מאמר שיטה

צינור ביואינפורמטיקה לחקירת אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות RNA-seq

DOI:

10.3791/61633

⸱

28 במאי 2021

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את האבולוציה והביטוי של גנים מועמדים באמצעות נתוני רצף RNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיקוק ודיווח על ערכות נתונים גדולות, כגון נתוני גנום שלם או תעתיק, הוא לעתים קרובות משימה מרתיעה. אחת הדרכים לפרק את התוצאות היא להתמקד במשפחות גנים אחת או יותר שהן משמעותיות לאורגניזם ולחימוד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים ביואינפורמטיים כדי ליצור פילוגנית ולכמת את הביטוי של גנים מעניינים. עצים פילוגנטיים יכולים לתת תובנה כיצד גנים מתפתחים בתוך ובין מינים, כמו גם לחשוף אורתולוגיה. תוצאות אלה ניתן לשפר באמצעות נתוני RNA-seq כדי להשוות את הביטוי של גנים אלה אצל אנשים שונים או רקמות. מחקרים על אבולוציה מולקולרית וביטוי יכולים לחשוף דרכי אבולוציה ושימור של תפקוד גנים בין מינים. אפיון משפחת גנים יכול לשמש כקרש קפיצה למחקרים עתידיים ויכול להדגיש משפחת גנים חשובה בנייר גנום או שעתוק חדש.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות בטכנולוגיות הרצף אפשרה רצף של גנומים ותעתיקים של אורגניזמים שאינם מודלים. בנוסף להיתכנות המוגברת של רצף DNA ו- RNA מאורגניזמים רבים, שפע של נתונים זמין לציבור כדי לחקור גנים מעניינים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק צעדים ביואינפורמטיים כדי לחקור את האבולוציה המולקולרית ואת הביטוי של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב באורגניזם של עניין.

חקירת האבולוציה של גן או משפחת גנים יכולה לספק תובנה על האבולוציה של מערכות ביולוגיות. בני משפחת גנים נקבעים בדרך כלל על ידי זיהוי מוטיבים שמורים או רצפי גנים הומולוגיים. האבולוציה של משפחת הגנים נחקרה בעבר באמצעות גנומים מאורגניזמים מודלים הקשורים מרחוק1. מגבלה לגישה זו היא שלא ברור כיצד משפחות גנים אלה מתפתחות במינים קרובים ותפקידם של לחצים סלקטיביים סביבתיים שונים. בפרוטוקול זה, אנו כוללים חיפוש אחר הומולוגים במינים קרובים. על ידי יצירת פילוגנית ברמת פילום, אנו יכולים לציין מגמות באבולוציה של משפחת גנים כגון זו של גנים שמורים או כפילויות ספציפיות לשושלת. ברמה זו, אנו יכולים גם לחקור אם גנים הם אורתולוגים או paralogs. בעוד homologs רבים סביר לתפקד באופן דומה זה לזה, זה לא בהכרח המקרה2. שילוב עצים פילוגנטיים במחקרים אלה חשוב לפתור אם גנים הומולוגיים אלה הם אורתולוגים או לא. באיקריוטים, אורתולוגים רבים שומרים על תפקודים דומים בתוך התא כפי שמעידים היכולת של חלבוני יונקים לשחזר את תפקודם של אורתולוגים שמרים3. עם זאת, ישנם מקרים שבהם גן לא אורתולוגי מבצע פונקציה מאופיינת4.

עצים פילוגנטיים מתחילים לתוות יחסים בין גנים ומינים, אך לא ניתן להקצות את הפונקציה אך ורק על סמך יחסים גנטיים. מחקרי ביטוי גנים בשילוב עם ביאורים תפקודיים וניתוח העשרה מספקים תמיכה חזקה לתפקוד הגנים. מקרים שבהם ביטוי גנים ניתן לכמת ולהשוות בין אנשים או סוגי רקמות יכול להיות יותר לספר על תפקוד פוטנציאלי. הפרוטוקול הבא עוקב אחר שיטות המשמשות בחקירת גנים opsin ב הידרה וולגריס7, אבל הם יכולים להיות מיושמים על כל מין וכל משפחת גנים. התוצאות של מחקרים כאלה מספקות בסיס להמשך חקירה של תפקוד גנים ורשתות גנים באורגניזמים שאינם מודלים. כדוגמה, החקירה של פילוגנטיה של opsins, שהם חלבונים היוזמים את מפל phototransduction, נותן הקשר האבולוציה של העיניים וזיהוי אור8,9,10,11. במקרה זה, אורגניזמים שאינם מודל במיוחד מיני בעלי חיים בסיסיים כגון cnidarians או ctenophores יכול להבהיר שימור או שינויים מפל phototransduction וראייה על פני clades12,13,14. באופן דומה, קביעת הפילוגניות, הביטוי והרשתות של משפחות גנים אחרות תודיע לנו על המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההתאמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים UC אירווין.

1. הכנת ספריית רנ"א-סק

  1. בודד את ה- RNA באמצעות השיטות הבאות.
    1. לאסוף דגימות. אם RNA הוא להיות מופק במועד מאוחר יותר, פלאש להקפיא את המדגם או מקום בתמיסת אחסון RNA15 (שולחן החומרים).
    2. המתת חסד ולנתח את האורגניזם כדי להפריד רקמות של עניין.
    3. לחלץ RNA הכולל באמצעות ערכת החילוץ לטהר את RNA באמצעות ערכת טיהור RNA (טבלה של חומרים)
      הערה: ישנם פרוטוקולים וערכות שעשויים לעבוד טוב יותר עבור מינים שונים וסוגירקמות 16,17. הוצאנו RNA מרקמות גוף שונות שלפרפר 18 והידרהג'לטיני19 (ראה דיון).
    4. למדוד את הריכוז והאיכות של RNA של כל מדגם(טבלה של חומרים). השתמש בדגימות עם מספרי שלמות RNA (RIN) הגבוהים מ- 8, קרוב יותר באופן אידיאלי ל-9 20 כדי לבנות ספריות cDNA.
  2. בנה ספריית cDNA ורצף באופן הבא.
    1. בנה ספריות cDNA בהתאם למדריך הוראות ההכנה לספריה (ראה דיון).
    2. לקבוע ריכוז ואיכות cDNA (טבלה של חומרים).
    3. מולטיפלקס הספריות ורצף אותם.

2. גישה לאשכול מחשבים

הערה: ניתוח RNA-seq דורש מניפולציה של קבצים גדולים והוא נעשה בצורה הטובה ביותר באשכול מחשב(שולחן החומרים).

  1. היכנס לחשבון אשכול המחשב באמצעות username@clusterlocation ssh הפקודה בחלון יישום מסוף (Mac) או PuTTY (Windows).

3. השג קריאות RNA-seq

  1. השג קריאות רצף RNA ממתקן הרצף או, עבור נתונים שנוצרו בפרסום, ממאגר הנתונים שבו הופקד (3.2 או 3.3).
  2. כדי להוריד נתונים ממאגרים כגון ArrayExpress, בצע את הפעולות הבאות:
    1. חפש באתר באמצעות מספר ההצטרפות.
    2. חפש את הקישור להורדת הנתונים ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר העתק קישור.
    3. בחלון המסוף, הקלד wget ובחר הדבק קישור כדי להעתיק את הנתונים לספריה לצורך ניתוח.
  3. כדי להוריד נתוני ארכיון קריאה קצרה (SRA) של NCBI, בצע את השלבים החלופיים הבאים:
    1. על ערכת הכלים SRA הורדה מסוף v. 2.8.1 באמצעות wget.
      הערה: הורדה והתקנה של תוכניות לאשכול המחשב עשויה לדרוש גישת בסיס, פנה אל מנהל אשכול המחשב אם ההתקנה נכשלת.
    2. סיים להתקין את התוכנית על-ידי הקלדת tar -xvf $TARGZFILE.
    3. חיפוש NCBI עבור מספר ההצטרפות SRA עבור הדגימות שברצונך להוריד, זה צריך להיות בפורמט SRRXXXXXX.
    4. השג את נתוני ה- RNA-seq על-ידי הקלדת [מיקום sratoolkit]/bin/prefetch SRRXXXXXX בחלון המסוף.
    5. עבור סוג קבצים מזווגים [מיקום sratoolkit]/bin/fastq-dump --Split-files SRRXXXXXX כדי לקבל שני קבצים מהירים (SRRXXXXXX_1.FASTQ ו- SRRXXXXXX_2.FASTQ).
      הערה: כדי לבצע הרכבה של Trinity de novo השתמש בפקודה [מיקום sratoolkit]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --Split-files SRRXXXXXX

4. מתאמי חיתוך וקריאות באיכות נמוכה (אופציונלי)

  1. התקן או טען את Trimmomatic21 v. 0.35 באשכול המחשוב.
  2. בספריה שבה ממוקמים קבצי הנתונים RNA-seq, הקלד פקודה הכוללת את המיקום של קובץ הצנצנת הקצוץ, קבצי FASTQ של הקלט, קבצי FASTQ פלט ופרמטרים אופציונליים כגון אורך ואיכות קריאה.
    הערה: הפקודה תשתנה בהתאם לאיכות ולאורך הגולמיים והמבוקשים של הקריאות. עבור Illumina 43 bp קורא עם פריימרים Nextera, השתמשנו: java -צנצנת / נתונים / יישומים / trimmomatic / 0.35 / trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. פאסק $READ 2. paired_READ1 FASTQ. unpaired_READ1 FASTQ. paired_READ2 FASTQ. unpaired_READ2 FASTQ. FASTQ ILLUMINACLIP:מתאמים.fa:2:30:10 מוביל:20 נגרר:20 הזזהWINDOW:4:17 MINLEN:30.

5. השג מכלול ייחוס

  1. חפשו בגוגל, EnsemblGenomes ו-NCBI Genomes ו-Nucleotide TSA (מכלול רובה ציד תעתיק) אחר גנום ייחוס או תעתיק מורכב למינים מעניינים (איור 1).
    הערה: אם גנום הפניה או תעתיק אינם זמינים או באיכות נמוכה, המשך לשלב 6 כדי ליצור הרכבה דה נובו.
  2. אם קיים גנום הפניה או תעתיק מורכב, הורד אותו כקובץ fasta למקום שבו הניתוח יבוצע לאחר השלבים הבאים.
    1. מצא את הקישור להורדת הגנום, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני והעתק קישור.
    2. בחלון המסוף הקלד wget והדבק את כתובת הקישור. אם זמין, גם להעתיק את קובץ GTF וקובץ FASTA חלבון עבור הגנום הפניה.

6. צור הרכבה דה נובו (חלופה לשלב 5)

  1. שלב את קבצי RNA-seq READ1 ו- READ2 fastq עבור כל הדגימות על-ידי הקלדת חתול *READ1. FASTQ > $all_READ1. FASTQ וחתול *READ2. > all_READ2 FASTQ. FASTQ בחלון המסוף.
  2. התקן או טען את Trinity22 v.2.8.5 באשכול המחשוב.
  3. יצירה והרכבה על-ידי הקלדה במסוף: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ - ימינה $all_READ2. מהיר, מהיר.

7. המפה קוראת לגנום (7.1) או לתעתיק דה נובו (7.2)

  1. המפה קוראת לגנום הייחוס באמצעות STAR23 v. 2.6.0c ו- RSEM24 v. 1.3.0.
    1. התקן או טען STAR v. 2.6.0c. ו- RSEM v. 1.3.0 לאשכול המחשוב.
    2. אינדקס הגנום על ידי הקלדת rsem-הכנה-הפניה -gtf $GENOME. GTF - כוכב -p 16 $GENOME. $OUTPUT פאסטה.
    3. מפה קוראת ומחשבת ביטוי עבור כל מדגם על-ידי הקלדת ביטוי-rsem-calculate-expression -p 16 --כוכב --משויך קצה $READ 1. פאסק $READ 2. $INDEX $OUTPUT FASTQ.
    4. שנה את שם קובץ התוצאות למשהו תיאורי באמצעות mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
    5. צור מטריצה של כל הספירות על-ידי הקלדת rsem-יצירת-נתונים-מטריצה *[גנים/isoforms.results] > $OUTPUT.
  2. מפה RNA-seq להרכבה טריניטי דה נובו באמצעות RSEM ועת עניבת פרפר.
    1. התקן או טען את טריניטי22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 ו- RSEM v. 1.3.0.
    2. מיפוי קריאות וחישוב ביטוי עבור כל דוגמה על-ידי הקלדת [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --הכנה להפניה --תעתיקים $TRINITY. FASTA -- seqType fq --שמאל $READ 1. FASTQ - ימינה $READ 2. FASTQ - est_method RSEM - עניבת פרפר aln_method - trinity_mode - output_dir $OUTPUT.
    3. שנה את שם קובץ התוצאות למשהו תיאורי באמצעות mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
    4. צור מטריצה של כל הספירות על-ידי הקלדת [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[genes/isoforms].תוצאות

8. זיהוי גנים בעלי עניין

הערה: השלבים הבאים יכולים להיעשות עם קבצי FASTA נוקלאוטידים או חלבונים אך פועלים בצורה הטובה ביותר והם פשוטים יותר עם רצפי חלבונים. BLAST מחפש באמצעות חלבון לחלבון סביר יותר לתת תוצאות בעת חיפוש בין מינים שונים.

  1. לקבלת גנום ייחוס, השתמש בקובץ FASTA של החלבון משלב 5.2.2 או ראה חומרים משלימים כדי ליצור תכונת גנים מותאמת אישית GTF.
  2. לתעתיק דה נובו, צרו חלבון FASTA באמצעות TransDecoder.
    1. התקן או טען את TransDecoder v. 5.5.0 במועדון המחשבים.
    2. מצא את מסגרת הקריאה הפתוחה הארוכה ביותר וחזה רצף פפטיד על-ידי הקלדה [מיקום מקודד]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY. פאסטה, פאסטה.
  3. חיפוש NCBI Genbank עבור הומולוגים במינים קרובים.
    1. פתח חלון דפדפן אינטרנט עבור אל https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.
    2. בסרגל החיפוש הקלד את שם גן העניין ואת השם של מינים קרובים אשר כבר רצף או סוג או פילום. בצד שמאל של סרגל החיפוש בחר חלבון ולאחר מכן לחץ על חיפוש.
    3. חלץ רצפים על-ידי לחיצה על שלח אל ולאחר מכן בחר קובץ. תחת עיצוב, בחר FASTA ולאחר מכן לחץ על צור קובץ.
    4. העבר קובץ FASTA של הומולוגים לאשכול המחשב על-ידי הקלדת scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR בחלון מסוף מקומי או השתמש ב- FileZilla כדי להעביר קבצים אל המחשב והאשכול ומם.
  4. חפש גנים מועמדים באמצעות BLAST+26.
    1. התקן או טען את BLAST+ v. 2.8.1 באשכול המחשבים.
    2. באשכול המחשבים, צרו מסד נתונים של BLAST מהגנום או מהחלבון המתורגם של TRANSCRIPTOME FASTA על ידי הקלדת [BLAST+ location]/makeblastdb -in $PEP. FASTA - פרוט-אאוט של dbtype $OUTPUT
    3. הפיצוץ רצפי הגנים homologous מ NCBI למסד הנתונים של המינים של עניין על ידי הקלדת [BLAST + מיקום]/ blastp -db $DATABASE -שאילתה $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT.
    4. הצג את קובץ הפלט באמצעות הפקודה יותר. העתק מזהי גנים ייחודיים ממין מעניין לקובץ טקסט חדש.
    5. חלץ את הרצפים של גנים מועמדים על-ידי הקלדת perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?הדפס:chomp;$i{$_}=1 אם @ARGV' $gene_id.txt $PEP. > $OUTPUT פאסטה.
  5. אשר ביאור גנים באמצעות פיצוץ הדדי.
    1. בדפדפן האינטרנט עבור אל https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
    2. בחרו tblastnולאחר מכן הדבקו את רצפי המועמדים, בחרו במסד הנתונים של רצף החלבונים הלא יתירים ולחצו על BLAST.
  6. זהה גנים נוספים על ידי ביאור כל הגנים בגנום או בתעתיק עם מונחי אונטולוגיה של גנים (GO) (ראה דיון).
    1. העבר את החלבון FASTA למחשב המקומי.
    2. הורד והתקן Blast2GO27,28,29 v. 5.2 למחשב המקומי.
    3. פתח את Blast2GO, לחץ על קובץ, עבור אל טען, עבור אל טען רצפים, לחץ על טען קובץ Fasta (fasta). בחרו בקובץ FASTA ולחצו על 'טען'.
    4. לחץ על הפיצוץ, בחר NCBI Blast, ולחץ על הבא. ערכו פרמטרים או לחצו על 'הבא', ערכו פרמטרים ולחצו על 'הפעל' כדי למצוא את תיאור הגנים הדומה ביותר.
    5. לחץ על מיפוי ולאחר מכן לחץ על הפעל כדי לחפש חלבונים דומים בביאורים אונטולוגיים של גנים.
    6. לאחר מכן לחץ על אינטרפרו, בחר EMBL-EBI InterProולחץ על הבא. ערוך פרמטרים או לחץ על הבאולחץ על הפעל כדי לחפש חתימות של משפחות גנים ותחומים מוכרים.
    7. יצא את הביאורים על-ידי לחיצה על קובץ, בחר יצא, לחץ על יצא טבלה. לחץ על עיון, תן שם לקובץ, לחץ על שמור, לחץ על יצא.
    8. חפש בטבלת הביאורים מונחי GO של עניין כדי לזהות גנים מועמדים נוספים. חילוץ הרצפים מקובץ FASTA (שלב 8.4.5)

9. עצים פילוגנטיים

  1. הורד והתקן מגה30 v. 7.0.26 למחשב המקומי שלך.
  2. פתח את מגה, לחץ על ישר, לחץ על ערוך/בנה יישור, בחר צור יישור חדש לחץ על אישור, בחר חלבון.
  3. כאשר חלון היישור נפתח, לחץ על עריכה, לחץ על הוסף רצפים מקובץ ובחר את FASTA עם רצפי חלבון של גנים מועמדים והומולוגים סבירים.
  4. בחר את כל הרצפים. מצא את סמל הזרוע ורחף מעליו. זה צריך להיות אומר ישר רצפים באמצעות אלגוריתם שריר31. לחץ על סמל הזרוע ולאחר מכן לחץ על ישר חלבון כדי ליישר את הרצפים. ערוך פרמטרים או לחץ על אישור כדי ליישר באמצעות פרמטרי ברירת מחדל.
  5. בדוק ובצע שינויים ידניים באופן חזותי ולאחר מכן שמור וסגור את חלון היישור.
  6. בחלון הראשי של מגה, לחץ על מודלים, לחץ על מצא את מודלי ה- DNA / חלבון הטובים ביותר (ML),בחר את קובץ היישור ובחר פרמטרים מתאימים כגון: ניתוח: בחירת מודל (ML), עץ לשימוש: אוטומטי (עץ מצטרף לשכן), שיטה סטטיסטית: סבירות מרבית, סוג החלפה: חומצת אמינו, פער / טיפול נתונים חסר: השתמש בכל האתרים, מסנן אתר ענף: ללא.
  7. לאחר קביעת המודל הטוב ביותר עבור הנתונים, עבור לחלון MEGA הראשי. לחץ על פילוגנית ולחץ על עץ הסבירות המרבית של Contruct/Test ולאחר מכן בחר את היישור, במידת הצורך. בחר את הפרמטרים המתאימים עבור העץ: שיטה סטטיסטית: סבירות מקסימלית, מבחן של פילוגנית: שיטת Bootstrap עם 100 שכפולים, סוג החלפה: חומצת אמינו, מודל: LG עם Freqs. (+F), שיעורים בין אתרים: גמא מבוזרת (G) עם 5 קטגוריות גמא נפרדות, טיפול בנתונים פער/חסר: השתמש בכל האתרים, שיטת ML היוריסטית: הקרוב ביותר-שכן-מחלף (NNI).

10. דמיין ביטוי גנים באמצעות TPM

  1. עבור Trinity, באשכול המחשבים עבור אל הספריה שבה abundance_estimates_to_matrix.pl היה מופעל ואחד היציאות צריך להיות מטריצה. TPM.not_cross_norm, TPM.not_cross_norm. העבר קובץ זה למחשב המקומי שלך.
    הערה: ראה חומרים משלימים לנורמליזציה של מדגם מוצלב.
  2. עבור TPMs מניתוח גנום בצע את השלבים הבאים.
    1. באשכול המחשבים, עבור אל מיקום ההתקנה של RSEM. העתק את rsem-יצירת-מטריצה-נתונים על-ידי הקלדת scp rsem-יצירת-נתונים-מטריצה rsem-ליצור-TPM-מטריצה. השתמש ננו כדי לערוך את הקובץ החדש ולשנות את "$offsite שלי = 4" מ 4 עד 5 עבור TPM, עכשיו זה צריך לקרוא "$offsite שלי = 5".
  3. עבור אל הספריה שבה נמצאים קבצי הפלט של RSEM .genes.results והשתמש כעת במטריצת rsem-create-TPM *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT כדי ליצור מטריצת TPM. העבר תוצאות למחשב מקומי.
  4. דמיין את התוצאות ב- ggplot2.
    1. הורד R v. 4.0.0 ו RStudio v. 1.2.1335 למחשב מקומי.
    2. פתח את RStudio משמאל למסך עבור לכרטיסיה חבילות ולחץ על התקן. הקלד ggplot2 ולחץ על התקן.
    3. בחלון ה- Script R שנקרא בטבלת ה- TPM על-ידי הקלדת נתונים<-read.table("$tpm.txt",כותרת = T)
    4. לתרשימי עמודות הדומים לאיור 4 הקלד משהו דומה ל: p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), נתונים=נתונים, stat="identity")
      למלא<-c("#d7191c", "#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6")
      p<-p+scale_fill_manual(ערכים=מילוי)
      p + ערכת נושא(axis.text.x = element_text(זווית = 90))

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות לעיל מסוכמות באיור 1 והוחלו על ערכת נתונים של רקמות הידרה וולגריס. H. vulgaris הוא חסר חוליות מים מתוקים השייך לפירום Cnidaria הכולל גם אלמוגים, מדוזות ושאינות ים. H. וולגריס יכול להתרבות באופן א-מיני על ידי ניצנים והם יכולים לחדש את הראש והרגל שלהם כאשר חצוי. במחקר זה, אנו שואפים לחקור את האבולוציה והביטוי של גנים opsin ב הידרה7. בעוד הידרה חסר עיניים, הם מפגינים התנהגות תלוית אור32....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתווה של השלבים לאפיון משפחת גנים באמצעות נתוני RNA-seq. שיטות אלה הוכחו לעבוד עבור מגוון רחב של מינים datasets4,34,35. הצינור שהוקם כאן כבר מפושט צריך להיות קל מספיק כדי להיות מלווה טירון בביואינפורמטיקה. משמעות הפרוטוקול היא שהוא מתאר את כל השלבים והתוכניות הדרושות להשלמת ניתוח הניתן לפרסום. צעד מכריע בפרוטוקול הוא שהרכבת כראוי תעתיקים באורך מלא, זה מגיע מגנום או תעתיקים באיכות גבוהה. כדי להשיג תעתיקי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לאדריאנה בריסקו, גיל סמית', רבי מוראד ואלין ג' ריינג'ל על ייעוץ והדרכה בשילוב חלק מהשלבים הללו בזרימת העבודה שלנו. אנו מודים גם לקתרין ויליאמס, אליזבת רבואה ונטשה פיצ'יאני על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן ג'ורג' א. יואיט למלגת מחקר רפואי ל- A.M.M.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת ביואנלייזר-DNAAgilent5067-4626חומרי מעבדה רטובים
ערכת Bioanalyzer-RNA Agilent5067-1513חומרי מעבדה רטובים
BLAST+ v. 2.8.1באשכול מחשבים*
> https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ Blast2GO (במחשב האישי שלך)במחשב המקומי
https://www.blast2go.com/b2g-register-basic boost v. 1.57.0באשכול מחשבים
Bowtie v. 1.0.0באשכול מחשבים
https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
אשכול מחשוב (מומלץ מאוד)הערה: ניתוחים של נתונים גנומיים נעשים בצורה הטובה ביותר באשכול מחשוב בעל ביצועים גבוהים מכיוון שהקבצים גדולים מאוד.
חפתים v. 2.2.1באשכול מחשבים
edgeR v. 3.26.8 (in R)In Rstudio
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0באשכול מחשבים
Java v. 11.0.2באשכול מחשבים
MEGA7 (במחשב האישי שלך)במחשב המקומי
https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1במחשב המקומי
https://www.megasoftware.net
ערכת NucleoSpin RNA IIMacherey-Nagel740955.5חומרי מעבדה רטובים
perl 5.30.3על אשכול מחשבים
pythonעל אשכול מחשבים
Qubit 2.0 פלואורומטרThermoFisherQ32866חומרי מעבדה רטובים
R v.4.0.0על אשכול מחשבים
https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlaterThermoFisherAM7021חומרי מעבדה רטובים
ערכת RNeasyQiagen74104חומרי מעבדה רטובים
RSEM v. 1.3.0תוכנת מחשב
https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335על מחשב מקומי
https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3תוכנת מחשב
SRA Toolkit v. 2.8.1על אשכול מחשבים
https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0cעל אשכול מחשבים
https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4dעל אשכול מחשב
https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0על אשכול מחשבים
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35על אשכול מחשבים
http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5על אשכול מחשבים
https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzolThermoFisher15596018חומרי מעבדה רטובים
ערכת הכנה לספריית RNA TruSeq v2IlluminaRS-122-2001חומרי מעבדה רטובה
TURBO ערכת DNA ללאThermoFisherAM1907חומרי
מעבדה רטובה
*הורדות והתקנה באשכול המחשבים עשויות לדרוש גישת שורש. פנה למנהל הרשת שלך.
DNA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
  2. Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene orthology. Nature Reviews Genetics. 14 (5), 360-366 (2013).
  3. Dolinski, K., Botstein, D. Orthology and Functional Conservation in Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 41 (1), (2007).
  4. Macias-Muñoz, A., McCulloch, K. J., Briscoe, A. D. Copy number variation and expression analysis reveals a non-orthologous pinta gene family member involved in butterfly vision. Genome Biology and Evolution. 9 (12), 3398-3412 (2017).
  5. Cannon, S. B., Mitra, A., Baumgarten, A., Young, N. D., May, G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC plant biology. 4, 10(2004).
  6. Eastman, S. D., Chen, T. H. P., Falk, M. M., Mendelson, T. C., Iovine, M. K. Phylogenetic analysis of three complete gap junction gene families reveals lineage-specific duplications and highly supported gene classes. Genomics. 87 (2), 265-274 (2006).
  7. Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), 1-19 (2019).
  8. Hisatomi, O., Tokunaga, F. Molecular evolution of proteins involved in vertebrate phototransduction. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 133 (4), 509-522 (2002).
  9. Arendt, D. Evolution of eyes and photoreceptor cell types. International Journal of Developmental Biology. 47, 563-571 (2003).
  10. Shichida, Y., Matsuyama, T. Evolution of opsins and phototransduction. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1531), 2881-2895 (2009).
  11. Porter, M. L., et al. Shedding new light on opsin evolution. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1726), 3-14 (2012).
  12. Plachetzki, D. C., Degnan, B. M., Oakley, T. H. The origins of novel protein interactions during animal opsin evolution. PLoS ONE. 2 (10), 1054(2007).
  13. Ramirez, M. D., et al. The last common ancestor of most bilaterian animals possessed at least nine opsins. Genome Biology and Evolution. 8 (12), 3640-3652 (2016).
  14. Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biology. 10, 107(2012).
  15. Pedersen, K. B., Williams, A., Watt, J., Ronis, M. J. Improved method for isolating high-quality RNA from mouse bone with RNAlater at room temperature. Bone Reports. 11, 100211(2019).
  16. Ridgeway, J. A., Timm, A. E., Fallon, A. Comparison of RNA isolation methods from insect larvae. Journal of Insect Science. 14 (1), 4-8 (2014).
  17. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-Seq: Implications for differential expression and meta-Analyses. BMC Genomics. 21 (1), 1-9 (2020).
  18. Briscoe, A. D., et al. Female behaviour drives expression and evolution of gustatory receptors in butterflies. PLoS genetics. 9 (7), 1003620(2013).
  19. Murad, R., Macias-Muñoz, A., Wong, A., Ma, X., Mortazavi, A. Integrative analysis of Hydra head regeneration reveals activation of distal enhancer-like elements. bioRxiv. , 544049(2019).
  20. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. Impact of RNA degradation on measurements of gene expression. BMC Biology. 12, 42(2014).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Trinity. RNA-Seq De novo Assembly Using Trinity. , 1-7 (2014).
  23. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  24. Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC bioinformatics. 12, 323(2011).
  25. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25(2009).
  26. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421(2009).
  27. Conesa, A., Götz, S. Blast2GO: A comprehensive suite for functional analysis in plant genomics. International Journal of Plant Genomics. 619832, (2008).
  28. Conesa, A., et al. Blast2GO: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
  29. Götz, S., et al. High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite. Nucleic Acids Research. 36 (10), 3420-3435 (2008).
  30. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  31. Edgar, R. C. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  32. Taddei-Ferretti, C., Musio, C., Santillo, S., Cotugno, A. The photobiology of Hydra's periodic activity. Hydrobiologia. 530, 129-134 (2004).
  33. Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464 (7288), 592-596 (2010).
  34. Macias-Muñoz, A., Rangel Olguin, A. G., Briscoe, A. D. Evolution of phototransduction genes in Lepidoptera. Genome Biology and Evolution. 11 (8), 2107-2124 (2019).
  35. Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), (2019).
  36. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  37. Tavares, L., Alves, P. M., Ferreira, R. B., Santos, C. N. Comparison of different methods for DNA-free RNA isolation from SK-N-MC neuroblastoma. BMC research notes. 4, 3(2011).
  38. Johnson, M. T. J., et al. Evaluating Methods for Isolating Total RNA and Predicting the Success of Sequencing Phylogenetically Diverse Plant Transcriptomes. PLoS ONE. 7 (11), (2012).
  39. Zhao, S., Zhang, Y., Gamini, R., Zhang, B., Von Schack, D. Evaluation of two main RNA-seq approaches for gene quantification in clinical RNA sequencing: PolyA+ selection versus rRNA depletion. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  40. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16 (1), 1-14 (2015).
  41. Corley, S. M., MacKenzie, K. L., Beverdam, A., Roddam, L. F., Wilkins, M. R. Differentially expressed genes from RNA-Seq and functional enrichment results are affected by the choice of single-end versus paired-end reads and stranded versus non-stranded protocols. BMC Genomics. 18 (1), 1-13 (2017).
  42. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8 (8), 1494-1512 (2013).
  43. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  44. Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nature Biotechnology. 34 (5), 525-527 (2016).
  45. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  46. Araujo, F. A., Barh, D., Silva, A., Guimarães, L., Thiago, R. OPEN GO FEAT a rapid web-based functional annotation tool for genomic and transcriptomic data. , 8-11 (2018).
  47. Huerta-Cepas, J., et al. Fast genome-wide functional annotation through orthology assignment by eggNOG-mapper. Molecular Biology and Evolution. 34 (8), 2115-2122 (2017).
  48. Huerta-Cepas, J., et al. EggNOG 5.0: A hierarchical, functionally and phylogenetically annotated orthology resource based on 5090 organisms and 2502 viruses. Nucleic Acids Research. 47, 309-314 (2019).
  49. Törönen, P., Medlar, A., Holm, L. PANNZER2: A rapid functional annotation web server. Nucleic Acids Research. 46, 84-88 (2018).
  50. Robinson, M., Mccarthy, D., Chen, Y., Smyth, G. K. edgeR differential expression analysis of digital gene expression data User's Guide. , (2013).
  51. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
  52. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: Paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
  53. Letunic, I., Bork, P. Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees. Nucleic acids research. 44, 242-245 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA seqBLASTMEGAedgeR

מאמרים קשורים