השגת אוסטיאוציטים ראשוניים באמצעות שבר קלוואריאלי מוריני של אוסטיאוציטים המבטאים GFP

סיכום

פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של קלבריה עכברית dmp1-topaz בילוד ובידוד של אוסטיאוציטים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באמצעות עיכול ושבירה של תאים, בנוסף להכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).

תקציר

האוסטאוציט, שבעבר נחשב לתושב פסיבי של העצם בהתחשב בתפקוד מאחורי הקלעים של חישת עומס מכני, מובא כעת לאור הזרקורים והוכח שיש לו פונקציות עיקריות רבות כמו שינוי פעיל של המטריצה החוץ תאית ויצירת איבר אנדוקריני עם המערכת הלאקונקנאליקולרית התוחמת אותו ושולח הודעות לאתרים מרוחקים. הודות לשיטות שאפשרו לבחון את האוסטיאוציטים במבחנה מבידוד אוסטיאוציטים ראשוניים לשורות תאים דמויי אוסטיאוציטים, אוסטיאוציטים חווים כעת עניין מהדהד ונחשול של ידע על מבנה ותפקוד. היבטים רבים של הביולוגיה של אוסטיאוציטים ואינטראקציה עם רכיבים מולקולריים אחרים עדיין לא התגלו. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את הבידוד היעיל של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz, המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באוסטיאוציטים, באמצעות שבירת תאים ולאחר מכן רכישת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים על ידי FACS.

מבוא

אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים מאבות אוסטאובלסטיים שהוטמעו במטריצה המופרשת שלהם¹. הם התאים הנפוצים ביותר ומאריכי החיים ביותר בקרב אוכלוסיות תאי עצם. הם שוכנים בתוך לאקונה ויש להם מורפולוגיה סטלטלית אופיינית עם דנדריטים המשתרעים דרך ערוצים הנקראים canaliculi ויוצרים רשת נרחבת של תקשורת וחילופי חילוף חומרים עם סביבתם ומשטח העצם². אוסטיאוציטים כוריאוגרפים הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים תפקידים בעיצוב מחדש של העצם, הם התאים המכנו-סנסוריים העיקריים המעניקים הסתגלות לעומס מכני³, מעורבים בהומאוסטזיס פוספט⁴ ובמינרליזציה של מטריצת עצם⁵, ויחד עם המערכת הלאקונקנאליקולרית, הם פועלים כאיבר אנדוקריני המאותת לרקמות מרוחקות⁶.

אוסטיאוציטים ממוקמים בתוך מטריצה מינרלית, המגבילה את הנגישות והופכת את בידודם למאתגר, ובכך מעכבת חקירה חוץ גופית. אחת משיטות הבידוד הראשונות תיארה אוסטיאוציטים מבודדים מקלבריה עוף באמצעות נוגדן חד-שבטי ספציפי לאוסטאוציטים (OB7.3)⁷ אשר מאוחר יותר נודע כגרסה העופות של PHEX (גן מווסת PHosphate עם הומולוגיה לאנדופפטידאזות על כרומוזום X)⁸. חוקרים אחרים השתמשו בעיכול רציף של חולדה 9 או עכבר 10 עצמות ארוכות כדי להשיג שברים עשירים באוסטיאוציטים שבהם דווח על טוהר אוסטיאוציטים בסביבות⁷⁰%⁹. מגבלות הליך זה כוללות את הטוהר התת-אופטימלי של תרביות מזוהמות בסוגי תאים אחרים מלבד אוסטיאוציטים, וכי אוסטיאוציטים עלולים להיות מגודלים על ידי תאים אחרים בתרבית מכיוון שאוסטיאוציטים איבדו את היכולת להתחלק. אתגרים אלה מגבילים את השימושיות של תרבויות ארוכות טווח.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו קווי תאים אוסטיאוציטים שונים. קו התאים MLO-Y4¹¹ וקו התאים MLO-A5¹² הם בעיקר קווי התאים הנחקרים ביותר אשר שימושיים לחקר אוסטיאוציטים בשלב מוקדם; עם זאת, הם פחות שימושיים לחקר איתות אוסטיאוציטים בוגר מכיוון שהם מבטאים רמות נמוכות של סקלרוסטין ו- FGF23¹³, שניהם סמני אוסטיאוציטים בוגרים. קווי תאים אחרים, כולל IDG-SW3 14 ו- Ocy454¹⁵, מבטאים רמות גבוהות של סקלרוסטין ו- FGF23 ושימושיים בחקר שלב האוסטיאוציטים המאוחר. קווי תאים מתגלים ככלי מחקר שימושי; עם זאת, הם אינם באים ללא מגבלות מכיוון שהם אינם מייצגים באופן מלא את הביולוגיה של התא הראשוני. קווי תאים שונים מייצגים שלבים התפתחותיים שונים של ספקטרום הבשלות של אוסטיאוציטים, וקווי תאים אינם מייצגים את ההטרוגניות של אוסטיאוציטים ראשוניים^16,17.

כדי להשיג תרביות טהורות של אוסטיאוציטים ראשוניים, החוקרים ניצלו את מודל עכבר CRE שבו מקדם dmp1 של 8-kb משמש להנעת ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באוסטיאוציטים^18,19. עכברים טרנסגניים כפולים (pOB-Col 2.3- GFP-cyan ו- DMP1-GFP-topaz) על ידי Paic et ^al.19 ועכברים טרנסגניים dmp1-topaz על ידי Nakashima et ^al.20 שימשו להשגת אוכלוסיות אוסטיאוציטים. שבו הם השתמשו בעיכול רציף ו- FACS של אוסטיאוציטים המבטאים GFP כדי לרכוש תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים ^19,20. כיוון ה-cre בעכבר הכתב Ai9 של 10 קילו-בתים dmp1, המפעיל את חלבון tdTomato, הוכח כקיים באוסטיאוציטים, אוסטאובלסטים, שרירים ותאים בתוך מח העצם. למקדם dmp1 של 8 קילובייט הייתה תבנית ביטוי זהה, אך רק חלק מהאוסטאובלסטים ותאי מח העצם ביטאו את החלבון, מה שמצביע על כך שמקדם dmp1 של 8 קילובייט הוא ספציפי יותר²¹. למרות זאת, יש לפרש בזהירות את התוצאות המתקבלות באמצעות מקדם dmp1 8-kb, ופרופילי ביטוי גנים צריכים להתבצע באופן שגרתי באמצעות סמנים ספציפיים לאוסטאובלסטים לעומת אוסטאובלסטים כדי להבטיח שהאוכלוסייה המתקבלת היא בעלת טוהר גבוה מספיק.

סמני אוסטאוקלסט OSCAR ו- Dcstamp נמצאו באוכלוסיות אוסטיאוציטים לא מדולדלים לעומת אוכלוסיות אוסטיאוציטים מדולדלות, ממצא זה הוביל את המחברים למסקנה כי תקצירים המתקבלים משברים של 8-kb dmp1-topaz קלבריה יילודים ומיון GFP מזוהמים בתאים המטופויטיים. ניתן היה למתן את הזיהום בתאים המטופויטיים על ידי הידוק שער המיון של GFP, מאחר שלתאים המטופויטיים חיוביים ל-GFP הייתה עוצמת GFP נמוכה באופן סביר מאשר לתאים מזנכימליים חיוביים ל-GFP (אוסטיאוציטים)²².

השיטות לחקר אוסטיאוציטים במבחנה תרמו לעושר המידע האחרון על ביולוגיה של אוסטיאוציטים. עם זאת, בידוד אוסטיאוציטים נותר הליך עתיר עבודה וארוך עם תפוקת תאים נמוכה. השיטה המתוארת של עיכול עצם באמצעות collagenase ו EDTA לעתים קרובות עד חלק 8²³, לוקח כמה שעות שבהן כדאיות אוסטיאוציטים הוא מס. חוקרים דיווחו על שימוש בשברים (2\u20125) למיון תאים 20, והראו כי פרופיל הביטוי של גנים הקשורים לאוסטיאוציטים לעומת אלה של אוסטאובלסטים מאשר את ההצלחה של בידוד אוכלוסיות אוסטיאוציטים טהורים²⁰. במאמר זה נתאר את תהליך קבלת השברים (2\u20125), ונשווה את תפוקת האוסטיאוציטים מכל שבר החל משבריב 1 עד 8 כדי לקבוע את חזרתם של אוסטיאוציטים בכל שבר. אנו מתארים גם את הדיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד ועיכול קלווריאלי באמצעות collagenase וחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), כמו גם הכנת תאים עבור FACS.

פרוטוקול

כל ההליכים והטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של אוניברסיטת טוהוקו.

1. דיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד

1. עבור פרוטוקול זה, השתמש בגורים בני 6\u20127 של עכברי C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. הרדימו עכברים עם שאיפת איזופלורן 5% ולאחר מכן העבירו את הגורים לאתנול 70%.
2. העבירו את הגור שעבר המתת חסד לצלחת תרבית לא מטופלת.
3. בעזרת מספריים ופינצטה, לתפוס את העור בבסיס הגולגולת ולעשות חתך.
4. באמצעות החתך הראשון כנקודת מוצא, לחתוך משני הצדדים הרוחביים של הגולגולת מול האוזניים, להסיר את העור, ולחשוף את calvaria.
5. החזיקו את הראש מגשר האף וחתכו את הקלבריה לאורך תפר הלמבדואיד. חותכים לאורך הקצוות הרוחביים של עצמות הקודקוד ומרחיבים אותו כך שיכלול את החלק הקדמי.
6. להפריד את calvaria מרקמת המוח הבסיסית.
   הערה: כדי להבטיח קלבריה גרמית נקייה עם חיבור רקמות רכות מינימלי לא לחתוך עמוק לתוך העצם; לשם השוואה, אדם צריך להיות מסוגל לראות את הצל של המספריים מתחת לעצם.
7. מעבירים את הקלבריה לתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4 לאורך כל הפרוטוקול). ודא שהחלק הקעור פונה כלפי מעלה.

2. שבירה של קלבריה עכבר שזה עתה נולד

1. מעבירים עד 5 קלבריה לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת קולגנאז 2 מ"ג/מ"ל. יש להשתמש בתמיסת collagenase טרייה שהוכנה ממש לפני השימוש.
   1. להכנת תמיסת collagenase טרייה, יש להוסיף אבקת collagenase למאגר בידוד (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM סורביטול,₃ mM K 2 HPO₄, 1 mM CaCl 2, אלבומין בסרום בקר 1 מ"ג/מ"ל (BSA), 5 מ"ג/מ"ל גלוקוז ו-25 מ"מ HEPES) במינון₂מ"ג/מ"ל. ממיסים את אבקת הקולגנאז על מערבל מגנטי.
   2. הפעל את תמיסת הקולגנאז דרך יחידת מסנן סטרילית של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל ושמור אותה על קרח לאורך כל הפרוטוקול.
2. לדגור את calvaria ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד כדי לקבל חלק 1.
3. השליכו את העיכול של חלק 1, שטפו את הקלבריה עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) והשליכו את השטיפה.
4. לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של 5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS, PH 7.4 ב 37 ° C במשך 15 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.
5. לאסוף את digest בצינור חרוטי 50 מ"ל. לשטוף את calvaria עם 5 מ"ל של PBS ולהוסיף את פתרון לשטוף לעכל.
   הערה: בכל נקודה של איסוף העיכול והשטיפה, פיפטה של העצמות בתמיסה שלהם כדי לנתק את התאים מהעצם ולמנוע כפילויות וצברי תאים.
6. כדי להשיג חלק 2, צנטריפוגה את העיכול ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה ב-8 מ"ל של α-Minimum Essential Medium (MEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 IU/מ"ל פניצילין G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. זרעו על צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ. לדגור על חלק 2 ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
7. לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.
8. כדי לאסוף את מקטע 3, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 3 ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
   הערה: בשלב זה, העצמות יהפכו קטנות יותר, והן יצטמצמו לרסיסים. כדי להבטיח שאף עצם לא יישאב בטעות לתוך העיכול, מה שמוביל לאובדן תאים בתהליך, השתמשו בפיפטת קצה קטנה לאיסוף העיכול (1000\u2012200 μL פיפטה קצוות).
9. לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.
10. כדי לאסוף את מקטע 4, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 4 ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
11. לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של 5 mM EDTA המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS (pH 7.4) ב 37 ° C במשך 15 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.
12. כדי לאסוף את מקטע 5, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 5 ב 37 ° C תחת 5% CO₂. אוסטיאוציטים יכולים להיות מוכנים למיון באותו יום או בתרבית עד 24 שעות לפני המיון.

3. הכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי

1. שאפו את המדיום של כל חלק תא ושטפו בעדינות עם 10 מ"ל PBS פעמיים.
2. הוסף 5 מ"ל של 0.5% טריפסין-EDTA ב- PBS ודגור על התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C. הוסף 5 מ"ל של 10% FBS α-MEM ופיפטה כדי לנתק את התאים בעדינות. שלב את התאים בכל שבר על ידי סינון דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.
3. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS ולאסוף על ידי סינון דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
4. שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 10% FBS α-MEM לכדור. התאם את ריכוז התא לכ- 1 x 10⁷ תאים/מ"ל.
5. סנן את התאים בצינור רשת ניילון בגודל 35 מיקרומטר. התאים מוכנים כעת ל- FACS.
6. עבור פרוטוקול זה, השתמש בפייה בגודל 100 מיקרומטר. נוזל האיסוף צריך להיות מורכב מ -10% FBS α-MEM. יש לשמור את הדגימה ממוינת בטמפרטורה של 4°C בכל המיון, במידת האפשר.
7. לפני המיון, מטב את ה- gating להסרת לכלוכים ותאים על-ידי התאמת אזור הפיזור הצדדי (SSC) ואזור הפיזור הקדמי (FSC). בטל כפילויות על-ידי התאמת רוחב SSC לעומת גובה SSC ואזור FSC לעומת רוחב FSC. יש להשתמש באוסטיאוציטים שליליים של GFP כבקרה להתאמת הפרמטרים של מכשיר המיון.
8. לאחר השלמת איסוף התאים, צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. לשטוף תאים עם PBS. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
9. השעה מחדש את התאים והתאם את המספר לפי הצורך באמצעות 10% FBS α-MEM.

תוצאות

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את התהליך של קבלת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz באמצעות תהליך שבר באמצעות collagenase כדי לפרק את מטריצת הקולגן ו- EDTA עבור כלציית סידן, ולאחר מכן תאים מוכנים ל- FACS כדי להפריד אוסטיאוציטים מאוכלוסיות תאים אחרות.

שיטות להשגת אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה עכברית ילודים מתארות לעתים קרובות את השימוש בשברים (1\u20128) למיון²³. כדי לבחון את יעילותה של שיטה זו, השווינו את תפוקת האוסטיאוציטים שהתקבלו מקלבריה אח...

דיון

האוסטיאוציטים המבודדים הראשונים היו מקלבריה עוף⁷ שבודד באמצעות (OB7.3) או הגרסה העופית של PHEX; עם זאת, שיטה זו מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים מעשיים, כמו נוגדנים ספציפיים אוסטיאוציטים כי הם גם ספציפיים specie צריך להיות מיוצר. החוקרים השתמשו בשינוי שונה של התהליך האנזימטי הרציף כדי לקבל אוסטיאוציטים מעצמות ארוכות של עכברים וחולדות; הטוהר המדווח של תרבויות אלה נקבע על כ-70%⁹. פיתוח מודל עכבר ה-cre איפשר הנדסת אוסטיאוציטים, המבטאים GFP על פני השטח שלהם. מודל עכבר זה, יחד ע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BD FACSDiva תוכנה	BD Biosciences		רכישת נתונים וניתוח BD
Falcon Tube	BD Biosciences	352235	צינור 12 x 75 מ"מ עם מכסה מסננת תאים, 35 μ M רשת ניילון.
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב
קולגנאז	וואקו, אוסקה, יפן	034-22363	0.2% (w/v), תערובת קולגנאז גולמית שמקורה ב-C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, קומאמוטו, יפן		5mM EDTA מוכן עם 0.1% BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
סרום בקר עוברי (FBS)	Biowest, Nuaillé, צרפת
מאגר			70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM סורביטול, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) גלוקוז ו-25 מ"מ יחידת מסנן סטרילית HEPES
Millex	Merck Millipore, אירלנד	SLGV033RS	0.22μ m
מסננת תאי ניילון	FALCON, NY, USA		40μ m
Trypsin-EDTA	Life Technologies, ניו יורק, ארה"ב		0.5% x10. מדולל ל-x1 ב-PBS
α-MEM	Wako, אוסקה, יפן		מכיל 10% סרום בקר עוברי, 100 IU/ml פניצילין G ו-100 μ גרם/מ"ל סטרפטומיצין

בידוד