הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61669

⸱

10 בספטמבר 2020

 ,  , 
1Laboratory of Biochemistry, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.

תקציר

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את הישימות של הגרסה האחרונה של השלמת לוציפראז מפוצל להדגמת מתחמים הטרולוגיים שנוצרו על ידי מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs). חלבונים רב-תכליתיים אלה, התושבים בחדר המיון ובגולגי, נושאים את הסוכרים הנוקלאוטידים המסונתזים מבחינה ציטופלסמית על פני ממברנות האברונים כדי לספק אנזימים המתווכים גליקוזילציה עם המצעים שלהם. NSTs קיימים כמו דימרים ו / או אוליגומרים גבוהים יותר. כמו כן דווח על אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים. כדי לוודא אם הטכניקה מתאימה לחקר התופעה של הטרומריזציה של NST, בדקנו אותה מול שילוב של שני NSTs תושב גולגי שהוכחו בעבר כמקשרים במספר אמצעים אחרים. בדיקת ההשלמה של לוציפראז נראית מתאימה במיוחד לחקר אינטראקציות בין חלבוני ממברנה תושבי גולגי, שכן היא אינה דורשת רמות הבעה גבוהות, אשר לעתים קרובות לעורר מיקום שגוי של חלבון ולהגדיל את הסיכון של חיובי שווא.

מבוא

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבדוק את נוכחותם של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי בתאים אנושיים שהודבקו באופן חולף באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. ההליך נבדק בהרחבה ביותר נגד מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs) אבל הצלחנו גם להשיג תוצאות חיוביות עבור חלבונים אחרים מסוג גולגי סוג III ממברנה אשר N- ו / או C-termini עומדים בפני הציטופלסמה.

קבוצת המחקר שלנו בוחנת את תפקידם של NSTs בגליקוזילציה של מקרומולקולות. NSTs הם חלבוני ממברנה מסוג III מסוג Golgi ו/או ER עם N- ו- C-termini הפונים לצד הציטופלסמי של הממברנה האורגנית1. NSTs נחשבים לשאת סוכרים המופעלים נוקלאוטידים על פני ממברנות אברונים כדי לספק גליקוסילטרפרנספראזס עם המצעים שלהם. NSTs יוצרים דימרים ו/או אוליגומרים גבוהים יותר2,3,4,5,6,7,8,9,10. יתר על כן, אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים דווחו גם 6,11. NSTs הוכחו גם כדי ליצור קומפלקסים עם אנזימי גליקוסילציה הקשורים פונקציונלית12,13,14. חיפשנו אלטרנטיבה לטכניקה הנמצאת בשימוש כיום, הדמיה לכל החיים פלואורסצנטית (FLIM) מבוססת גישת FRET, לחקר אינטראקציות של NSTs וחלבונים הקשורים לגולגי הקשורים לתפקוד, ולכן החלטנו לבדוק את בדיקת ההשלמה של לוציפראז הפיצול. זה איפשר לנו לזהות אינטראקציה חדשנית בין NST ואנזים גליקוזילציה הקשורים לתפקודית9.

השינוי האחרון של בדיקת ההשלמה פיצול לוציפראז, NanoBiT, משמש בפרוטוקול המוצג כאן15. הוא מסתמך על שחזור של האנזים לוציפראז (למשל, NanoLuc) משני השברים - הגדול, המכונה BiT גדול או LgBiT, חלבון 17.6 kDa, ואת הקטן, המורכב רק 11 חומצות אמינו, המכונה BiT קטן או SmBiT. שני החלבונים המעניינים מותכים עם השברים המשלימים ומתבטאים באופן חולף בקו תאים אנושי. אם שני חלבוני ההיתוך מתקשרים, אור נוצר במקום עם תוספת של מצע חדיר לתא. שני שברים אלה עברו אופטימיזציה כך שהם מתרועעים עם זיקה מינימלית אלא אם כן הם מובאים יחד על ידי אינטראקציה בין חלבוני העניין שהם מותכים.

באופן כללי, לשיטות מבוססות ביולומינציה יש כמה יתרונות על פני אלה המבוססים על פלואורסצנטיות. לאותות ביו-זוהרים יש יחס אות-לרעש גבוה יותר מכיוון שהאור ברקע זניח בהשוואה לאות שמקורו בלוציפראז16. לעומת זאת, גישות מבוססות פלואורסצנטיות סובלות בדרך כלל מרקע גבוה יחסית הנגרם על ידי תופעת ההפלורציה האוטומטית. חוץ מזה, ביולומינציה פחות מזיקה לתאים המנותחים מאשר פלואורסצנטיות, כמו במקרה הקודם אין צורך לרגש את המדגם. מסיבות אלה גישות ביו-זוהרות לחקר PPIs ב- vivo עולות על השיטות הפלואורסצנטיות הנפוצות כמו העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) או השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC).

הפרוטוקול שלנו מסתמך על הפניית אור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב הבקרה. האחרון כולל את אחד החלבונים שנבדקו אשר מותך עם שבר גדול יותר חלבון בקרה (למשל, HaloTag), התמזג עם שבר קטן יותר. האחרון הוא חלבון ממוצא חיידקי שאינו צפוי לקיים אינטראקציה עם אף אחד מחלבוני היונקים. שימוש בחלבון זה כבקרה מציב מגבלות לטופולוגיה של זוגות החלבונים של תושבי גולגי שיש לנתח. מאז בתאי יונקים חלבון זה מסונתז בציטופלסמה, שני החלבונים של עניין צריך להיות לפחות זנב ציטופלסמי אחד.

גישה זו יכולה להיות שימושית במיוחד להקרנה ראשונית של ממשקי PPIs. זה עשוי להיות שיטת הבחירה כאשר חלבוני ההיתוך של עניין באים לידי ביטוי ברמות כי הם פשוט לא מספיק עבור גישות אחרות להיות מיושם. באופן דומה, הבדיקה המשלימה לוציפראז פיצול יכול להיות האפשרות הטובה ביותר אם החלבונים של עניין באים לידי ביטוי ברמות גבוהות, אבל זה משפיע לרעה על לוקליזציה תת תאית שלהם או ידוע לכפות אינטראקציות לא ספציפיות. מאז שבר קטן יותר יש רק 11 חומצות אמינו, בדיקת ההשלמה לוציפראז לפצל ניתן ליישם בעת שימוש בתגים גדולים יותר הוא בלתי אפשרי. לבסוף, ניתן להשתמש בו כדי לאשר עוד יותר נתונים שהושגו באמצעות טכניקות אחרות, כמו במקרה המוצג כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דור הפלסמידים של הביטוי

  1. בחן את טופולוגיית הממברנה של החלבונים המעניינים באמצעות כלי חיזוי טופולוגיה.
  2. תכנן את אסטרטגיית השיבוט כך שהשברים הגדולים והקטנים יותר יעמדו בפני הציטופלסמה ברגע שחלבוני ההיתוך הוכנסו לקרומי גולגי. אם, כמו במקרה המוצג כאן, הן N והן C-termini של חלבונים מעניינים מכוונים ציטופלסמית, תייג את החלבונים בשמונה דרכים אפשריות (ראה איור 1B). אם N- או C-terminus של אחד או שניהם חלבונים של עניין הוא מכוון זוהר, אל תכלול אותו תיוג.
  3. Subclone את הגנים של עניין לתוך וקטורים ביטוי מתאים (ראה רשימת חומרים) על ידי ביצוע פרוטוקולי שיבוט סטנדרטיים.
    הערה: מומלץ לבדוק את כל הכיוונים האפשריים, מכיוון שאפשרויות תיוג מסוימות עשויות שלא לפעול עקב קרבה לא מספקת, כיוון תת-אופטימלי או אילוצים מרחביים.

2. טרנספקטיבה חולפת של הביטוי פלסמידים לתאים

  1. לקצור את תרבית התא HEK293T דבק על ידי טריפסיניזציה ו resuspend התאים במדיום צמיחה מלא ייעודי. צלחת התאים (2 x 104/100 μL / טוב) על צלחת תחתית ברורה, צד לבן 96-well. התאם את המספר הכולל של הבארות כך שיתאימו לכל השילובים והפקדים שנבדקו, כולל עותקים משוכפלים.
    הערה: נסו להשתמש רק ב-60 הבארות הפנימיות של הצלחת כדי למזער את השינויים התרמיים ולהימנע מאידוי בן לילה. שימוש בלוחות מצופים פולי-D-ליזין מומלץ מאוד כגון אלה המצוינים בטבלת החומרים, אחרת תאים עשויים להתנתק במהלך שלבי הכביסה הבאים.
  2. תרבית את התאים לילה בתנאים סטנדרטיים (37 °C (37 °C (5° C (5% CO2).
  3. למחרת להעביר את התאים עם השילובים הרצויים של plasmids ביטוי המתקבל בנקודה 1.1.
    1. מדלל פלסמידים ביטוי במדיום ללא סרום (ראה טבלת חומרים) ל 6.25 ng/μL עבור כל מבנה.
    2. הוסף את ריאגנט transfection מבוסס שומנים בדם ביחס מתאים שומנים ל- DNA ודגור על פי הוראת היצרן.
    3. הוסף 8 μL של שומנים בדם: תערובת DNA לבארות ייעודיות. מערבבים את תכולת הצלחת על ידי סיבוב עדין. התוצאה היא טרנספקטציה של שני מבני הביטוי ב 50 ng / טוב.
  4. תרבית את התאים עבור 20-24 שעות בתנאים סטנדרטיים (37 °C (37 °C (5% CO2).
    הערה: Culturing התאים במשך זמן רב יותר עלול לגרום לרמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון היתוך, אשר עשוי לקדם קשר לא ספציפי בין השברים.

3. החלפה בינונית

  1. למחרת להחליף את המדיום המותנה עם 100 μL של מדיום ללא סרום בכל באר. ודא שהתאים לא התנתקו בעת חילופים בינוניים.
    הערה: שלב זה צריך להיעשות 2-3 שעות לפני הוספת פתרון העבודה furimazine. נסיגת סרום ממזערת את הרקע הנגרם על ידי autoluminescence של furimazine.

4. הכנת פתרון עבודה פורימזין

  1. רגע לפני המדידה, יש לערבב נפח אחד של furimazine עם 19 כרכים של מאגר דילול (דילול של פי 20).
    הערה: הנפח הכולל של פתרון העבודה furimazine להיות מוכן תלוי במספר בארות בודדות שיש לנתח (פתרון העבודה furimazine מתווסף למדיום תרבית התא ביחס 1:5, ולכן, לכל היטב בעבר מלא עם 100 μL של מדיום ללא סרום 25 μL של פתרון העבודה furimazine יש להוסיף).
  2. מוסיפים את פתרון העבודה furimazine לבארות ייעודיות (25 μL / טוב). מערבבים בעדינות את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (למשל, 15 שניות ב-300-500 סל"ד).

5. מדידת זוהר

  1. הכנס את הצלחת לקורא מיקרו-לוחית זוהר.
    1. עבור ניסויים כי הם להתבצע ב 37 °C (50 °F) שיווי משקל הצלחת במשך 10-15 דקות בטמפרטורה שצוינה.
  2. בחר את הבארות שיש לנתח.
  3. קרא את הזוהר עם זמן אינטגרציה של 0.3 שניות. המשך לעקוב אחר זוהר עד 2 שעות בעת הצורך.

6. ניתוח נתונים

  1. חשב ערכים ממוצעים וחריגות תקן עבור כל השילובים שנבדקו ושלטו.
  2. נתח נתונים באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות.
  3. חשב ערכי שינוי קיפול על-ידי חלוקת אור ממוצע המתקבל עבור שילובים של עניין על-ידי אור ממוצע המתקבל עבור הפקדים השליליים המתאימים. הערך את התוצאות.
    הערה: הגישה לניתוח נתונים המוצעת כאן מניחה כי ניתן לתבוע את האינטראקציה אם האור המתקבל עבור השילוב שנבדק גבוה סטטיסטית באופן סטטיסטית מהאור המתקבל עבור שילוב הבקרה המתאים, ובמקביל, היחס בין שני ערכים אלה עולה על 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להשיג את הנתונים האמינים ביותר בגישה זו יש לבדוק את כל השילובים האפשריים (ראו איור 1). במקביל, יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים. השליטה החיובית צריכה להיות מורכבת משני החלבונים הידועים כאינטראקציה, מתוכם אחד מותך עם השבר הגדול יותר והשני מותך עם השבר הקטן יותר. השליטה השלילית באופן אידיאלי צריכה להיות מורכבת משני חלבוני קרום מסוג III שאינם אינטראקציה מתויגים באופן דומה. עם זאת, הקמת שליטה כזו עשויה להיות מאתגרת, שכן חוסר האינטראקציה של שני חלבוני הבקרה צריך להיות מאושר ביסודיות באמצעות מס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המאפשר הדגמה של מתחמים הטרולוגיים שנוצרו בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי, כגון NSTs, באמצעות בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. הגישה המוצעת לניתוח נתונים ופרשנות כרוכה בהתייחסות לאור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב השליטה המתאים, המורכב מאחד החלבונים של עניין התמזגו עם השבר הגדול יותר ואת חלבון הבקרה של מקור חיידקי התמזג עם שבר קטן יותר. האחרון בא לידי ביטוי בציטופלסמה של תאי יונקים; לכן, שימוש בו כהפניה דורש כי N- ו / או C-termini של החלבונים, אשר האינטראקציה שלהם היא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מס ' 2016/23/D/NZ3/01314 מהמרכז הלאומי למדע (NCN), קרקוב, פולין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% תמיסת
קו תאי יונקים דבק BioCoat
Poly-D-Lysine 96 בארות לבן/שקוף תחתון שטוח מטופל TC, עם מכסהקורנינג356651
צנטריפוגה
תאים תוספי תרבית תאים (סרום בקר עוברי מומת בחום, L-גלוטמין, פניצילין, סטרפטמיצין)
CO<תת>2 אינקובטור
פלסמידים ביטוי המקודדים חלבונים מעניינים שאינם מתויגים עם שברי
FuGENE HD Transfection ReagentPromegaE2311
GloMax Discover Microplate Reader (או קורא מיקרו-פלטות זוהר אחר)PromegaGM3000
מצע גידול המוקדש לקו התאים השתמש
בחומרים וריאגנטים לשיבוט מולקולרי סטנדרטי (חיידקים, פולימראז יציב בחום, אנזימי הגבלה, DNA ליגאז, חומרים וריאגנטים לטיהור חומצות גרעין)
NanoBiT MCS StarterSystem PromegaN2014ערכה זו מכילה וקטורים המאפשרים תיוג של החלבונים המעניינים עם שברי NanoBiT בכיוונים שונים, כמו גם את פלסמיד הבקרה המקודד חלבון HaloTag המאוחה עם SmBiT וזוג פלסמיד בקרה חיובי.
מערכת בדיקת תאים חיים של Nano-GloPromegaN2011ערכה זו מכילה פורימזין, שהוא מצע המאפשר זיהוי פעילות NanoLuc בתאים חיים, ומאגר דילול ייעודי.
Opti-MEM I מדיום סרום מופחת, ללא פנול אדוםGibco11058021
Oribital שייקר
תוכנה לניתוח נתונים (למשל GraphPad Prism)
תרמציקלר
טריפסין-EDTAתרביתNanoBiT

מקורות

  1. Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
  2. Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
  3. Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
  4. Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
  5. Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
  6. Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
  7. Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
  8. Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).
  9. Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).
  10. Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
  11. Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
  12. Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
  13. Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
  14. Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
  15. Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  16. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  17. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  18. Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
  19. White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
  20. Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
  21. Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
  22. Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275(2020).
  23. Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HEK293SLC35A2 SLC35A3
הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.