מאמר שיטה

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

DOI:

10.3791/61640

⸱

19 באוגוסט 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטת סליקה פשוטה, זולה ומהירה כדי לפתור את המבנה 3D של רקמת שומן לבנה עכבר ואדם באמצעות שילוב של סמנים כדי לדמיין כלי דם, גרעין, תאים חיסוניים, נוירונים, וחלבונים מעיל שומנים-טיפות על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר היא בעיה גדולה ברחבי העולם בריאות הציבור שמגביר את הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, ומחלות כבד. השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסה של רקמת שומן (AT) בשל היפרפלזיה אדפוציט ו/או היסטרופיה, מה שמוביל לשיפוץ עמוק של המבנה התלת מימדי שלה. אכן, היכולת המקסימאלית של AT להתרחב במהלך השמנת יתר היא חיונית להתפתחות של פתולוגיות הקשורות להשמנת יתר. הרחבת AT זה היא מנגנון הוםוסטטי חשוב כדי לאפשר הסתגלות לעודף צריכת אנרגיה ולהימנע שפיכת שומנים מזיקים לאיברים מטבוליים אחרים, כגון שריר וכבד. לכן, הבנת השיפוץ המבני שמוביל לכישלון של הרחבת AT היא שאלה בסיסית עם ישימות קלינית גבוהה. במאמר זה, אנו מתארים שיטת ניקוי פשוטה ומהירה המשמשת באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לחקור את המורפולוגיה של רקמת שומן לבנה של עכבר ואדם לבן על ידי הדמיית פלורסנט. שיטת ניקוי AT ממוטבת זו מבוצעת בקלות בכל מעבדה סטנדרטית המצוידת במכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ פלורסנט. יתר על כן, תרכובות כימיות בשימוש זמינים. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת לפתור את מבנה 3D AT על ידי הכתמת סמנים שונים כדי לדמיין באופן ספציפי את adipocytes, רשתות עצביות וסקולריות, ואת התפלגות תאי החיסון המולדת ואדפטיבית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסת רקמת שומן והפכה לבעיה גדולה ברחבי העולם לבריאות הציבור, בהתחשב בכך שאנשים עם השמנת יתר יש סיכון מוגבר לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, מחלות כבד וכמה סוגי סרטן.

פונקציה פיזיולוגית בסיסית של רקמת שומן היא לווסת גלוקוז כל הגוף הומאוסטאזיסשומנים 1,,2. במהלך תקופת ההאכלה, adipocytes (כלומר, התאים העיקריים של רקמת שומן) לאחסן את עודף הגלוקוז והשומנים המסופקים על ידי ארוחה לתוך טריגליצרידים. במהלך הצום, adipocytes לשבור את הטריגליצרידים לתוך חומצות שומן לא esterified גליצרול כדי לקיים את הביקוש האנרגיה של הגוף. במהלך התפתחות השמנת יתר, רקמת שומן להרחיב על ידי הגדלת הגודל (היסטרופיה) ו / או את המספר (היפרפלזיה) של adipocytes1,כדי להגדיל את קיבולת האחסון שלהם. כאשר ההתפשטות של רקמת שומן מגיע לגבול שלה, משתנה מאוד קבוע בקרב חולים, שומנים הנותרים מצטברים לתוך איברים מטבוליים אחרים כולל שרירים וכבד3, 4,המוביל לכשל התפקודישלהם וייזום סיבוכים אירוביים הקשורים להשמנת יתר1,,5. לכן, זיהוי המנגנונים השולטים בהרחבת רקמת שומן הוא אתגר קליני מרכזי.

השינויים המורפולוגיים המתועדים בתוך רקמות שומן במהלך השמנת יתר קשורים לתפקוד הפתולוגי שלה. מספר הליכי כתמים שימשו לתיאור ארגון הרקמות של רקמת השומן, כולל actin6, סמני כלידם 7, סמנים שומנים-טיפות8, וסמניםספציפיים תא חיסוני9,,10. עם זאת, בגלל הקוטר העצום של adipocytes (50 כדי 200 μm)11, זה חיוני לנתח חלק גדול של הרקמה כולה בשלושה ממדים על מנת לנתח במדויק את השינויים המבניים הדרמטיים AT שנצפו במהלך השמנת יתר. עם זאת, מכיוון שהאור אינו חודר רקמה אטומה, הדמיה ב3D בתוך דגימות רקמה גדולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ אינה אפשרית. שיטות של ניקוי רקמות כדי להפוך אותם שקופים דווחו בספרות(לסקירה, ראה 12)המאפשר אחד לנקות רקמות ולבצע מעמיק, מיקרוסקופ פלואורסק של רקמות שלם. שיטות אלה מציעות הזדמנויות חסרות תקדים להעריך את הארגון הסלולרי 3D ברקמה בריאה וחלויה. לכל אחת מהשיטות המתוארות יש יתרונות וחסרונות, ולכן יש לבחור בקפידה בהתאם לרקמות הנחקרות (לסקירה,ראה 13). ואכן, גישות מסוימות דורשות תקופת דגירה ארוכה ו/או שימוש בחומרים או תרכובותיקרים, רעילים או קשים להשגה של 14, 15,,15,16,,17,,18,,19. תוך ניצול של אחת התרכובות הראשונות ששימשו לפני מאה שנה על ידי ורנר Spalteholzכדי לנקות רקמות 20, הקמנו פרוטוקול ידידותי למשתמש ולא יקר כי הוא מותאם היטב עבור ניקוי של כל העכבר ומחסני רקמת שומן אנושי בכל מעבדה עם ציוד טיפוסי כולל מכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ confocal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נבדק ומאומת עבור כל מחסני רקמת השומן של העכבר והאדם הלבן. רקמות שומן אדם ועכבר נאספו בהתאם לחוקים האירופיים ואושרו על ידי ועדות אתיות צרפתיות ושוודיות.

1. קיבעון של רקמת השומן לבן של העכבר והאדם

  1. לטבול את העכבר שנקטפו או רקמות שומן לבן אנושי לפחות 10 מ"ל של PBS המכיל 4% paraformaldehyde (PFA) בצינור פלסטיק 15 מ"ל.
  2. לנער את צינור הפלסטיק בטמפרטורת החדר על צלחת מתגלגלת במשך 1 שעה.
  3. להשאיר את צינור הפלסטיק ב 4 מעלות צלזיוס על לוח מתגלגל בן לילה, כדי להשלים את קיבעון.
    הערה: פרוטוקול זה מותאם דגימות רקמת שומן גדולה, כגון רפידות שומן אפידימליות שלמות שהתקבלו מעכברים האכילו דיאטה נורמלית (≈250 מ"ג - ≈0.6 ס"מ3). עבור דגימות גדולות יותר כמו רפידות שומן אפידימליות שהתקבלו מעכברים האכילו דיאטת שומן גבוהה (≈1.5 גרם - ≈4ס"מ 3)או דגימות רקמת שומן אנושית, למרות פרוטוקול ניקוי צריך לעבוד בצורה מושלמת עבור המדגם כולו (על ידי שינוי קנה מידה של PFA ותערובות נוגדנים), באופן כללי, אנו חותכים חתיכות רקמות סביב 1 גרם (≈2.5 ס"מ3)כדי לשמור את הדגימות הנותרות או עבור כתמים נוספים או יישומים. עבור PFA (שלב 1.1.) אנו ממליצים להשתמש בערך 10 פעמים את נפח הרקמה. עבור תערובות נוגדנים (שלבים 3.1. ו 3.4.), להגביר את עוצמת הקול כדי לטבול לחלוטין את הרקמה, ולהשתמש צינור פלסטיק 15 מ"ל (ראה טבלת חומרים)אם הרקמה גדולה מדי עבור microtube פלסטיק 1.5 מ"ל (ראה טבלת חומרים).

2. חירבול ורוויה של רקמת שומן לבנה ואנושית

  1. לשטוף את רקמת שומן לבן קבוע ב 10 מ"ל של PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל העקבות של PFA.
  2. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.3% גלצין (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית במשך 1 h ב 100 מהפכות לדקה (סל"ד) כדי להרוות את שאר קבוצות אלדהיד חינם.
  3. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה במשך 2 שעות ב 100 סל"ד.
  4. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 ו 20% DMSO (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד לילה.
  5. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.1% Tween-20 (ראה טבלת חומרים), 0.1% Triton X-100, 0.1% deoxycholate (ראה טבלת חומרים)ו 20% DMSO ולנער את הצינור ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד לפחות 24 שעות.
  6. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 ולנער את הצינור בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 1 שעה.
  7. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו-3% BSA (ראה טבלת חומרים)ונענעו את הצינור ב-37°C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב-100 סל"ד למשך 12 שעות, כדי לרוויה את כל האתרים שאינם קשורים באופן ספציפי לנוגדנים.
    הערה: בשלב 2.7, BSA ניתן להחליף על ידי סרום דם של המין של הנוגדן המשני בשימוש.

3. הליך התכתמות עבור רקמת שומן לבנה ואנושית

  1. להעביר את הרקמה במיקרו-tube פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 300 μL של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA ואת הנוגדנים העיקריים (10x מרוכז יותר מאשר עבור הכתמת cryosection אבל ריכוז נוגדנים אופטימלי צריך להיות מוערך עבור כל נוגדן). הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום ולנער את הצינור ב 37 ° C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד במשך יומיים לפחות (ראה את הפתק בשלב 1.1 וצעד 3.7.1).
  2. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ולנער את הצינור מוגן מפני אור ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 5 שעות. בצע שלב זה פעמיים.
  3. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלול מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד ללילה אחד עד יומיים.
  4. להעביר את הרקמה למיקרו-tube פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 300 μL של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA ואת הנוגדנים המשניים (10x מרוכז יותר מאשר עבור הכתמת cryosection). הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום ולנער את הצינור ב 37 ° C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד במשך יומיים לפחות (ראה את הפתק בשלב 1.1 וצעד 3.7.1).
  5. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 5 שעות. בצע שלב זה פעמיים.
  6. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד ללילה אחד עד יומיים.
  7. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
    הערה: עבור תיוג של מבנים ספציפיים כגון גרעין או actin, להוסיף 4′,6-diamidino-2-פנילידול (DAPI או שווה ערך) ו / או פלואורסצנט מסומן-פאלואידין יש להוסיף בשלב 3.1. כאשר משתמשים רק במנוגים ראשוניים המסומנים בפלורסנט, או בשלב 3.4. כאשר משתמשים בנבדנים משניים.
    הערה: עבור הליך הכתמים, נוגדנים ראשוניים כבר הוסתרו עם fluorochromes (כמו אלה המשמשים עבור ציטומטריה זרימה) ניתן להשתמש ואנחנו ממליצים על זה לרווחת זמן וספנות. אכן, גם אם נוגדנים ראשוניים העכבר ניתן להשתמש ואחריו נוגדנים משניים נגד עכבר, כפי שהראינו את זה כאן, לעתים קרובות הבחנו כתמים לא ספציפיים של כלי דם בשל מחזור אימונוגלובולין. לכן, כדי למנוע בעיה זו, נוגדנים ראשוניים שכבר מסומנים מומלצים מאוד וכאן אנו מספקים ראיות לכך הנוגדנים המשמשים ציתום זרימה תואמים להליך שלנו. עם זאת, במקרה הספציפי של אנטיגן המתבטא ברמות נמוכות, צעד ההגדלה אות באמצעות נוגדנים משניים הוא חובה; כאשר הנוגדן העיקרי הזמין היחיד נעשה בעכבר, זיגוג לב של העכברים עם PBS לפחות 5 דקות בהקרבה יכול להסיר חלק גדול של אימונוגלובולין במחזור ולכן הכתמים הלא ספציפיים.

4. ניקוי הליך עבור עכבר ורקמות שומן לבן אנושי

  1. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 50% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
  2. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 70% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
  3. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 95% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
  4. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 100% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
  5. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 100% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד לילה.
  6. לטבול את הרקמה בבקבוק זכוכית 20 מ"ל עם פקק פלסטיק (ראה שולחן של חומרים) המכיל 5 מ"ל של מתיל סלצילאט (ראה טבלת חומרים)מתחת למכסה המנוע הכימי ולנער את מיכל הזכוכית, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולי ב 100 סל"ד לפחות 2 שעות.
    הערה: ניתן להאיץ באופן משמעותי את הליך ההנקה (במידת הצורך) על-ידי הימנעות מהצעדים 4.3. ו 4.5., למרות איכות ניקוי הסופי יהיה מופחת במקצת.

5.3D הדמיה קונפוקל של רקמת שומן לבנה פינה

  1. מעבירים את הרקמה לתא הדמיה מתכתי המצויד בתחתית זכוכית (ראה שולחן חומרים)מתחת למכסה המנוע הכימי ומלא את התא במטיל סליצילאט טרי.
    הערה: כדי לאבטח את הרקמה במקום, ובכך למנוע ממנה לצוף או לנוע הצידה בתא, יש למרוח מספר כיסויי זכוכית עגולים של 18 מ"מ (ראה טבלת חומרים)על גבי הרקמה בעת הרכבתה לתא.
  2. מניחים את תא ההדמיה על מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך.
  3. תמונה הרקמה באמצעות מטרת הגדלה נמוכה (למשל, 4x המטרה) כדי ליצור כמה ס"מ3 מפות 3D של רקמת שומן כולה או של דגימת הרקמה האנושית.
  4. בחר מספר אזורים לדגימת הרקמה בהגדלה גבוהה יותר. בדרך כלל, השתמש ביעד אוויר למרחקים ארוכים של פי 20 המספק יחס טוב בין רזולוציה לעומק. אנו רוכשים תמונות פסיפס גדולות עם z-stacks בין 600 ו 2000 μm עומק.
    הערה: השתמש במטרה למרחקים ארוכים כדי לתמונה עמוקה יותר לתוך הרקמה.

6. הפקת תוצאות כמותיות מתמונות רקמת השומן 3D

הערה: ניתן לבצע את פילוח המבנים השונים ואת החילוץ הבא של המידע הכמותי מערימת התמונה תלת-מיו שנעצר בנקודה 5 באמצעות כל אחת מאפשרויות התוכנה הקיימות רבות לניתוח תמונות, מסחריות או חופשיות. בנקודות הבאות, אנו מתארים אסטרטגיה המשמשת באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לחלץ מידע כמותי מתמונות רקמת שומן 3D באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים).

  1. המר את ערימות תלת-מית-אל לתבנית התוכנה למרחב זיכרון פנוי.
  2. תמקטע את התאים.
    1. פתח את מודול התא של התוכנה.
    2. שנה את ההגדרה זיהוי תאים לכתמים קרום פלזמה.
    3. בחר את ערוץ הפלורסנט של הסמן המשמש כדי לפרט את פריפריה התא (פאלואידים אשר תוויות אקטין קליפתי או סמני קרום פלזמה כגון F4/80 עבור מקרופאג,TCR-β עבור תאי T, או אשכול של חלבוני תקליטור בידול ספציפיים עבור תת סוגים של תאים חיסוניים).
    4. הגדר את הסף וספק טווח של גודל תא צפוי (כלומר, 1 עד 200 μm לזיהוי תאים).
    5. הפעל את פילוח. אמצעי אחסון המתאים לערימת z ייווצר כאשר התאים המחולקים מקודדים בצבע בצבע שונה עבור כל אחד מהתאים השכנים.
    6. החל מסננים סטטיסטיים (גודל, מעוגל, מעגליות וכו') בכרטיסיה סטטיסטיקה כדי לא לכלול חפצי פילוח ו/או כדי למקד את התאים המחולקים לתא העניין בהתבסס על גודלם (כלומר, 20-200 μm עבור adipocytes; 5-25 μm עבור מקרופאגים; 1-3 μm עבור לימפוציטים).
    7. חלץ מדידות ונתונים כמותיים (אמצעי אחסון, מספר, גודל, קוטר וכו') מהלשונית סטטיסטיקה.
  3. רכיבים תאיים פלח (גרעינים, שלל, וכו ') או כלי כמבנה.
    הערה: למרות פילוח נימה הוא מאוד שימושי ללמוד את הקישוריות של כלי, אנו משתמשים פילוח מודול פני השטח כדי לחלץ נתונים על הגודל, נפח וקוטרים של כלי. אכן, הכימות של הגדלים של כלי אבד בעת שימוש במודול נכי.
    1. פתח את מודול Surface של התוכנה.
    2. בחר את ערוץ הפלורסנט של הסמן המשמש לסימון ספציפי של הרכיב התת-תאי כדי לשחזר אותו ב- 3D.
    3. הגדר את הסף ולספק טווח של גודל הקוטר הצפוי של המבנה (כלומר, 0.5-5 μm עבור גרעין; 0-100 μm עבור כלי; וכו ').
    4. הפעל את פילוח. ייווצר אמצעי אחסון עם המבנה התאי המקטע. ניתן לחלץ מדידות ונתונים כמותיים (אמצעי אחסון, מספר, גודל, קוטר וכו') מהלשונית סטטיסטיקה.
  4. חלק את כלי הדם כרצף צינורי.
    הערה: למרות פילוח נימה הוא מאוד שימושי ללמוד את הקישוריות של כלי, אנו משתמשים פילוח מודול פני השטח כדי לחלץ נתונים על הגודל, נפח וקוטרים של כלי. אכן, הכימות של הגדלים של כלי אבד בעת שימוש במודול נכי.
    1. פתח את מודול הנינים של התוכנה.
    2. בחר את ערוץ הפלורסנט המתאים להכתמת כלי הדם.
    3. הגדר את הסף עבור עוצמת הפלואורסץ ובחר את המספר המתאים של צמתים מחוברים צפויים.
    4. הפעל את פילוח. ייווצקו ב-3D תסנים המייצגים את רשת כלי השיט. ניתן לחלץ מדידות מלשונית הסטטיסטיקה, המאפשרת להשיג נתונים כמותיים כולל אורך כלי שיט, מספר הסתעפות כלי שיט וכו'.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות ההליך המתואר כאן ומסוכם איור 1, הצלחנו להכתים ולטהר אופטית את רקמת השומן האנושית והעכבר הלבנה כפי שהוצגה בדמות 2A ו-איור 2B, בהתאמה. הרקמה הנוקתה הועברה לתא ההדמיה המתכתי כדי לבצע הדמיה קונפוקאלית(איור 3א). ההבהרה שיפרה באופן דרסטי את עומק תמונות הרקמה שיכולנו לרכוש(איור 3B ואיור 3C). ניתן לרכוש את כל רקמת השומן ב-3D בהגדלה נמוכה באמצעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השינויים המתרחשים בתוך רקמת השומן במהלך ההתקדמות הפתולוגית, כגון זה של השמנת יתר, הוא בסיסי להבנת המנגנונים מאחורי הפתולוגיה. מחקרים חלוציים שחשפו מנגנונים כאלה ברקמת שומן התבססו על גישות גלובליות כגון פרוטאומיקה רקמת שומןשלמה 21, ציתוםזרימה 22,23, ותעתיק24,25. בנוסף, נעשו מאמצים לחקור את השינויים המבניים המתרחשים ברקמת שומן באמצעות ניתוחים היסטולוגיים26

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת קוט ד 'אזור, ועל ידי מענקים מסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות ההשקעות עבור ה-Labex SIGNALIFE העתידי (ANR-11-LABX-0028-01), התוכנית UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) באמצעות האקדמיה 2 "מתחמי Systèmes" והאקדמיה 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), ואת תוכנית החוקר הצעיר לג'יי.ג'יי (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M במימון קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-מריטיים ו-Région PACA, אשר נתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופ וההדמיה IBISA Côte d'Azur (MICA). אנו מודים למריון דוסוט על העזרה הטכנית בהכנת רקמות. אנו מודים לאבי קאטריס, הנראות המדעית הבינלאומית של UCA, על קריאת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרו 1.5 מ"לאפנדורף - Dutscher33528
צינורות פלסטיק 15 מ"לצינורות פלקון - Dutscher352096
כיסוי זכוכית עגול 18 מ"מMariendfeld0117580
בקבוק זכוכית 20 מ"לWheaton986546
נוגדן מצומד alexa647Jackson ImmunoResearch715-605-150דילול: 1/100
נוגדן נגד ארנב-alexa647-מצומדJackson ImmunoResearch711-605-152דילול: 1/100
נוגדןBSA Sigma-aldrichA6003
CD301-PEBiolegendBLE145703דילול: 1/100
נוגדן CD31AbCamab215912דילול: 1/50
תוכנת ניתוח תלת מימד מסחרית - מכשירIMARIS Oxfordעם מודול תא
מיקרוסקופ קונפוקלי - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306ריכוז מלאי: 5 מ"ג/מ"ל; דילול 1/1000
דאוקסיכולטסיגמא-אולדריץ'D6750
DMSOסיגמא-אולדריץ'D8418
Glut4 נוגדןסנטה קרוזsc-53566דילול: 1/50
GlycineSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1ריכוז מלאי: 2 ומיקרו; g/µ L; הזרקה לווריד: 50 ומיקרו; L/עכברים
תא הדמיה מתכתי מצויד בתחתית זכוכית - AttoFluor ChamberThermofisherA7816
Methyl salicylateSigma-aldrichM6752
נוגדן פריליפיןProgen6511561/50
Phalloidin-alexa488ThermoFisherA12379דילול: 1/100
נוגדןTCR-β-PBדילול BLE109225 Biolegend1/100
TH נוגדןAbCamab112דילול: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416
צינורות נגד עכברים דילול : :

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
  2. Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
  3. Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
  4. Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
  5. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375(2015).
  6. Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
  7. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  8. Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592(2018).
  9. Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
  10. Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
  11. Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
  12. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271(2018).
  15. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225(2016).
  16. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274(2016).
  17. Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553(2017).
  18. Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22(2014).
  19. Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368(2019).
  20. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
  21. Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
  22. Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
  23. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
  24. Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
  25. Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250(2017).
  26. Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).
  27. Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
  28. Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
  29. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
  30. Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).
  31. Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Triton X 100

מאמרים קשורים