מאמר שיטה

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

7.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61525

⸱

6 באוגוסט 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genome Biology of Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Applied Genomics for Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 3Department for Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research, University of Tübingen

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מראים את האוטומציה של תרבויות תאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSC) הנגרמים על ידי בני אדם ובדיונים עצביים התואמים להדמיה וניתוח אוטומטיים.

תקציר

תרבות ידנית ופרוטוקולי בידול עבור תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSC) קשים לסטנדרטיזציה, להראות שונות גבוהה ונוטים הבידול ספונטני לסוגי תאים לא רצויים. השיטות הן עתירות עבודה ולא ניתן יהיה להגיע בקלות לניסויים בקנה מידה גדול. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו מערכת אוטומטית של תרבות תאים בשילוב מערכת הדמיה בתפוקה גבוהה ויישמנו פרוטוקולים לשמירה על קווי hiPSC מרובים בידול מקביל ונוירונאי. אנו מתארים את האוטומציה של פרוטוקול בידול לטווח קצר באמצעות Neurogenin-2 (NGN2) ביטוי יתר כדי לייצר נוירונים קליפתיים נגזר hiPSC בתוך 6\u20128 ימים, ואת היישום של פרוטוקול בידול לטווח ארוך כדי ליצור hiPSC נגזר midbrain דופאמין נוירונים בתוך 65 ימים. כמו כן, יישמנו את הגישה NGN2 לתאים מבשר עצביים נגזר מולקולה קטנה (smNPC) המושרה עם GFP lentivirus והקמנו תא חי אוטומטי neurite outgrowth assay. אנו מציגים מערכת אוטומטית עם פרוטוקולים המתאימים לתרבות hiPSC שגרתית ובידול לנוירונים קליפתיים ודופאמין. הפלטפורמה שלנו מתאימה לתרבות ללא ידיים לטווח ארוך ולתרכובת מבוססת hiPSC מבוססת תפוקה גבוהה/בעלת תפוקה גבוהה, הקרנות RNAi ו-CRISPR/Cas9 לזיהוי מנגנוני מחלות חדשניים ויעדי סמים.

מבוא

תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSC) מתחדשים באופן עצמאי, יכולים להבדיל כמעט בכל סוג תא בוגר. מאפיינים אלה הופכים hiPSC כלי שימושי עבור מידול מחלות במחקר בסיסי וגילוי סמים1. IPSC האנושי שומר על הרקע הגנטי התורם המאפשר נגזרת סוגי תאים רלוונטיים למחלות המושפעים ביותר / מעורבים כמובן המחלה, למשל, תת סוגים עצביים שונים למחלות ניווניות2,3. כמו כן, hiPSC מתגבר על חלק מהמגבלות של בעלי חיים ותאי מודלים ביטוי יתר על ידי מודלים של מחלות בהקשר אנושי ורמות ביטוי חלבון פיזיולוגי, והוכיחו להיות נכס בעל ערך במחלות מידול החל הפרעות מונוגניות, מורכבות ואפיגנטיות, כמו גם מחלותבשלב מאוחר 4.

למרות יתרונות והזדמנויות אלה, מספר מגבלות של hiPSC עדיין צריך להיות מטופל. פרוטוקולי התרבות והבידול הנוכחיים של hiPSC אינם חסכוניים, קשים לסטנדרטיזציה ועתירי עבודה. שלבי תרבות ידניים יכולים לגרום לשונות גבוהה בתשואות ופנוטיפים בשל הבדלים בצמיחה ובדידול ספונטני של hiPSC. לכן, יש להפחית את הווריאציה התלויה בניסוי על-ידי יישום טכניקות טיפול מתוקנות יותר ופשט פרוטוקולים שניתן להשיג באמצעות אוטומציה5. הקמת פרוטוקולי תרבות ובידול אוטומטיים של hiPSC תגדיר סטנדרטים משותפים הן לפרויקטים אקדמיים והן לפרויקטים של מחקר תעשייתי, ותאפשר יצירת מודלים רלוונטיים ביולוגית של מחלות ותוצאות רבות יותר לשחזור.

עבודה קודמת ניסתה אוטומציה של תרבויות hiPSC 6,7,8, אבל הפרוטוקולים שלהם הוגבלו לתבניות ספציפיות של צלחת תרבות תא התלויה במערכת וחוסר יכולתהסתגלותלפורמטים שונים של תבניות ציון. מערכות כאלה שימושיות ב bulking של תאים, אבל לא יכול להיות מתאים בידול אוטומטי לסוגי תאים רצויים, phenotyping מחלה, ותוחלת ההקרנה. בנוסף, פלטפורמה אוטומטית בקנה מידה גדול עבור נגזרת פיברובלסט, דור hiPSCובידול תואר 9 אבל בקנה מידה שניתן להשיג רק על ידי מעבדות בתפוקה גבוהה המוקדש לייצור קווים אשר נראה אטרקטיבי אבל יכול להיות לא סביר עבור מעבדות אקדמיות רבות.

פיתחנו מערכת תרבות תא אוטומטית לחלוטין המבוססת על תחנת טיפול בנוזלים בסביבה מסוננת של חלקיקולט (HEPA) עם אינקובטור CO2 בעל קיבולת גדולה, ציטומטר הדמיה בשדה בהיר וזרוע רובוטית להובלת לוחות. רכיבים אלה מספקים את הבסיס לתרבות ובידול של hiPSC יציבים ותו לא. השלמנו את המערכת עם מערכת אחסון אוטומטית של -20°C לאחסון מורכב או וירוסים ותמונה במהירות גבוהה של תא חי בדיסק מסתובב. פרוטוקולים מותאמים אישית נוצרו המאפשרים זריעת תאים אוטומטית, שינויי מדיה, בדיקות קונפלואנציות, הרחבת תאים ויצירת לוחות תסה עם טיפול לדוגמה והדמיית לוח, מה שהופך את המערכת תואמת להקרנות בתפוקה גבוהה/בתפוקה גבוהה. מערכת תרבות התאים וההדמיה האוטומטית מופעלת באמצעות תוכנת השליטה וממשק המשתמש הגרפי (GUI) בהתאמה אישית. ה- GUI מאפשר למשתמשים לייבא קבצי CSV המכילים פרמטרים ספציפיים לקו התא הדרושים לביצוע פעולת שירות. בנוסף, GUI מאפשר לתזמן ניסויים רבים בכל רצף באמצעות תצוגת לוח השנה המוכלל ובכך מאפשר שליטה מלאה של הזמן שבו כל שיטה מתחילה.

מערכת תרבות התאים האוטומטית שלנו משתמשת במהירויות צנרת מתוקנן, זמני מעבר, סף confluency, צפיפויות זריעה, ונפחים בינוניים עם הגמישות לתאי תרבות במגוון פורמטים של לוחות (96-, 48-, 24-, 12-, 6- או 1-פורמט צלחת). התאמנו פרוטוקול בידול לטווח קצר שפורסם לאחרונה להמרת hiPSC לנוירונים שיכולים להניב TUBB3 נוירונים חיוביים ב 6 ימים10,11. הקמנו גם את ההבידול האוטומטי וההדמיה של מולקולה קטנה תאים מבשר עצביים (smNPC) לתוך נוירונים constitutivetiveing GFP תחת EF1aמקדם 12 ו iPSC לתוך דופאמין באמצע המוח (mDA) נוירונים, התאמת פרוטוקול עיכוב SMAD כפולשפורסם בעבר 13 המניב נוירונים mDA בתוך 65 ימים.

פרוטוקול

1. הליכים בסיסיים לאוטומציה של תרביות תאים והדמיה

  1. טען צלחות תרבות וטיפים חדשים
    1. פתח את ממשק GUI ולחץ על לחצן תצוגת תהליך משאב/מכשיר. כדי להפעיל תהליך פעולה זמין/כלי, בחר את תהליך המשאב/מכשיר ולחץ על לחצן תהליך הפעלת כלי נגינה.
    2. הפעל את תהליך המשאב RunHepaHood וטעונה מחדש (ראה שלב 1.1.1). פתח את הדלת, טען את לוחות תרבות התא ואת הטיפים החד-פעמיים במיקום המתאים כפי שצוין בתמונה המקפצת במחשב השולט.
    3. נגב את הדלת עם 70% אתנול לטיהור וסגור אותה. הפעל את תהליך המכשיר טיהור מתוך GUI (ראה שלב 1.1.1). המערכת מקבלת עיקור על ידי קרינת UV במשך 30 דקות.
  2. מילוי מחדש של מדיה של תרבות ו/או דיסוציאציה
    1. בצע את שלב המכשיר RunHepahood (ראה שלב 1.1.1). פתח את הדלת הקדמית של תחנת הטיפול בנוזלים. תרסם מאגרים (המכילים מדיה, PBS ו/או reagent דיסוציאציה) עם 70% אתנול ולמקם אותם על הסיפון לפוזיטון שהוקצה (כפי שהוגדר cfg.csv הקובץ). תסתגר את המאגרים.
    2. תסתיר את הדלת עם 70% אתנול ותסגור אותה. תכו את מכסה המנוע של HEPA על-ידי הפעלת תהליך המשאב/מכשיר "InitHepaHood" מה-GUI.
  3. יצירת "קו תא" חדש ופרוייקט ב- GUI
    1. צור/שנה את קבצי "קו התא" המוגדרים על-ידי המשתמש המורכבים מקבצי Config (*.cfg.csv), הייבוא ( *.imp.csv), המשאב (*.rsv.csv) וקבצי זרימת העבודה (*.wfl.csv).
    2. פתח את GUI וליצור "קו תא" חדש על-ידי לחיצה על לחצן הוסף קו תא בתצוגה "עורך קו תא". אשף נפתח במקום שבו יש לבחור את קובץ Config ויש להזין שם פרוייקט עם תיאור קצר.
    3. נווט באשף זה באמצעות ראש החץ הירוק ואשר את ההגדרות על-ידי לחיצה על סימן הסימון הירוק. צור פרוייקט חדש עבור "קו התא" שנוצר על-ידי לחיצה על לחצן הוסף פרוייקט.
    4. הזן שם פרוייקט ותיאור והגדר צבע פרוייקט שיהיה גלוי בתצוגת לוח התאריכים של ממשק המשתמש GUI. נווט לעמוד הבא של האשף על-ידי לחיצה על ראש החץ.
    5. צור אצווה חדשה על-ידי לחיצה על לחצן הוסף אצווה ומתן שם ותיאור קצרים בחלון המוקפץ. בחר את כל שלבי התהליך וזמן את זמן ההתחלה עבור כל אחד לשלבי התהליך. סגור את החלון על-ידי לחיצה על אישור.
  4. ביצוע שיטה אוטומטית באמצעות ממשק המשתמש
    1. עבור אל תצוגת לוח השנה של ממשק משתמש GUI ולחץ על לחצן הוסף שלב תהליך.
    2. בחר את קו התא ולאחר ניווט לעמוד הבא של האשף בחר את הפרוייקט. סמן את האצווה לשימוש ולחץ על ראש החץ מצביע ימינה. בהתאם לשיטה שבה נעשה שימוש, אצוות צריכים להיות ריקות (לקבלת לוחות חדשים), או להכיל צלחות תרבות או לוחות תסרוקת (כל התהליכים האחרים).
    3. נווט לעמוד הבא של האשף ובחר את שלב התהליך שיבוצע. עבור לעמוד האחרון של אשף זה וזמן את הניסוי. בסעיף "פרטי פרמטר" משתנים הדרושים כדי להפעיל את פעולת השירות ניתן לשנות. אשר על-ידי לחיצה על אישור.
  5. טעינת צלחות תרבות ואסא לתוך אינקובטור CO2
    הערה: 1-well צלחות מוגדרות צלחות תרבות מאז הם משמשים בדרך כלל לתאים בתפזורת. כל הצלחות מרובות הבאר מוגדרות כלחות תסה.
    1. בצע את תהליך המכשיר "RunHepaHood" מתוך GUI כמתואר בשלב 1.1.1. ולפתוח את הדלת מול הזרוע הרובוטית.
    2. נגב את תחתית לוחות ה-assay עם 70% אתנול ורקמות ללא מוך אם הלוחות טעונים להדמיה אוטומטית. מניחים את התרבות או צלחות ההסתה על המדף השמאלי. ודא שכיוון הלוח נכון. עבור צלחות assay, גם A1 צריך להצביע לכיוון הזרוע הרובוטית בעוד הקצוות של צלחות תרבות צריך להצביע ימינה.
    3. נגב את הדלת עם 70% אתנול לטיהור וסגור אותה.
    4. בצע את השיטה "טעינת צלחות תרבות" לייבוא לוחות 1-well או "טעינת לוחות אסאי" לייבוא לוחות רב-בארות כמתואר בשלב 1.4. השתמש באצווה ריקה כדי להפעיל את שתי השיטות. אם ברקודים של לוחות כבר קיימים באצווה זו, בטל את הסימון בהם על-ידי לחיצה על תיבות הסימון.
    5. הובל צלחות בודדות מהמדף לפלטפורמת האינקובטור CO2 באמצעות הזרוע הרובוטית. תחנת ההסעות המובנה מחזירה את הצלחת ומאחסנת אותם באחד מארונות התקשורת של חממת CO2. התאים נשמרים ב- 37 °C ו- 5% CO2.
  6. פריקת צלחות מהאינקובטור CO2
    1. בצע את פעולת השירות "בטל טעינה של לוחות" (ראה שלב 1.4). בחר את האצווה המכילה את הצלחות שיש לייצא. ניתן לבחור צלחות בודדות על ידי הברקודים שלהן.
    2. להעביר את הצלחות החוצהמאינקובטור CO 2 למדף השמאלי באמצעות הזרוע הרובוטית.
    3. הפעל את מכסה המנוע HEPA באמצעות תהליך המכשיר "RunHepaHood" כמתואר בשלב 1.1.1. ולפתוח את הדלת מול הזרוע הרובוטית. הסר את הצלחות, תטהר את הדלת עם 70% אתנול לפני סגירתה והושבת מכסה המנוע של ה-HEPA.

2. פרוטוקולי אוטומציה

  1. זריעת צלחות מצינורות
    1. הפעל את מכסה המנוע HEPA על ידי ביצוע תהליך המכשיר RunHepaHood (ראה שלב 1.1.1). פתח את הדלת מול תחנת הטיפול בנוזלים. הזן את צינור 50 מ"ל המכיל את מתלי התא וde-lid הצינור.
    2. פתח את הדלת מול הזרוע הרובוטית והטען צלחות תרבות מצופה לקבלת תאים על המדף. תטהר ותסגור את שתי הדלתות. בצע את השיטה "זריעת צלחות מצינורות" (ראה שלב 1.4).
    3. ספירת תאים בציטומטר ההדמיה של Brightfield באמצעות פונקציית ספירת תאים ישירה. לספירת תאים, השתמש ב- 16 בארות כמשכפלים בתבנית לוח של 384 בארות.
    4. להעביר את לוחית ספירה 384 גם מהסיפון אל cytometer הדמיה brightfield באמצעות פטיפון באמצעות הזרוע הרובוטית ולהתחיל את תהליך ההדמיה. הציטומטר קובע באופן אוטומטי את מספר התא למיליליטר. החזירו את לוחית הספירה למיקום המקורי שלה באמצעות הזרוע הרובוטית.
    5. להעביר תרבות מצופה או צלחת תסה מהמדף לסיפון pipetting באמצעות הזרוע הרובוטית. הסר תאי ציפוי וזרע במספר המוגדר על-ידי המשתמש ונפח האחסון המתאים לתבנית הלוח (ראה טבלה 1). מעבירים את הצלחת לשייקר על הסיפון ל-10 שניות ב-500 סל"ד לחלוקת תאים והעברו לאקובטור CO2.
  2. הערכת התכנסות אוטומטית
    1. בצע את השיטה "בדוק את Confluency" כמתואר בשלב 1.4. בחר אצווה המכילה לפחות לוח תרבות אחד ואין לוחות תסה. בסעיף "פרטי פרמטר" קלט "iPSCf_2020" עבור רכישת תמונה והגדרות ניתוח הדמיה.
    2. הובל את הצלחת הראשונה מהאינקובטור CO2 אל ציטומטר ההדמיה של Brightfield באמצעות הפטיפון באמצעות הזרוע הרובוטית.
    3. בצע הדמיה של תאים בציטומטר הדמיה brightfield עבור בדיקת התכנסות של מושבות hiPSC. השתמש ביישום "confluence" ובתמונה 13 שדות של פאטה 1-well ולחשב באופן אוטומטי את האזור הממוצע הכבוש על-ידי תאים.
    4. להעביר את הצלחת בחזרה לאקובטור CO2 באמצעות הזרוע הרובוטית. חזור על שלבים 2.2.2. ל-2.2.4. עבור הצלחות הנותרות.
  3. שינוי מדיה של צלחות תרבות או צלחות תסה
    1. בצע את השיטה "שינוי מדיה של לוחות תרבות" כמתואר בשלב 1.4. ובחר אצווה המכילה לוחות תרבות בלבד. הגדר את המשתנה המציין אם טיפים או מחטים משמשים עבור שלבי pipetting בסעיף "פרטי פרמטר". לשינוי מדיה של כל לוח רב-בארות, בצע את השיטה "שינוי מדיה של לוחות תס"א" ובחר אצווה המכילה לוחות אסאי.
    2. להעביר את הצלחות הבודדות מאינקובטור CO2 לסיפון באמצעות הזרוע הרובוטית ולהוות את המכסה את הצלחות. הטיה אוטומטית של הצלחות ושאפה מדיה ישנה והשליך אותה למודול איסוף הפסולת. הוסף 12 מ"ל של מדיה טרייה. מכסים מחדש את הצלחת ומעבירים את הלוחות בחזרה לאקובטור CO2 באמצעות הזרוע הרובוטית.
  4. תת-תרגום
    הערה: בצע את תהליך המכשיר "RunHepaHood" מתוך GUI כמתואר ב- 1.1.1. ולפתוח את הדלת הקדמית של תחנת הטיפול בנוזלים. טען את reagent מדיה ודיסוציאציה במשרות הנדרשות (ראה שלב 1.2). אם יש צורך במילוי מחדש של עצות, השתמש ב"טעינה מחדש" כמתואר בשלב 1.1. קלט צינור 50 מ"ל לקבלת מתלה התא וde-lid הצינור.
    1. בצע את השיטה "תת-תרבות של תאים נדבקים" (ראה שלב 1.4). בחר את האצווה המכילה לוחות תרבות הזקוקים לתת-תרבות.
    2. להעביר את הצלחות מהאינקובטור CO2 לסיפון באמצעות הזרוע הרובוטית ולהוות את המכסה את הצלחות. הטיה אוטומטית של הלוחות והסר מדיה ישנה והשלך אותה למודול איסוף הפסולת. לשטוף תאים פעם אחת עם 8 מ"ל של PBS. הוסף 8 מ"ל של 0.5 מ"ר EDTA עבור מעבר מבוסס גוש. דגירה על הסיפון במשך 8 דקות.
    3. הסר את פתרון EDTA מההצלחות וזרוק אותו למודול איסוף הפסולת. מוסיפים 12 מ"ל של מדיום טרי ומעבירים את הצלחות לשייקר. לנער ב 2000 סל"ד במשך 1 דקות כדי לנתק את המושבות.
    4. לתכלת את מתלי התא עבור חמישה מחזורים של pipetting כדי לשבור את מושבות iPSC לגודל קטן יותר (~ 50\u201280 μm). העבר את מתלה התא לצינור של 50 מ"ל על הסיפון. תאי זרעים באופן אוטומטי כמתואר בשלב 2.1.5 באמצעות יחס מפוצל של 1 ל- 7.
      הערה: מעבר תא יחיד אופציונלי. צור מתלה תא בודד באמצעות תיוג ניתוק של תא יחיד (ראה טבלת חומרים). במקום 0.5 mM EDTA בשלב 2.4.2., השתמש 8 מ"ל של reagent דיסוציאציה תא יחיד דגירה במשך 20 דקות ב 37 °C. לאסוף את מתלה התא לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף נפח שווה של מדיה. ניתוק באמצעות reagent ניתוק תא יחיד דורש שלב ידני כדי גלולת התאים. תאי צנטריפוגה ב- 300 x g למשך 3 דקות. הסר את supernatant ולתחות מחדש את גלולת התא ב 12 מ"ל של המדיה הנדרשת ולהמשיך עם "זריעת צלחות מצינורות" (ראה שלב 2.1). להשלים את המדיה עם 2 μM thiazovivin ביום של זריעה בעת שימוש השעיה תא יחיד של hiPSCs.
  5. הדמיית תפוקה גבוהה אוטומטית בעלת תוכן גבוה
    הערה: הגדרת המדידה צריכה להיות זמינה (ראה קובץ משלים 1: שלב 1.1). לוחות ה-assay שיש למצוא בתמונה זמינים באינקובטור.
    1. בצע את פעולת השירות "הדמיה" (ראה שלב 1.4). בחר אצווה המכילה לפחות לוח תסה אחד ללא לוח תרבות. בסעיף "פרטי פרמטר", הזן את סוג הלוח, את הגדרות הלוח (עבור לוחות הדמיה סטנדרטיים של 96 בארות: "Plate-96-20170918113842") ואת שם הגדרת המדידה.
    2. להעביר את לוח הבדיקה דרך פטיפון למיקרוסקופ confocal אוטומטי באמצעות הזרוע הרובוטית כדי להתחיל את תהליך ההדמיה. לשחזר את הצלחת בסוף ההדמיה מהמיקרוסקופ ולהעביר אותו בחזרה לאקובטור CO2. חזור על התהליך של הצלחות הנותרות באצווה.

3. תחזוקה אוטומטית והרחבה של hiPSC

  1. רצף בדיקות ההתקנות האוטומטיות, שינויי מדיה ותת-טיבציה
    1. תאי זרע על 1-well צלחות באמצעות שיטת "זריעת צלחות מצינורות" (ראה שלב 2.1). לחלופין, ייבוא ידני זרעים 1-well צלחות באמצעות שיטת "טעינת לוח תרבות" (ראה שלב 1.5).
    2. תזמן בדיקות קונפלואנציות אוטומטיות מדי יום כדי לפקח על צמיחת המושבה מהיום הראשון עד היום ה-6 של התרבות עבור iPSC (ראה שלב 2.2).
    3. רענן מדיה בכל יום שני באמצעות השיטה "שינוי מדיה של לוחות תרבות" (ראה שלב 2.3). 12 מ"ל של מדיום משמש לכל צלחת.
    4. ביום 6, התחל את תהליך "תת-טיבציה" (ראה שלב 2.4.).

4. בידול אוטומטי

  1. IPSC אנושי לנוירונים קליפתיים NGN2
    הערה: הכנה ידנית ל- hiPSC. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של NGN2 באמצעות וקטורים lentiviral למסירה. מתמר hiPSC עם NGN2 כדי rTTA3 lentivirus ביחס 1:2 (> ~ 107 TU / מ"ל). לאחר מכן, תאים נבחרים עבור מעבר אחד עם פורומיצין 0.5 μg/mL. פרוטוקול מפורט ליצירת שורות hiPSC-NGN2 יציבות נמצא בקובץ משלים 1: שלב 2.
    1. המשך בתהליך "Subcultivation" כמתואר באמצעות reagent ניתוק תא יחיד המתואר בהערה של שלב 2.4.4. כאשר hiPSC מגיע 70\u201280% confluency
    2. הסר את supernatant ולתחות מחדש את גלולת התא ב 12 מ"ל של NGN2 מדיה(טבלת חומרים)המכיל 2.5 μg / mL דוקסיציקלין (דוקס) ו 2 μM thiazovivin.
    3. התחל בידול באמצעות השיטה "זריעת צלחותמצינורות" (ראה שלב 2.1). הגדר את צפיפות הזרעים הרצויה של iPSC ל- 30,000/ס"מ2 (ראה טבלה 1). ה-iPSC מצופה על צלחות מצופה מראש עם 0.1 מ"ג/מ"ל פולי-L-ornithine (אש"ף) ו 5 μg / מ"ל למינין.
      הערה: לוחות 1-well מועדפים עבור מחקרים מבוססי RNA ופרוטאומיקה בעוד פורמט צלחת 96-באר מועדף על ניסויי הדמיה. ניתן להשתמש גם בתבניות אחרות של לוחות צלחת ציון כגון 48-, 24-, 12 או 6-בארות.
    4. ביום הראשון של בידול, רענן מדיה באמצעות "שינוי מדיה של לוחות אסה (ראה שלב 2.3) באמצעות NGN2 בינוני, בתוספת 2.5 μg/mL dox ו 10 μM N-[2S-(3,5-difluorophenyl)אצטיל]-L-alanyl-2-phenyl-גליסין, 1,1-דימתילאתיל אסתר (DAPT). המשך בשינויי מדיה כל 2\u20123 ימים עד ליום הרצוי של בידול (ראה שלב 2.3).
    5. ביום ה-4 של ההבידול, לבצע שינוי מדיה אחר (ראה שלב 2.3.) באמצעות NGN2 בינוני בתוספת עם 10 ng/mL המוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF), 10 ng/mL גליה תא נגזר גורם נוירוטרופי (GDNF) ו 10 ng/mL גורם נוירוטרופי 3 (NT-3) כדי לשפר את ההתבגרות. בסוף הניסוי, לייצא את צלחות התרבות מהמערכת לניסויים במורד הזרם (ראה שלב 1.6).
  2. מולקולה קטנה תאים מבשר עצבי (smNPC) לנוירונים NGN2
    הערה: נגזר smNPC בעקבות הגירסה המותאמת שלפרוטוקול שפורסם 12 (ראה קובץ משלים 1: שלב 5). שנה את smNPC עם NGN2 ווירוס rTTA3 (ראה קובץ משלים 1: שלב 2). סיבוב אחד של NGN2 ו- rTTA מתמר מספיק כדי ליצור אוכלוסייה יציבה. שינוי נוסף smNPC עם pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus המאפשר לבצע ניטור תא חי. ריבוי של זיהום (MOI) של 10 משמש עבור מתמר lentiviral GFP.
    1. מעבר smNPC על הגעה confluency באמצעות reagent ניתוק תא יחיד כמתואר בשלב 2.4. הערה.
    2. תאי זרע באמצעות מערכת תרבות התא האוטומטית בצפיפות תא של 50,000/cm2 באמצעות שיטת "זריעת צלחות מצינורות" (ראה שלב 2.1.) על לוחות מצופים מראש עם 0.1 מ"ג/מ"ל PLO, ו 5 μg/mL למין ב NGN2 בינוני בתוספת 2.5 μg/mL dox.
    3. ביום 3, בצע שינוי מדיה (ראה שלב 1.3.) באמצעות אמצעי NGN2 טרי המכיל 2.5 μg/mL dox ו- 10 μM DAPT. לאחר היום השלישי, בצע שינויי מדיה בכל יום שלישי עם בינוני NGN2 טרי המכיל 2.5 μg/mL dox, BDNF, GDNF ו- NT-3 ב 10 ng/mL כל אחד.
    4. תאי תמונה מדי יום באמצעות השיטה "תוכן גבוה אוטומטי, הדמיית תפוקה גבוהה" (ראה שלב 2.5) לניטור מצב בידול באמצעות GFP כקריאה עבור נורייט outgrowth. הגדר את כוח הלייזר ל-80% והשתמש בזמן חשיפה של 30 אלפיות השנייה. רכוש מספר גדול של שדות (לדוגמה, 25 שדות) באמצעות יעד של 20x.
  3. ניתוח תמונת אצווה
    1. בצע ניתוח תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 1, באמצעות תבנית ההתרבות neurite.
    2. פתח את התוכנה. בחר באפשרות "נתונים" ואתר את תיקיית נתוני ההדמיה, לחץ על אישור כדי לטעון נתונים לניתוח. לחץ על פתח ומשורת התפריטים העליונה, בחר פרוטוקול ומתפריט היישום בחר neurite outgrowth. עבור אל "אלגוריתמים" והשתמש בערוץ "488" כדי להגדיר את הגרעין, גוף התא ונורייט. התאם את פרמטרי הסף עבור כל אחד מהם.
    3. בחר את בארות שישמשו לניתוח תמונה. בפינה השמאלית התחתונה לחץ על קישור ובחר תכונות שיש לנתח, כגון ממוצע ספירת תאים, סה"כ אורך שלד. המשך עם "ניתוח קדם" ואחריו "תצוגה מקדימה".
    4. בדוק אם הגדרות התצוגה המקדימה קבילות והתחיל את הניתוח במצב אצווה. התוצאות זמינות בתיקיית האב תחת "דוחות" בתבנית .csv זמינה שניתן לפתוח ב- Excel.
      הערה: קובץ Script לניתוח תמונה זמין על פי בקשה.
    5. התוויית אורך נורייט ממוצע שהושג על-ידי אורך נורייט הכולל מנורמל למספר תא.

5. בידול אוטומטי של hiPSC לתוך דופאמין באמצע המוח (mDA) נוירונים

  1. הכנה ידנית ל-hiPSC
    1. נתק hiPSC של 70\u201280% לתאים בודדים באמצעות ריגנט ניתוק תאים בודדים. בקצרה, תאי דגירה עם ריאגנט דיסוציאציה תא יחיד (100 μL / ס"מ2) במשך30 דקות ב 37 ° C, לאסוף מתלה תא לתוך צינור חרוץ, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות וכדור תא תלוי מחדש במדיום תרבות iPSC.
    2. זרע 200,000 תאים/ס"מ 2 על צלחות 1-well מצופה מטריצה חוץ תאית ו- iPSC תרבות בינוני בתוספת 10 μM Y-27632. תאי תרבות ללילה ב- 37 °C ו 5% CO2.
  2. בדידול אוטומטי: שלב 1
    1. הכן את מערכת התרבות האוטומטית כמתואר בשלב 1.1\u20121.2.
    2. טען לוחות תרבות המכילים תאים לתוך אינקובטור CO2 של מערכת התרבות האוטומטית (ראה שלב 1.5).
    3. הכן את KSR בינוני (ראה טבלת חומרים)ותושלם עם מולקולות קטנות (ראה טבלה 2)הנדרשת ליום ההתחלה 0 של בידול. השתמש רק במדיה טרייה עם מולקולות קטנות וגוברי גדילה.
    4. בצע שינויים במדיה של לוחות התרבות כמתואר בשלב 2.3 בימים 0 ו- 1 של בידול ולאחר מכן בכל יום שני עד היום ה-25.
    5. מהיום ה', הסט את ניסוח המדיה בהדרגה כמתואר בפירוט בטבלה 3.
    6. ביום 11, להוסיף מדיום בידול נוירון MDA בתוספת CHIR (עד היום 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 ו DAPT (ראה טבלת החומרים).
    7. ביום ה-25, פרק לוחיות פריקה (ראה שלב 1.6).
  3. תוחם ידני 1
    1. נתק את היום 25 מבשרי MDA לתאים בודדים באמצעות reagent ניתוק תא יחיד. בקצרה, תאי דגירה עם ריאגנט ניתוק תא יחיד (100 μL/cm2) במשך40 דקות ב 37 °C, לאסוף מתלי תא לתוך צינור חרוץ, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות וכדור תא תלוי מחדש במדיום בידול נוירון MDA.
    2. זרע 400,000 תאים /ס"מ2 ב 1-באר צלחות תרבות מצופה מראש עם 0.1 מ"ג / מ"ל PLO, 10 μg/mL למינין ו 2 μg /mL פיברונטין במדיום בידול נוירון MDA בתוספת 10 μM Y-27632 (עד היום 26) מולקולות קטנות וגדילה גורמי המתוארים בטבלה 2. תאי תרבות ללילה ב- 37 °C ו 5% CO2.
  4. בדידול אוטומטי: שלב 2
    1. טען לוחות תרבות המכילים נוירונים MDA לתוך אינקובטור CO2 של מערכת התרבות האוטומטית כמתואר בשלב 1.5
    2. להכין מדיום בידול נוירון MDA (ראה טבלת חומרים)ולהשלים עם מולקולות קטנות גורמי גדילה הנדרשים עבור ההבידול הסופי מהיום 26 ואילך (ראה טבלה 2).
    3. בצע שינויי מדיה של לוחות תרבות כמתואר בשלב 2.3 ביום 26 של בידול ולאחר מכן כל 3\u20124 ימים עד היום 65.
      הערה: למטרות הדמיה בתפוקה גבוהה, מומלץ לתבל מחדש את תאי העצב של ה-MDA ב-96-well צלחות בצפיפות נמוכה ביום 32 של בידול, כמתואר בשלב 5.5.
  5. פלטה ידנית 2
    1. פרקו צלחות תרבות כמתואר בשלב 1.6. לנתק את היום 32 נוירונים mDA לתאים בודדים כמתואר בשלב 5.3.1.
    2. זרע 100,000 תאים/ס"מ2 ב-96-באר צלחות מצופה מראש עם 0.1 מ"ג/מ"ל אש"ף, 10 μg/mL למינין ו 2 μg /mL פיברונטין במדיום הבחנה נוירון MDA בתוספת עם 10 μM Y-27632 (עד היום 33) מולקולות קטנות וגדילה גורמים (ראה טבלה 2). תאי תרבות ללילה ב- 37 °C ו 5% CO2.
    3. ביום 33, להחליף בינוני על ידי מוכן טרי DA נוירונים דיבידול בינוני בתוספת מולקולות קטנות וגווני גדילה (ללא Y-27632). שנה מדיום באופן ידני כל 3\u20124 ימים עד היום ה-65.

6. רכישת וניתוח אוטומטי של תמונות בתפוקה גבוהה

  1. כתמי פלואורסץ
    1. בצע פלואורסצנט חיסוני כמתואר בקובץ משלים 1: שלב 4.
    2. תאי תמונה כמתואר בקובץ משלים 1: שלב 1.2.
    3. העלה קבצי הדמיה שנוצרו על-ידי מערכת ההדמיה לתוכנה לניתוח תמונה 2 (ראה טבלת חומרים)לניתוח תמונה נוסף, כמתואר בשלב 6.2.
  2. ניתוח תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 2
    1. לאחר קבצי הדמיה מועלים בתוכנה לניתוח תמונה 2, עבור אל הפונקציה "ניתוח תמונה" ולבנות את אלגוריתם הניתוח באמצעות התפריט הנפתח.
    2. בחר גרעין באמצעות המשימה "למצוא גרעין", אשר מזהה אזורים על התמונה השייכים גרעין התא (כאן מוכתם Hoechst). אל תכלול גרעינים מתים (גרעין פיקנוטי) על-ידי קביעת סף לאזור גרעיני או קוטר.
    3. בחר את ציטופלסמה התא באמצעות המשימה "למצוא צטופלסמה". משימה זו מזהה אזורים סביב גרעין השייכים צינופלסמה תא. כלול תאים מחולקים היטב בלבד. אל תכלול תאים מיטוטיים, אפופטוטיים ומפולחים בצורה גרועה. הסר תאים הנוגעים בגבול התמונה.
    4. הוסף את הפעילויות "חשב מאפייני מורפולוגיה" ו"חשב מאפייני עוצמה". הפרמטרים המורפולוגיה כוללים את החישוב של מאפייני מורפולוגיה כגון אזור עבור אזור עניין. פרמטרי העוצמה כוללים את החישוב של מאפייני עוצמה כגון עוצמה ממוצעת עבור אזור עניין (למשל צטופלסמה של נוירונים).
    5. בחר תת-אוכלוסיה (לדוגמה, נוירונים חיוביים TH) של אוכלוסיית הקלט (כל ציותופלסמות שנבחרו) באמצעות תנאי אחד או יותר, מורפולוגיה ו/או עוצמה.
      הערה: בדרך כלל, עוצמה נבחרת עבור נוירונים. בהתבסס על פקדים שליליים, ניתן להגדיר מעל איזה סף של עוצמה הנוירונים נחשבים חיוביים עבור TH.
    6. הגדר את תוצאות הפלט. זהו הבניין האחרון של כל ניתוח. הוא מגדיר את ערכי הקריאה של ה-Assay עבור כל באר של לוח תרבות (תוצאות לבאר).
    7. הפעל את ניתוח האצווה ולייצא את התוצאות. לנרמל את מספר התאים החיוביים למספר הכולל של גרעין ולייצג נתונים כאחוז התאים החיוביים.

7. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR)

  1. בצע את פרוטוקול qRT-PCR כמתואר בקובץ משלים 1: שלב 3.

תוצאות

תרבות התא האוטומטית שלנו ומערכת הדמיה נועדה למזער את ההתערבות האנושית המאפשרת לנו לתקנן את הטיפוח של hiPSC ובדידול לסוגי תאים שונים כגון קליפת המוח או דופאמין באמצע המוח (MDA) נוירונים. סקירה סכמטית של מערכת תרבות התא האוטומטית שלנו עם התקני הדמיה משולבים מתוארת באות 1. המבוא הראשוני של תרביות תאים למערכת תרבות תא אוטומטית זו יכול להיעשות על ידי זריעת תאים באופן אוטומטי מצינור 50 מ"ל או באמצעות השיטה "טעינת צלחות תרבות" או "טעינת לוחות אסאי" לייבוא של צלחות תרבות או תסה. מרכיב מרכזי במערכת שלנו הוא תחנת הטיפול בנוזלים שבה מתבצעים כל שלבי ההעברה הנוזליים, כגון שינויי מדיה או תת-חישובים. פריסת הסיפון המותאמת אישית של המטפל הנוזלי מיוצגת באות 2. תחנת הטיפול בנוזלים מצוידת בארבע תנוחות. ניתן להעביר עד ארבע צלחות מהאינקובטור לסיפון, ולאפשר שינויי מדיה מקבילים. מכיוון בשיטת תת-התת-טיבציה, יש לאכלס את צלחות התרבות של ההורים והבת על הסיפון, המספר המרבי של צלחות תרבות המעובדות במקביל מוגבל לשניים. תכונה חשובה של תחנת טיפול בנוזל היא האפשרות להטות את הצלחות במהלך שינוי מדיה להסרה מלאה של supernatant תרבות התא. כמו כן, תחנת טיפול נוזלי מצויד שייקרים להעדפת דיסוציאציה אנזימטית של תאים במהלך ביצוע פרוטוקול subcultivation. מערכת התרבות האוטומטית שלנו מצוידת גם בשתי מערכות הדמיה: ציטומטר הדמיה של Brightfield לביצוע בדיקות ספירת תאים ואי-פלואנציות, ולכן ניטור צמיחת התאים לאורך זמן, ומיקרוסקופ כפול של דיסק מסתובב לצורך ספירת תאים מהירה, גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים.

תרביות hiPSC מנוטרות מדי יום לצמיחה בציטומטר ההדמיה של Brightfield וניתחו עבור אחוז ההתברבות. תמונת brightfield בלוח השמאלי ובחלונית הימנית מסיכה ירוקה מניתוח תמונת brightfield שהושגה עם ציטומטר (איור 3א). צמיחה הומוגנית hiPSC נצפתה לאורך זמן, כפי המוצג על ידי אחוזי ההתכנסות של שני קווי hiPSC (n = 4 צלחות) גדל במקביל נתון בדיקות confluency מהיום 1 עד היום 6(איור 3B). עם ההגעה לסף שנקבע, ה-hiPSC מעבר. קווי התא היו תרבותיים באופן ידני (m) או על ידי מערכת אוטומציה (א) ונצפו לתחזוקה של מורפולוגיה טיפוסית של תאי גזע עבור לפחות שני מעברים, תמונות ברייטפילד נציג(איור 4A). hiPSC מתורבת באופן ידני (לא מוצג) או במערכת האוטומטית הציג את סמן תאי גזע טיפוסי OCT4 (אדום) ו SSEA4 (ירוק), כפי שמוצג במאגר immunofluorescence(איור 4B). הביטוי של סמני pluripotency OCT4, NANOG ו REX1 הוערכו גם ברמת mRNA על ידי qRT-PCR (איור 4C). כימות יחסית בוצעו עם דגימות שנאספו משורת תא אחת שגדלה באופן ידני (m) ובמערכת התרבות האוטומטית (א) בכפילויות (משכפל 1 ו- 2). רמות הביטוי של כל שלושת סמני הפלורופוטנסיה בשכפולים המעובדים במערכת התרבות האוטומטית דומות לביטוי סמן לאחר תרבות ידנית. ביום 8 (D8), הביטוי של סמני pluripotency נעדר נוירונים קליפתיים מובדיל (Diff) מ hiPSC.

יישום חשוב אחד של מערכת התרבות האוטומטית הוא ההבידול של hiPSC לסוגי תאים שונים כולל נוירונים. כאן אנו מראים את ההבידול של hiPSC לתוך נוירונים באמצעות אסטרטגיית NGN2, אשר מייצרת תרבות נוירון קליפתית טהורה בזמן קצר מאוד (כ 6 ימים). נוירונים מובדילים במערכת התרבות האוטומטית (א) הציגו מורפולוגיה דומה וארגון רשת עצבית כמו הנוירונים מעובדים באופן ידני (m) (איור 5A). נוירונים קליפתיים מובדילים אוטומטיים היו חיוביים עבור TUBB3 (נוירון ספציפי Class III β-טובלין, אדום) ו BRN2 (סמן שכבה קליפתית עליונה, ירוק)(איור 5B), דומה נוירוניםמובדילים באופן ידני (נתונים לא מוצגים). הביטוי של סמנים עצביים כולל החלבון המשויך microtubule 2 (MAP2), מולקולת הדבקת תאים עצביים(NCAM1)ו Synapsin-1 (SYN1),כמו גם סמני נוירון קליפתיים BRN2 ו CUX1 (שכבה קליפתית עליונה) הועשרו בנוירונים ביום 8 (D8) של בידול (איור 5C). נמוך מאוד או שום ביטוי של סמנים אלה נצפתה hiPSC. כימות יחסית בוצעו עם דגימות שנאספו משורת תא אחת שגדלה באופן ידני (m) ובמערכת התרבות האוטומטית (א) בכפילויות (משכפל 1 ו- 2). רמות הביטוי בשכפולים מציגות וריאציות דומות בין בידיונות ידניים ואוטומטיים.

יכולת ההדמיה המשולבת של מערכת התרבות האוטומטית מאפשרת איסוף נתונים ללא ידיים לבריאות התרבויות ובכך מאפשרת רכישה אוטומטית ארוכת טווח של קראות פנוטיפיק. באמצעות הגישה NGN2 מולקולה קטנה נגזר מבשר עצבי (smNPC) קו המושרה עם GFP lentivirus, הקמנו תא חי אוטומטי neurite outgrowth תוואי שבו אורך neurite נמדד על פני 11 ימים של בידול ללא כל התערבות ידנית. מורכבות הנורייט גדלה עם הזמן, כפי שהוכח בשטח הכבוש עם נורייטים ביום הראשון, 3 ו-11, ביטוי GFP ותמונות רעולי פניםמניתוח (איור 6א', ב).). העלייה באורך נורייט מהיום הראשון עד 11 של בידול היה לכמת והראה התפתחות דומה על פני בארות שונות. למען הפשטות, נתונים מ-3 עמודות בלבד עם 6 בארות כל אחת מצלחת 96 בארות מתוארים בגרף המייצג למרות שכל 60 הבארות הפנימיות נותחו(איור 6C).

יישום נוסף של מערכת התרבות האוטומטית המוצגת כאן הוא ההבידול של hiPSC לתוך נוירונים mDA. ההבידול מבוסס על שינויים במדיה בעקבות פרוטוקול שנקבע מראש ובוצע במערכת התרבות האוטומטית בין ימים 0 ל-65. שינויי מדיה אוטומטיים לא גורמים לניתוק תאים או לשינויים אחרים הניתנים לזיהוי חזותית בהבחנה. בסוף ההבידול, ביום ה-65, נוירונים של מד"א מראים ארגון סלולרי ומורפולוגיה (סומה ספרית, דנדריטים ארוכים וקוציים) הדומים להבדיל ידני(איור 7א', ב). ברמת ה-MRNA, נוירונים מד"א מובדילים במערכת התרבות האוטומטית להראות את הביטוי של סמנים עצביים ו-MDA, MAP2 ו TH (טירוסין hydroxylase), בהתאמה(איור 7C). שתי ההביזויות יצרו כמויות משמעותיות של נוירונים חיוביים TH ו- MAP2(איור 7D).

figure-results-1
איור 1: סקירה סכמטית של תרבות התא האוטומטית ופלטפורמת ההדמיה.
המערכת תוכננה עם דיור פוליקרבונט ושני ברדסים HEPA (A ו-B) מצויד ארבע מנורות UV הבטחת סביבה סטרילית עבור יישומי תרבות התא. לוחות תרבות התאים טעונים על המדפים מול הזרוע הרובוטית אשר ניתן לגשת דרך הדלת הקדמית (C). הצלחות נטענות לתוך אינקובטור CO2 (D) עם קיבולת של 456 צלחות. ציטומטר תא brightfield (ה) משמש לבדיקות קונפלציה וספירת תאים במהלך שגרת תת-טיבציה. תחנת הטיפול בנוזלים נמצאת מתחת לאחת מברדסי HEPA (B). פריסת הסיפון של המטפל הנוזלי מתוארת באות 2. זרוע ההתזתה של תחנת הטיפול בנוזלים נושאת ראש צינור 96 ערוצים, שמונה ערוצי צנרת 1 מ"ל וארבעה ערוצי צנרת של 5 מ"ל. במקרה של 1 מ"ל pipetting ערוצים, טיפים או מחטים יכול לשמש עבור העברות נוזליות. למטרות סינון, ניתן לטפל בתאים הזרעים לוחות אחסון בדגימות המאוחסנות ב-20°C במערכת האחסון האוטומטית של -20°C (F) לאחר הפשרת דגימות אלה באינקובטור שני (G). הדמיית תפוקה גבוהה מתבצעת במיקרוסקופ הנוקודאלי האוטומטי (H) המציע לרכוש תמונות במצב קונפוקאלי באמצעות שני דיסקים מסתובבים או במצב אפיפלואורסצינטי. תא תא חי המשולב במיקרוסקופ מאפשר ביצוע הדמיה ארוכת טווח של תאים תרבותיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2: פריסת הסיפון של תחנת הטיפול בנוזלים.
עמדות עצה מסומנים על ידי "50 μL" עבור 50 טיפים μL, על ידי "רגיל" עבור 300 טיפים μL, על ידי "גבוה" עבור 1 טיפים מ"ל ועל ידי "5 מ"ל" עבור 5 טיפים מ"ל. רכיבי סיפון:(A)ארבע עמדות שייקר מחוממות (מהירות מרבית: 2500 סל"ד) אשר ניתן להשתמש בהן עבור כל צלחת תרבות או פורמט צלחת תסה. עמדות השייקר מצוידות במהדקים הניתנים להצמדה המשמשים גם ליישור צלחת בעקבות הובלות לסיפון. יתר על כן, עמדות שייקר מתפקדות כמיקום חניה מכסה עבור צלחות במהלך צעדי העברה נוזלית. למטרות ייצוגיות, כל משרות השייקר מאוכלסות על ידי 96 צלחות ציון. (ב)ארבעה מודולי הטיה לעיבוד ארבע לוחות בכל פורמט בו-זמנית ממוקמים למעלה. המיקום הנמוך ביותר מסמן את תא איסוף הפסולת עבור צלחות תרבות ואסאי ואת ראש צינור 96 ערוץ. למטרות ייצוגיות, כל מודולי ההטיה מאוכלסים על-ידי לוחות ציון של 96 בארות. (ג)במיקום העליון, ממוקם הלוח 384 באר עבור ספירת תאים. להלן שתי עמדות עבור צלחות התפוסות על ידי צלחות 96-באר למטרות מייצגות ו rack עבור ארבעה 50 מ"ל וארבעה צינורות 15 מ"ל. המיקום הנמוך ביותר מאוכלס על ידי 5 טיפים מ"ל. (ד)שלושה קווי מדיה עם משרות למאגרים תקשורתיים. קווי המדיה מחזיקים בחיישנים ברמת נוזל המאפשרים למלא באופן אוטומטי את מאגר המדיה עם עד 250 מ"ל של מדיה. (ה)שני מודולי פסולת נוזלית עם ניקוז פעיל מבוססים על החלק העליון, מתחת למודול מבוקר טמפרטורה עם מיקום עבור מיכל אחד (לבן) ומדף טיפים של 5 מ"ל ממוקמים. חמשעמדותל-1 מ"ל טיפים. (ז)שני מודולים מבוקרי טמפרטורה ממוקמים בתחתית ומיקום לחניה אחד המכסים שלהם על גבי. (H)עמדות עבור שני 50 μL מקוננים טיפים מתלים (NTR) בראש ואחריו שתי עמדות עבור ערוץ יחיד ו 96 ערוצים להרים של 300 טיפים μL ו 5 מ"ל עצה מתלה בתחתית. (I)מערם עבור 384 גם ספירת צלחות בראש ואחריו שלושה 300 μL NTR ו 5 מ"ל עצה מתלה בתחתית. (J)תחנת אחסון ושטיפה עבור שלושה סטים של שמונה מחטי מתכת 1 מ"ל הניתנים לתווכות חוזרות. (K)מיקום פסולת עבור 1 מ"ל ו 5 מ"ל pipetting ערוצים NTR ריק (אפור) כמו גם בלוק gripper עבור 1 ו 5 מ"ל ערוצים (לבן) המשמשים עבור מדרגות תחבורה על הסיפון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3: בדיקת קונפלואנציות אוטומטית של hiPSC.
(א)תמונות מייצגות של brightfield (BF) של hiPSC שצולמו על ידי ציטומטר התא (משמאל) ולאחר ניתוח קונפלונלי אוטומטי (מימין) המציין את השטח היחסי הכבוש על ידי תאים בירוק; (ב)אחוזי קליטה שנרשמו משתי שורות hiPSC (iPS #1 ו- #2) מהיום הראשון עד 6 של תרבות, n = 4 לוחות 1-well לכל קו תא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4
איור 4: מעבר של hiPSC.
(A) תמונת BF של קו hiPSC אחד גדל באופן ידני (משמאל) ובשימוש במערכת התרבות האוטומטית (מימין). התמונות צולמו 6 ימים לאחר המעבר השני; (ב)תמונות מייצגות של hiPSC מוכתמות עבור סמני pluripotency OCT4 ו- SSEA4, ומוכתמות עם Hoechst 33342 (Nuclei); (ג)תוצאות qRT-PCR עבור סמני pluripotency OCT4, NANOG ו REX1 בקו hiPSC אחד מעובד בכפילויות (1 ו 2) באופן ידני (m) ובמערכת התרבות האוטומטית (a), ואת הנוירונים הקליפתיים נגזר hiPSC בהתאמה (Diff) ביום 8 (D8) של בידול. הנתונים מיוצגים בשם הכמות היחסית (RQ) באמצעות iPS_a_1 כדגימה לעיון. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD) מ- 3 שכפולים טכניים של תגובת qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 ו RPLPO שימשו כגנים משק בית. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5: נוירונים קליפתיים הנגזרים על-ידי IPSC.
(א)תמונות ברייטפילד של היום 6, באופן ידני (m) ואוטומטי (א) נוירונים קליפתיים מובדילים המציגים רשתות עצביות דומות; (ב)תמונות מייצגות של תאים מוכתמים עבור TUBB3 (נוירונל פאן), BRN2 (נוירונים קליפתיים) ו Hoechst 33342 (גרעין) ביום 8 של בידול; (ג)תוצאות qRT-PCR עבור גנים סמן של נוירונים קליפתיים (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 ו SYN1) מועשר ביום 8 (D8) של בידול. הנתונים מיוצגים בשם הכמות היחסית (RQ) באמצעות iPS_a_1 כדגימה לעיון. קווי שגיאה מייצגים את ה-SD מ- 3 שכפולים טכניים של תגובת qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 ו RPLPO שימשו כגנים משק בית. סרגל קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6
איור 6: תפוקה גבוהה עבור נורייט.
(א)תמונות מייצגות של GFP המביעים תאים בימים 1, 3 ו-11 של בידול; (ב)תמונות בינאריות מייצגות של נורייטים בימים 1, 3 ו-11 של בידול. ההתנוי של neurite היה מכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונת תוכן גבוהה 1 והוא מיוצג כאורך neurite; (ב) הגרפיקה מציגה את העלייה באורך הנורייטים בנוירונים NGN2 הנגזרים מ-NPC ובהיוצרות רשת צפופה. שלוש צלחות 96 באר עם תאים ב 60 בארות הפנימיות הם בתמונה. לפשטות, רק שלוש עמודות של בארות לכל לוח 96 באר מוצגות כדוגמה עם n = 6 בארות לכל עמודה. ממוצע של 1308 תאים נותחו לבאר. קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של ממוצע (S.E.M.). סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7
איור 7: נוירונים אנושיים הנגזרים מ-IPSC.
נוירונים DA המוח האמצעי מובדילים באופן ידני (m) ובמערכת התרבות האוטומטית (א). (A, B) תמונות פלורסנט מייצגות של נוירונים מד"א מוכתמים עבור טירוסין hydroxylase (TH, סמן נוירון MDA; ירוק), MAP2 (סמן עצבי; אדום) ו Hoechst 33342 (גרעין; כחול); (ג)תוצאות QRT-PCR מייצגות עבור גנים סמן של נוירונים MDA מובדיל באופן ידני ובמערכת התרבות האוטומטית. רמות הביטוי TH ו- MAP2 מיוצגות ככמות יחסית (RQ) המנורמלת לגנים של משק בית (OAZ1 ו- GAPDH); (D)אחוזים של תאי TH ו- MAP2 חיוביים שנוצרו על ידי בידול ידני ואוטומטי. קווי שגיאה מייצגים את ה- SD של שתי בדילות עצמאיות המבוצעות עם שתי שורות iPSC נפרדות (#1 #2). סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

סוג תאמטרהשלב פרוטוקולצפיפות תאיםתבנית לוחמספר תא/באר
בדיל NGN2
iPSC (IPSC)NGN2 יצירת קו יציבס.2.3.30,000 תאים/ס"מ2 12 בארות1,17,000
iPSC (IPSC)בדיל נוירון NGN23.1.3.30,000 תאים/ס"מ2 1-באר25,20,000
iPSC (IPSC)בדיל נוירון NGN23.1.3.30,000 תאים/ס"מ2 96 באר9,600
דור smNPC
ת'ןונויום ה-12 וה-16ס.נ.ט. ו-S5.11.70,000 תאים/ס"מ2 6-באר6,72,000
ת'ןונומתעוות ממעבר 55.11.50,000 תאים/ס"מ2 6-באר4,80,000
ת'ןונוsmNPC לנוירונים NGN23.2.250,000 תאים/ס"מ2 96 באר16,000
בדיל בין מ.א.
iPSC (IPSC)בדיל נוירון mDA4.1.2.200,000 תאים/ס"מ2 1-באר1,68,00,000
נוירונים של התובע המחוזיהיום ה-254.3.2.400,000 תאים/ס"מ2 1-באר3,36,00,000
נוירונים של התובע המחוזיהיום ה-254.5.2.100,000 תאים/ס"מ2 96 באר32,000
ציפוימטרהשלב פרוטוקולריכוז /
דילול		תבנית לוחפרטי ציפוי
תרבות IPS
מטריצה ExtracellularIPSC, קו NGN2,
נוירונים mDA		1.5.7. ו-S2.3.1 עלי ותו לא
25 מ"ל DMEM/F-12		1-/12-באר8/0.5 מ"ל/טוב; שעה אחת ב- RT
בדיל NGN2
פולי-ל-אורניתיןבדיל נוירון NGN23.1.3 ו-3.2.2.0.1 מ"ג/מ"ל; Pbs1-/96-באר8/0.1 מ"ל/טוב; 12 שעות ב-37 מעלות צלזיוס;
3 שטיפת PBS
למינין (11בדיל נוירון NGN23.1.3 ו-3.2.2.5 μg/ מ"ל; Pbs1-/96-באר8/0.1 מ"ל/טוב; 4 שעות ב-37° צלזיוס
דור smNPC
מטריצה Extracellularדור ותרבות smNPCS5.6., S5.9.,
ס.נ5.11 .		1 עלי ותו לא
25 מ"ל DMEM/F-12		6-באר1 מ"ל; 2 שעות ב- RT
בדיל בין מ.א.
מטריצה Extracellularבדיל בין מ.א.4.1.2.1 עלי ותו לא
25 מ"ל DMEM/F-12		1-באר12 מ"ל; 12 שעות ב- 37° צלזיוס
פולי-ל-אורניתיןבדיל בין מ.א.4.3.2 ו-4.5.2.0.1 מ"ג/מ"ל; Pbs1-/96-באר12/0.1 מ"ל/טוב;
12 שעות ב-37 מעלות צלזיוס; 3 שטיפת PBS
למינין (11בדיל בין מ.א.4.3.2 ו-4.5.2.10 μg/ מ"ל; Pbs1-/96-באר12/0.1 מ"ל/טוב; 12 שעות ב- 37° צלזיוס
פיברונקטין (פיברונטין)בדיל בין מ.א.4.3.2 ו-4.5.2.2 μg / מ"ל; Pbs1-/96-באר12/0.1 מ"ל/טוב; 12 שעות ב- 37° צלזיוס
*aliquot מטריצה חוץ-תאית מוגדרת כגורם דילול (ב- μL) הקיים בתעודת הניתוח של מוצר זה.

טבלה 1: זריעת צפיפות תאים וציפוי בהתאמה לתבנית הלוח.

יוםמגיב
יום 0 - 1100 00 00 00 00:00:00,000 00 00:00,000 --& 10 μM SB431542
היום הראשון - 3100 00 00 00:00:00,000 00:00,000 --&10 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 00:00,000 --&2
100ng/מ"ל FGF-8b
היום ה-3 - 5100 00 00 00:00:00,000 00:00,000 --&10 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 00:00,000 --&2
100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021
היום ה- 5 - 7100 00 00 00:00:00,000 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&10:00,0
3 μM CHIR99021
היום ה-7 - 9100 00 00 00 00:00:00,000 00:00,000 00:00,000 --& 1 00:00:00,000 --& 100 00:00:00,000 --&
היום ה-9 - 11100 00 00 00 00:00:00,000 00:00,000 00:00,000 --& 1 00:00:00,000 --& 100 00:00:00,000 --&
היום ה-11 - 133 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0.2 מ"מ חומצה ל' אסקורבית (AA1), 20 ng/mL
GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT
היום ה-13 - 6520 ng/mL BDNF, 0.2 מ"מ חומצה אסקורבית (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP,
1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT

טבלה 2: תוספת מולקולה קטנה עבור בידול נוירון דופאמין.

יוםKSR בינוניN2 בינונימדיום בדיל
יום 0 - 1100%00
היום הראשון - 3100%00
היום ה-3 - 5100%00
היום ה- 5 - 775%25%0
היום ה-7 - 950%50%0
היום ה-9 - 1125%75%0
היום ה-11 - 1300100%
היום ה-13 - 6500100%

טבלה 3: מעבר צבע מדיה עבור בידול נוירון דופאמין.

קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

אנו מציגים מערכת תרבות תא אוטומטית עם יכולות הדמיה משולבות לסטנדרטיזציה של תרבות hiPSC ובדידול עצבי. בשל התערבות מינימלית של המשתמש, וריאציה ניסיונית היא נמוכה להבטיח שכפול של פנוטיפים תאיים במהלך בידול. מתזמן מבוסס לוח השנה תומך בארגון ובהקבלה מקבילית של ניסויים ומאפשר רמה גבוהה של גמישות בזמן ביצוע הניסויים. ניתן להתאים בקלות שיטות קיימות ותואם את הספקטרום של השיטות הזמינות. בנוסף, ניתן להשתמש במספר גדול של תבניות לוח אסההוספה לגמישות של מערכת זו. המערכת המינימלית המורכבתמאינקובטור CO 2, זרוע רובוטית, ציטומטר תא brightfield, ותחנה לטיפול בנוזלים מהווה את היחידה הבסיסית הדרושה לתרבות ובדידול של hiPSC, עם עלויות סבירות למעבדות מחקר אקדמיות. השילוב של מערכת תרבות התא האוטומטית עם מערכת אחסון אוטומטית של -20 °C לאחסון תרכובות, ספריות RNAi או ספריות CRISPR/Cas9, ושילוב של מיקרוסקופ בעל תוכן גבוה/תפוקה גבוהה מאפשר ביצוע של הקרנות פנוטיפיות.

במחקר הנוכחי, מערכת תרבות התא האוטומטית השתמשה בטיפים חד פעמיים ומדיית התרבות התמלאה מחדש באופן ידני לתוך המאגר, ובכך מגבילה את השימוש בתחנת הטיפול הנוזלי לשינויים בתקשורת ובתהליכי תרבות אחרים במיוחד בן לילה. כדי לעקוף מגבלה זו, ניתן לכוונן את השיטות לשימוש במחטים במקום טיפים חד פעמיים, ולאחר התקנת חיבורי צינור בין קווי מדיה ושקיות מדיה המאוחסנים במקרר, ניתן למלא מחדש באופן אוטומטי מאגרי מדיה עם מדיה טרייה המחממת מראש על ידי רכיבי חימום. פעולה זו תפחית את הפרעות המשתמש הנגרמות על ידי מילוי ידני של עצות, מדיה תרבות וחילופי מאגרים.

מערכת תרבות התא האוטומטית שלנו מציעה מספר יתרונות. אחת מהן היא מערכת המעקב אחר ברקודים. הצלחות שנטענו במערכת מזוהות על ידי ברקוד ייחודי אשר נקרא ושמור על ידי המערכת המאפשר מעקב אחר דגימות במהלך ואחרי ביצוע פעולת השירות. יתרון נוסף הוא האפשרות ליצור פרוייקטים ספציפיים למשתמש. כאן, ניתן להקצות לוחות תרבות הטעונים במערכת לפרוייקט מסוים ולקבוצה בקבוצות. ההתנה בקבוצות מפשטת את הביצוע של אותו הליך לכל הצלחות של אצווה מסוימת מאחר שאין צורך לבחור לוחות בודדים. בנוסף, עורך מחלקה נוזלי מאפשר להתאים את מהירות ההתכונות והגובה, כמו גם את השאיפה וחלוקת פרמטרים עבור כל שלב העברה נוזלית. כל תהליך מתועד בקבצי יומן רישום המאפשר לשחזר אילו משימות בוצעו עבור תרבות נתונה או לוח תסה.

נוירונים וסוגי תאים אחרים הנגזרים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים (hiPSC) שימושיים במבחנה כלים לחקר המנגנונים של מחלות ניווניות באוכלוסיות ספציפיות החולה (למשל נוירונים דופאמין למחלת פרקינסון) מציע את האפשרות להקרנות סמים מותאמות אישית. Culturing hiPSC הוא זמן רב מאוד ודורש אנשים מיומנים לבצע פרוטוקולי בידול מורכבים, בדרך כלל מוגבל לייצור בקנה מידה נמוך. התאמנו את התרבות ללא מאכיל של hiPSC לתרבות אוטומטית ויישמנו שני פרוטוקולי בידול עצבי, פרוטוקול בידול נוירון קליפתי מהיר המבוסס על NGN2 ביטוי יתר תחתמקדם טט על 10,11, ופרוטוקול מבוסס מולקולה קטנה לטווח ארוך לדור של נוירונים דופאמין (mDA) אמצע המוח (mDA)13. ההעברה וההעתקה הפשוטה של פרוטוקולי תרבות ובידול ידניים הופכים את מערכת התרבות האוטומטית לשימושית מאוד. IPSC האנושי תרבותי במערכת תרבות התא האוטומטית הראה מורפולוגיה עקבית של תאי גזע והביע סמנים פלורופוטניים חשובים, לשחזור בין ניסויים עצמאיים. בנוסף, האוטומציה של פרוטוקול תרבות hiPSC העדיפה את התרבות וההרחבה של מספר גדול יותר של קווי תאים במקביל. בדיקות קונפלואנציות אוטומטיות המתוכננות להתבצע במשך הלילה וזמן פנוי, משאירות את המערכת חופשית במהלך היום עבור שלבי תהליך במורד הזרם שבוצעו כאשר המשתמש היה במעבדה (לדוגמה, קצירת תאים או תפרה ידנית עבור בידולים). בהגעה לסף ההתכנסות המוגדר על-ידי המשתמש, התאים מועברים ומרוחים מחדש ללחות חוץ-תאיות מצופים במטריצה הזמינות בערימה של מערכת תרבות התא האוטומטית. כל סיבוב מעבר לוקח כ-70 דקות ויוצר ארבע צלחות באר אחת מצלחת אב אחת, המתורגם לקיבולת של 20 מעברים ביום.

האוטומציה של פרוטוקול ההבידול NGN2 נעשתה בהצלחה ואפשרה לדור של אוכלוסייה הומוגנית של תאים עצביים על פני מעברים שונים ודומה להבדילים ידניים. יתר על כן, העלויות הניסיוניות עבור מחקרי סינון בקנה מידה גדול מעורבים קווי תאים מרובים או ניסויי הקרנה עם אלפי תנאי בדיקה / תרכובות יופחתו בשל בידות מהירות. ניתן לפתח, ליישם ולהשתמש בהם בקלות כקריאות פנוטיפיות למודלים של מחלות, כפי שהראהבעבר 14,15,16. לכן, התאמנו עוד יותר את פרוטוקול NGN2 באמצעות מולקולה קטנה נגזרת תאי מבשר עצבי (smNPC) כי באופן זמני over-express GFP. תאי SmNPC מציעים יתרונות נוספים, כולל עלויות מופחתות עם מדיה תרבות (שליש מהעלות עם תרבות iPSC) וזמן הנדרש כדי להגדיל את הניסויים. תפוקת התא מ smNPC הם 7 עד 10 פעמים גבוה יותר מזה שהושג עם iPSC. נוירונים מבדיל היו בהצלחה במעקב ותמונה במשך כמה ימים באמצעות תהליך הדמיה אוטומטי לחלוטין ללא צורך של כתמי נוגדנים ידניים או תיוג כימי, חיסכון בעלויות ובזמן הנדרש עבור הליכים ידניים כולל ההדמיה בפני עצמו. ההדמיה הנוכחית של 60 בארות פנימיות של צלחת 96-באר לוקח סביב 16 דקות לכל צלחת כאשר 25 שדות לכל באר הם תמונה, מה שאומר כי הנתונים עבור הקרנה מבוססת הדמיה עבור 1000 תרכובות, ניתן לרכוש ולנתח ביום. בעתיד, קריאה זו יכולה לשמש במחקרי סינון מורכבים להצלת פגמים נורייט ים.

יתר על כן, אנו גם להפגין את ההעברה של פרוטוקול בידול ידני ליצירת דופאמין באמצע המוח (mDA) נוירונים מ iPSC. פרוטוקול בידול קטן זה מבוסס מולקולה לוקח 65 ימים והוא עבודה אינטנסיבית בגלל שלבי replating מרובים ושינויים תכופים במדיה, בעיקר כל 2 ימים, אשר מגביל את הייצור של נוירונים MDA כמה קווי iPSC באותו זמן. פרוטוקול בידול MDA האוטומטי יש את היתרון הגדול של שינוי קנה המידה של ההבידול לעשרות קווי iPSC. ניתן להבדיל בין עד 30 קווי תאים במקביל. מכיוון שהבידול מבוסס בעיקר על שינויים בתקשורת, כמעט כל תהליך ההבידול יכול לתנהל ללא התערבות אנושית. באמצעות מתזמן לוח השנה של המערכת האוטומטית, אנו יכולים לתכנן את שינויי המדיה בהתאם לצעדי הבידול. מגבלה אחת של עבודה עם מספר כה גדול של קווי תאים וצלחת תרבות הייתה חוסר האפשרות לבצע שינויים במדיה בן לילה. הסיבה העיקרית היא העובדה שהמערכת שלנו מוגדרת לשימוש בטיפים חד פעמיים ומילוי ידני של מדיה תרבות המחייבת משתמש במעבדה לבצע שלב ידני זה. כדי להקל על תהליך שינוי המדיה, לוחות שנטענו במערכת הוקצו לפרוייקט וקיבלו קיבוץ באצוות. גודל האצווה הותאם לאחר מכן למספר הטיפים החד-פעמיים ונפח המדיה של התרבות הזמינים. כפי שנדון לעיל, מגבלה זו יכולה להתגבר בקלות על ידי יישום של מחטים הניתנות לשטיפה/רחיצה ומילוי אוטומטי של מדיה. מעבר/הפצה אוטומטיים של תאים, כפי שהראה עבור iPSC, היא אחת הנוחיות המוצעות על ידי מערכת תרבות התא האוטומטית שלנו. בדקנו את ההתזה האוטומטית של תאי העצב של משרד העבודה ביום ה-25 של בידול. עם זאת, ניתוק של נוירונים MDA דורש יותר (40 דקות) דגירה עם אנזים דיסוציאציה מאשר iPSC (8 דקות) הרחבת תהליך replating אוטומטי ליותר מ 1 שעה לכל קווי תא. כתוצאה מכך, ההתפלה האוטומטית של 30 קווי תאים באותו יום הפכה לבלתי אפשרית. להאיץ שלבים אחרים במהלך replating אוטומטי (הובלה של צלחות, pipetting) והתאמה של המערכת לשימוש מחטים וקו מדיה שעושה עבודה לילה אפשרי תפתור מגבלה זו. למרות החסרונות, אנחנו יכולים להעביר בהצלחה את הפרוטוקול הידני לבידול אוטומטי של נוירונים MDA לייצר תרבויות עם כמויות משמעותיות של MAP2 (נוירון) ו TH (נוירונים mDA) תאים חיוביים.

ביבדיל עשרות קווי תאי iPSC במקביל הוא עניין רב בפרויקטים לחקור את המנגנונים המולקולריים של מחלות ניווניות, כולל מחלת פרקינסון. עם זאת, להשלים משימות מהר יותר עם פחות שגיאות ובעלויות מופחתות הוא אתגר גדול. בשל האוטומציה של הפרוטוקולים המוצגים כאן (iPSC, smNPC ונוירון MDA), אנחנו יכולים להאיץ, להפחית את העלויות ולהגדיל את הרבייה בפרויקטים שלנו. פיתוח פרויקטים כמו FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) הכוללים מאות קווי תאים של מטופלים מראה צורך בתרבות אוטומטית ובפרוטוקולי בידול. נקודות המבט העתידיות שלנו כוללות העברה של מודלים ידניים של תרבות תאים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) למערכת האוטומטית. התאמות מינוריות בהגדרות הגדרת הלוח והשימוש בהתאמאים יאפשרו שימוש בצלחות מסחריות או מותאמות אישית ותאים מיקרו-נוזלים הנדרשים עבור תרבויות תלת-מית-מי-די. יתר על כן, היישום של מודל הדמיה אוטומטי ללא תוויות יאפשר לנו לעקוב אחר הצמיחה העצבית בזמן אמת ולתרגם שינויים בצמיחה neurite, ארגון נוירון ומוות תאים להבנה טובה יותר של מנגנוני המחלה.

גילויים

אין לנו מה לחשוף.

תודות

המחברים מכירים בהכרת תודה לחולים ומשפחותיהם שתרמו חומר ביולוגי למחקר זה. קווי תאים המשמשים במחקר היו מאוסף NINDS עם Rutgers (ND41865 כמו iPS #1) ואת המעבדה של ד"ר טילו Kunath (iPS #2). עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי קרן NOMIS (PH), RiMod-FTD, תוכנית משותפת של האיחוד האירופי - מחקר מחלות ניווניות (JPND) (PH); יוזמת DZNE I2A (AD); PD-Strat, פרויקט במימון ERA-Net ERACoSysMed (PH) ויוזמת הנתונים היסודות למחלת פרקינסון (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD היא חלק מתוכנית PATH ל-PD של קרן מייקל ג'יי פוקס. המחברים מודים סטיבן פינקביינר ומלאני קוב (מכוני גלדסטון) על תרומתם להקמת פרוטוקול בידול נוירון MDA ידני ומומי סוזוקי (חברת החשמל יוקוגאווה) לסיוע בהגדרת ניתוח גידול neurite.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>נוגדנים<חזק>מפיץ<חזק>מספר קטלוגי<חזק>דילול
<חזק>iPSC סמן פלוריפוטנטי
עכבר נגד SSEA4Abcamab162871 עד 33
ארנב אנטי-אוקט3/4Abcamab198571 עד 200
<חזק>סמני נוירונים NGN2
עכבר נגד TUBB3R & DMAB11951 עד 500
ארנב אנטי-BRN2NEB121371 עד 1,000
<חזק>mDA סמני נוירון
עוף נגד THPel-Freez ביולוגיים121371 עד 750
עכבר אנטי-MAP2סנטה קרוזsc-744211 עד 750
<חזק>נוגדנים משניים
עיזים נגד עוף IgY, Alexa Fluor 488InvitrogenA110391 עד 2,000
עיזים נגד עכבר IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA110291 עד 2,000
עז נגד עכבר IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA110321 עד 2,000
עז נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA110081 עד 2,000
עז נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA110081 עד 2,000
עז נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA110121 עד 2,000
<חזק>גרעינים נגדיים
Hoechest 33342InvitrogenH35701 עד 8,000
<חזק>מכשירים <חזק>מפיץ<חזק>מספר קטלוגי<חזק>תיאור/יישוםAgilent
TapeStation מערכת AgilentTechnologies4200אלקטרופורזה אוטומטית
לדגימות DNA ו-RNA
אוטומטי -20 & deg; מערכת אחסון CHamilton Storage
Technologies		מנהל גישה לדוגמא
(SAM -20C, סדרה 3200)		אחסון ריאגנטים
קורא ברקודHoneywellקורא ברקוד אורביטסורק ברקוד
Brightfield תא ציטומטNexcelomCeligoבדיקת מפגש ו
ספירת תאים
CellVoyager 7000YokogawaCellVoyager 7000מיקרוסקופ קונפוקלי
אוטומטי
Cytomat לתרביות תאיםThermo Fisher ScientificCytomat 24 C, CU12 מערמים גובה 28 מ"מ,
12 מערמים גובה 23 מ"מ
(סה"כ 456 צלחות)
Cytomat להפשרת דגימותThermo Fisher ScientificCytomat 2-LIN, 60 DU
(יחידת ייבוש)		2 מערמים גובה 28 מ"מ
(סה"כ 42 צלחות)
מסנני HEPAהמילטון רובוטיקהHood Flow Star UVשונה על ידי Hamilton
Robotics
תחנת טיפול בנוזליםHamilton RoboticsMicrolab ערוצי כוכבים: 8x 1-ml, 4x 5 מ"ל
ו-96 ערוצים מאגר מדיה MPH
המילטון רובוטיקס188211APEמאגר מדיה/ריאגנטים
מערכת מים טהוריםVeolia WaterELGA PURELAB Classicמספק מים טהורים עבור תחנת שטיפת מחטים
QuantStudio 12K Flex בזמן אמת
PCR מערכת תרמו		פישר מדעיQSTUDIO12KOAמכונת PCR בזמן אמת
זרוע רובוטיתהמילטון רובוטיקהRackrunnerהובלת צלחות
שולחן סיבובהמילטון רובוטיקהשולחן סיבוב התאמתכיוון צלחת
אספקת חשמל ללא הפרעהAPCחכם UPS RT יחידה,
10000 VA כוח אספקת		אספקת חשמל גיבוי
VIAFLO-pipettesאינטגרה4500פיפטה אלקטרונית
ViiA 7 מערכת PCR בזמן אמתיישומי ביו-סיסטמס4453545מכונת
<חזק>חומרים<חזק>מפיץ<חזק>מספר קטלוגי< חזק>הערות
צלחת תרבית 1 בארות (84 ס"מ2)Thermo Fischer Scientific165218Nunc OmniTray
צלחות תרבית 6 בארות (9.6 ס"מ2)Greiner Bio-One657160TC מטופל במכסה
צלחת תרבית 12 בארות (3.9 ס"מ2)Greiner Bio-One665180TC מטופל במכסה
צלחת תרבית 96 בארות (0.32 ס"מ2)Perkin Elmer6005558CellCarrier-96 קצות צלחת
שחורה, 50-& LHamilton Robotics235987טיפים של 50-uL טיפים
, 300-ומיקרו; LHamilton Robotics235985300-µ טיפים L
טיפים, 1000-ומיקרו; Lהמילטון רובוטיקס2359391000-ומיקרו; טיפים לטיפים
, 5 מ"להמילטון רובוטיקה1840225 מ"
טיפים צינורות, 15 מ"לגריינר ביו-וואן188271צינורות 15 מ"ל
צינורות, 50 מ"לגריינר ביו-וואן22726150 מ"ל בקבוקונים
קריוגניים של Nalgene 2.0 מ"לסיגמא אולדריץ'V5007קריוביאלים
>פלסמידים>Distributorמספר קטלוגיNotes
pLV_hEF1a_rtTA3Addgene61472מתנה אדיבה מרון וייס
pLV_TRET_hNgn2_UBC_PuroAddgene61474מתנה אדיבה מרון וייס
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirusTakara Bio631983
<חזק>פריימרים<חזק>רצף (קדימה)<חזק>רצף (הפוך)<חזק>מקור
<חזק>iPSC פלוריפוטנטיות
OCT4 (מזהה 4505967a1)CTTGAATCCCGAATGGAAAGGGGTGTATATCCCAGGGATCCTCPrimerBank
NANOG (מזהה 153945815c3)CCCCAGCCTTTACTCTTCCTACCAGGTTGAATTGTTCCAGGTCPrimerBank
REX1 (ID 89179322c1)AGAAACGGGCAAAGAAGACGCTGACAGGTTCTATTTCCGCPrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1)CTCAGCACCGCTAACAGAGGCATTGGCGCTTCGGACAAGPrimerBank
BRN2 (מזהה 380254475c1)CGGCGGATCAAACTGGGATTTTTGCGCTGCGATCTTCTATPrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2)CGAGACCTCCACACTTCGTGTGTTTTTCCGCCTCATCTCTGPrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3)TGTCCGATTCATAGTCCTGTCCCTCACAGGATAAGTGCCCTCPrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)TGCTCAGCAGTACAACGTACCGACACTTGCGATGTCCTGAAPrimerBank
mDA neurons
THCGGGCTTCTCGGACCAGGTTACTCCTCGGCGGTCTCCANCBI פריימר-פיצוץ
MAP2GGATCAACGGAGAGCTGACTCAGGACTGCTACAGCCTCANCBI פריימר-בלסט
חזק>משק בית גנים
GAPDHGAAATCCCATCACCATTCTCCAGGGAGCCCCAGCCTTCTCCATGNCBI פריימר-פיצוץ
OAZ1AGCAAGGACAGCTTTGCAGTTATGAAGACATGGTCCTCGNCBI פריימר-פיצוץ
RPLPOCCTCATATCCGGGGGAATGTGGCAGCAGCTGGCACCTTATTGNCBI פריימר-פיצוץ
RPL13AGCCTACAAGAAAGTTTGCCTATCTGGCTCTCTTTCCTCTCTCCTCNCBI פריימר-פיצוץ
<חזק>מדיה וריאגנטים<חזק>מפיץ<חזק>מספר קטלוגי><חזק>השתמש בריכוז
<חזק>מטריצת ציפוי
מטריצה חוץ-תאית (מטריג'ל)קורנינג35427710 μ גרם/מ"ל
פיברונקטיןקורנינג3560082 μ גרם/מ"ל
למיניןסיגמאL20205 - 10 μ גרם/מ"ל
פולי-L-אורניתין (PLO)סיגמאP36550.1 מ"ג/מ"ל
<חזק>חומרי תרבית
מדיום תרבית iPSC בינוני
(מדיום חיוני 8 Flex)		תאי עצב GibcoA2858501
<חזק>NGN2 - NGN2 בינוני
2-מרקפטואתנולGibco219850230.909 מ"ל (50 ומיקרו; M)
תוסף B27Gibco1258701010 מ"ל (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAXGibco31331093484.75 מ"ל
GlutaMAXGibco350500385 מ"ל (2 מ"מ)
אינסוליןSigmaI92780.25 מ"ל (2.5 ומיקרו; גרם/מ"ל)
MEM חומצות אמינו לא חיוניותGibco111400505 מ"ל (0.5%)
תוסף N2Gibco175020485 מ"ל (0.5%)
נוירונים נוירובזאליים בינונייםGibco21103049485 מ"ל
<חזק>mDA נוירונים - SRM בינוני
2-מרקפטואתנולGibco219850230.5 מ"ל (55 ומיקרו; M)
GlutaMAXGibco350500385 מ"ל (2 מ"ל
Knockout DMEM/F-12Gibco12660012409.5 מ"ל
החלפת סרום נוקאאוט
(החלפת סרום)		Gibco1082802875 מ"ל (15%)
MEM חומצות אמינו לא חיוניותGibco111400505 מ"ל (1%)
פניצילין-סטרפטומיציןGibco151401225 מ"ל (1%)
<חזק>mDA נוירונים - N2 בינוני
B27 תוסףגיבקו1258701010 מ"ל (2%)
GlutaMAXGibco350500385 מ"ל (2 מ"מ)
תוסף N2Gibco175020485 מ"ל (1%)
Neurobasal mediumGibco21103049475 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיציןGibco151401225 מ"ל (1%)
<חזק>mDA נוירונים - תאי עצב בינוניים
B27Gibco1258701010 מ"ל (2%)
מדיום נוירובזאליGibco21103049485 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיציןGibco151401225 מ"ל (1%)
<חזק>NGN2 נוירונים - תוספי תזונה נוירוטרופי חזק>
מוחי שמקורו במוח
(BDNF)		Peprotech450-0210 ננוגרם/מ"ל
CHIR99021 (CHIR)R& D4423/102 μ M
דוקסיצילין (דוקס)SigmaD98912.5 μ גרם/מ"ל
פקטור נוירוטרופי שמקורו בגליה
(GDNF)		פרוטק450-1010 ננוגרם/מ"ל
חומצה L-אסקורבית 2-פוספט
מגנזיום (AA2)		סיגמאA896064 מ"ג/ליטר
פקטור נוירוטרופי -3 (NT-3)פרוטק450-1010 ננוגרם/מ"ל
פורמורפמין (PMA)קיימן100096340.5 μ M
PuromycinSigmaP8833-10MG0.5 μ גרם/מ"ל
תיאזוביביןמרק Millipore420220-10MG2 μ נוירונים M
mDA - תוספי מזון
גורם נוירוטרופי שמקורו במוח
(BDNF)		Peprotech450-0220 ננוגרם/מ"ל
CHIR99021 (CHIR)R& D4423/103 μ M
DAPTקיימן1319710 ומיקרו; M
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)SigmaD06271 מ"מ
גורם גדילה פיברובלסטים 8B (FGF-8b)פרוטק100-25100 ננוגרם/מ"ל
גורם נוירוטרופי שמקורו בגליה
(GDNF)		פרוטק450-1020 ננוגרם/מ"ל
חומצה L-אסקורבית (AA1)סיגמאA44030.2 מ"מ
LDN193189 (LDN)קיימן11802100 nM
פורמורפמין (Purm)קיימן100096342 μ M
סוניק קיפוד/SHH (C24II)
N-Terminus (SHH)		R& D1845-SH100 ng/mL
SB431542 (SB)קיימן1303110 μ M
סוג גורם גדילה טרנספורמציה ß 3
(TGFß 3)		מו"פ D243-B31 ננוגרם/מ"ל
Y-27632קיימן1000558310 ומיקרו;
ריאגנטים M<חזקים>דיסוציאציה
מגיב דיסוציאציה של תאים בודדים
(StemPro Accutase)		GibcoA11105011x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Gibco11575020בידוד RNA 0.5 מ"מ
<חזק>RNA וערכת cDNA
Qiagen74106Rneasy MiniKit
מאגר ליזה RNAThermo Fisher Scientific15596018מאגר ליזה טריזול (RNA
lysis buffer)
Reverse Transcriptase (kit)Thermo Fisher Scientific18080-085SuperScript III הפוך
Transcriptase
SoftwareCompanyCatalog NumberDescription/Application
Cell Culture Framework (CCF)
(ממשק משתמש גרפי, GUI)		Hamilton Roboticsמותאם אישיתלמערכת האוטומטית
תוכנת CellPathFinder
(תוכנת ניתוח תמונות 1)		YokogawaCellPathfinder HCS תוכנהכלי לניתוח תמונות
מערכת מדידה CellVoyagerYokogawaכלולה ב
CellVoyager 7000		מיקרוסקופ בקרת
תוכנת קולומבוס תוכנה
(תוכנת ניתוח תמונה 2)		Perkin ElmerColumbusכלי ניתוח תמונה
מבוסס ענן qPCR אפליקציהThermo Fisher ScientificThemo Fisher תוכנת ניתוח ענןעבור
qRT-PCR נתונים
ונוס תוכנההמילטון רובוטיקהVENUS Two Dynamic
Schedular 5.1 תוכנה		בקרת תוכנה למערכת האוטומטית
PCR בזמן אמתל <חזקים<) ממשק משתמש

מקורות

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
  3. Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177(2019).
  4. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  5. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
  6. Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
  7. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647(2015).
  8. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755(2015).
  9. Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
  10. Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760(2014).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252(2013).
  13. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  14. Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811(2015).
  15. Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
  16. Mehta, S. R., et al. Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
  17. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134(2012).
  18. Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, Database issue 792(2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

hiPSCNeurogenin 2

מאמרים קשורים