטגיה עבור גרעינים מבודדים. מגרשים מייצגים עבור השעיית גרעינים מבודדים. גרעיני מבודד נותחו באמצעות פיזור קדימה וסגול לייזר BV421 אשר מלהיב Hoechst ב 405 nm. הדגם הבלתי מוכתם (A) המוצג BV421 אות^{בטווח 10-103} . מתוך 13130 אירועים, האירועים 141 זוהו כגרעין יחיד המבוסס על FSC-A (1.07% של סך הכל), ו 0 אירועים עבור גרעיני בלתי מוכתם מבוסס על אות BV421 (0% בסך הכל). הואכסט גרעינים ויטראז ' (ב) הציגו אות BV421 בטווח 10³-10⁵ . מתוך 50000 אירועים, האירועים 2418 זוהו כגרעין יחיד המבוסס על FSC-A (4.84% של סך), ו 2414 אירועים עבור גרעיני Hoechst מבוסס על BV421 אות (4.83% of סך). אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

דיון

יצירת פרופיל הטרנססקריפט ואפיגנום ברזולוציה של תא בודד יש מהפכה במחקר של מערכות ביולוגיות. מחקרים ברזולוציה של תא בודד לרקמה מוצקה תלויות בדיסוציאציה של האיבר לתאים בודדים או לגרעינים. דיסוציאציה היא הליך הרסני שיכול להציג ממצאים טכניים, אשר יכולים למנוע פיתוח של ייצוג מדויק של המערכת^5,6. למשל, הדיסוציאציה האנזימטית יכולה לפגוע בתאים עם מורפולוגיות מורכבות, כגון נוירונים או פודוקציטים, ויכולים לגרום לביטוי למתח ולתגובה בהלם חום גנים^7,12. בנוסף, שימוש בתכשיר ניקוי במהלך הדיסוציאציה יכול לקרוע את הקרום הגרעיני ולהוביל לצבירה^23,25. לפיכך, אופטימיזציה של הדיסוציאציה להשגת תא בודד או השעיית גרעינים באיכות הגבוהה ביותר היא החשובה ביותר להצלחה של ניסויים בתפוקה גבוהה של פרופילים.

כאן, אנו מדגימים שיטת ניקוי ובידוד גרעיני האנזים מאפשר חילוץ של גרעינים שלמים ממוח דג זברה בתוך פחות מ 20 דקות. הפרוטוקול מניב גרעינים עם מורפולוגיה טיפוסית ושלמות איתנה (איור 2). ממוח בודד דג זברה במשקל 6 מ ג, הפרוטוקול מניב סך של 60,000 גרעינים הנקבעים על ידי ספירת הומוציטוטומטר. גרעיני מבודד יכול להיות מנוצל עבור יישומים מרובים במורד, כולל snRNA-seq, ATAC-seq ו חיסוני. הגרעין המבודד עשוי לכלול מזהמים משברים cytoplasmic, במיוחד מרכיבים של רשתית העין והמיטומינציה. מומלץ מאוד לערוך ניסויים ביצירת פרופילים בעלי תפוקה גבוהה, סיווג של פסולת תאית, בעיקר מיטוכונמיטוa. Cy,באיור 3, מספק אפשרות מעשית לטיהור גרעינים. לחילופין, מעבר שיפוע הסוכות יכול להיות מנוצל גם לסילוק פסולת.

הפרוטוקול נבדק על בלוטת התריס העכבר (נתונים לא מוצגים) ומספק תוצאות בדומה לרקמת המוח דג זברה. בסך הכל, הפרוטוקול מספק שיטה איתנה, מסייעת ואוניברסלית להכנת השעיית גרעין יחיד, המסייעת לפשט את הלוגיסטיקה לניסויים ביצירת פרופילים בעלי תפוקה גבוהה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום בקר (BSA)	קארל רוט	90604-29-8	שבר אלבומין V
סדרן תאים	BD Biosciences		FACSAria III
צנטריפוגה	Sartorius	A-14C
שפופרות אפנדורף (1.5 מ"ל)	Eppendorf	22363204
Falcon (15 מ"ל)	צינורות צנטריפוגה
פלקון (5 מ"ל	קורנינג	352052	פוליסטירן מבחנות תחתונות עגולות
מלקחיים עדינים	Fine Science Tools	11295-10
מסננת תאים Flowmi (40 μ m)	סיגמא	BAH136800040
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Leica	DMI6000 B
בקבוק זכוכית (250 מ"ל)	VWR	215-1593
צלחת עם תחתית זכוכית	World Precision Instruments	FD3510-100	פלואורודיש 35 מ"מ
פיפטות פסטר זכוכית	VWR	612-1701
שקע פיפטה זכוכית	קארל רוט	388.1	משאבת pi-pump עזר לצנרת 2500
תמיסת צבע מכתים של Hoechst	Abcam	ab228551	Hoechst 33342
ערכת בידוד גרעינים ללא חומרי ניקוי	להמציא Biotechnologies	NI-024
PBS (10X)	צלחת פטרי ThermoFisher	70011069
(30 מ"מ)	צלחת פטרי FisherScientific	11333704	(
90 מ"מ)	קורנינג	758-10178-CS	טיפים לפיפטה גוסלין
	VWR	89079	10 μ L, 200 ו-mu; L, 1000 μ L
Pipettes	Gilson	F167380	Pipetman
סכין גילוח	Swann-Morton	7981809
טריקאין מתאן סולפונאט	Sigma	E10521
מכונת מערבולת	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2