מאמר שיטה

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61689

⸱

27 ביולי 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

בעוד התנגשויות מזלג שכפול עם צינורות DNA יכול לגרום לשברים גדיל כפול, פחות ידוע על האינטראקציה בין replisomes וחסימת נגעים. השתמשנו במבחן קשירת הקרבה כדי להמחיש מפגשים אלה ולאפיין את ההשלכות על קומפוזיציה רפלימית.

תקציר

תובנה משמעותית קיימת לגבי התגובה התאית לשברי גדיל כפול (DSB), הנגרמים על ידי נוקלאזות, קרינה ומפסקי דנ"א אחרים. בין השאר, הדבר משקף את זמינותן של שיטות לזיהוי אתרי הפסקה, ואת אפיון הגורמים שגויסו ל-DSB ברצפים אלה. עם זאת, DSBs מופיעים גם כמתווכים במהלך עיבוד של צינורות DNA שנוצרו על ידי תרכובות שאינן גורמות ישירות להפסקות, ואינן מגיבות באתרי רצף ספציפיים. כתוצאה מכך, עבור רוב סוכנים אלה, טכנולוגיות המאפשרות ניתוח של אינטראקציות קשירה עם גורמי תגובה וחלבוני תיקון אינם ידועים. לדוגמה, קישורים צולבים בין גדילי דנ"א (ICLs) יכולים לעורר שברים בעקבות מפגשי מזלג שכפול. למרות שנוצרו על ידי תרופות בשימוש נרחב כמו כימותרפיה סרטן, לא היתה מתודולוגיה לניטור האינטראקציות שלהם עם חלבונים שכפול.

כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו לעקוב אחר התגובה התאית להתנגשויות מזלג עם adducts מאתגר אלה. קישרנו אנטיגן סטרואידים לפסורלן, היוצר כיל תלוי פוטואקטיבציה בגרעינים של תאים חיים. הכילים הודגמו על ידי אימונופלואורסנציה כנגד תג האנטיגן. התג יכול גם להיות שותף בבדיקת קשירת הקרבה (PLA) המדווחת על קשר הדוק של שני אנטיגנים. ה-PLA נוצל כדי להבדיל בין חלבונים שהיו קשורים קשר הדוק עם כיל מתויגת לבין חלבונים שלא. ניתן היה להגדיר חלבונים רפליזומיים שנשמרו לאחר מפגשים עם כיל ולזהות חלבונים אחרים שאבדו. גישה זו ישימה לכל מבנה או צינור DNA שניתן לזהות באופן אימונולוגי.

מבוא

התגובה התאית לשברים כפולים מתועדת היטב הודות לרצף של שיטות חזקות יותר ויותר להכוונת הפסקות לאתרים גנומיים ספציפיים 1,2,3. ודאות המיקום מאפשרת אפיון חד משמעי של חלבונים וגורמים אחרים המצטברים באתר ומשתתפים בתגובת הנזק לדנ"א (DDR), ובכך מניעים את מסלולי חיבור הקצה הלא הומולוגי (NHEJ) והקומבינציה ההומולוגית (HR) המתקנים שברים. כמובן, הפסקות רבות מוצגות על ידי סוכנים כגון קרינה ומינים כימיים שאינם תוקפים רצפים ספציפיים4. עם זאת, עבור אלה ישנם נהלים זמינים שיכולים להמיר את הקצוות למבנים מקובלים עבור תיוג לוקליזציה 5,6. הפסקות מוצגות גם על ידי תהליכים ביולוגיים, כגון סידור מחדש של אימונוגלובולינים, והטכנולוגיה העדכנית מאפשרת לוקליזציה שלהם, כמו גם7. לאחר מכן ניתן לקבוע את הקשר בין הגורמים המגיבים לבין אתרים אלה.

הפסקות מופיעות גם כתוצאה עקיפה של אדדוקציות הנוצרות על ידי תרכובות שאינן מפסקות אינהרנטיות אלא משבשות עסקאות DNA כגון שעתוק ושכפול. הם עשויים להיווצר כתכונה של התגובה התאית לחסימות אלה, אולי במהלך תיקון או משום שהם מעוררים מבנה פגיע להתקפת נוקלאז. בדרך כלל, הקשר הפיזי בין האדוקט, ההפסקה והקשר עם גורמים מגיבים הוא היסק. לדוגמה, כילים נוצרים על ידי כימותרפיות כגון ציספלטין ומיטומיצין C8 וכתוצר תגובה של אתרים בסיסיים9. מזלגות כיל ידועים כבלוקים חזקים למזלגות שכפול10, ובכך מעכבים מזלגות שניתן לבקע על ידי נוקלאזות11. הקישור הקוולנטי בין הגדילים מוקל לעתים קרובות על ידי מסלולים שיש להם הפסקות מחייבות כביניים 12,13, מה שמחייב רקומבינציה הומולוגית כדי לבנות מחדש את מזלג השכפול14. ברוב הניסויים עוקב החוקר אחר תגובת הגורמים המעניינים להפסקות הנוצרות במורד הזרם של התנגשות מזלג שכפול עם כיל. עם זאת, מכיוון שלא נמצאה טכנולוגיה ללוקליזציה של נגע פרובוקטיבי, ניתן רק להניח את קרבתו של הרפליזום, וחלקיו המרכיבים, לכיל.

פיתחנו אסטרטגיה המאפשרת ניתוח של אסוציאציות חלבוניות עם אדדוקטים קוולנטיים ספציפיים שאינם רצפים, כפי שמודגם כאן על ידי ICLs. במערכת שלנו אלה מוצגים על ידי psoralen, מוצר טבעי פוטואקטיבי המשמש במשך אלפי שנים כטיפול להפרעות עור15. הגישה שלנו מבוססת על שתי תכונות חשובות של פסאורלן. הראשון הוא התדירות הגבוהה שלהם של היווצרות crosslink, אשר יכול לעלות על 90% של adducts, בניגוד פחות מ 10% שנוצרו על ידי תרכובות פופולריות כגון cisplatin או Mitomycin C 8,16. השני הוא נגישות המתחם לצמידות ללא אובדן יכולת הצלבה. קישרנו באופן קוולנטי בין טרימתיל פסאורלן לדיגוקסיגנין (Dig), אימונוטאג ותיק. זה מאפשר זיהוי של adducts psoralen בדנ"א גנומי על ידי immunostaining של תג Dig, והדמיה על ידי immunofluorescence קונבנציונאלי17.

מגיב זה יושם, בעבודתנו הקודמת, לניתוח מפגשי מזלג שכפול עם כיל באמצעות בדיקה מבוססת סיבי DNA16. בעבודה זו מצאנו כי השכפול יכול להימשך מעבר לכיל שלמה. זה היה תלוי בקינאז ATR, אשר מופעל על ידי מתח שכפול. ההפעלה מחדש של השכפול הייתה בלתי צפויה בהתחשב במבנה של מנחת המסוקים המשוכפל CMG. זה מורכב מהטרו-הקסמר MCM (M) היוצר טבעת פעורת היסט סביב גדיל התבנית לסינתזה מובילה של גדיל אשר ננעל על ידי החלבונים של קומפלקס GINS (G, המורכב מ- PSF1, 2, 3 ו- SLD5) ו- CDC45 (C)18. ההצעה כי השכפול יופעל מחדש בצד הדיסטלי של כיל לצד ההתנגשות של הרפליזום טענה לשינוי במבנה הרפליזום. כדי לענות על השאלה אילו רכיבים היו בתשובה בזמן המפגש עם כיל פיתחנו את הגישה המתוארת כאן. ניצלנו את תג Dig כשותף ב-Proximity Ligation Assays (PLA)19 כדי לחקור את הקשר ההדוק של כיל עם חלבונים של replisome20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תאים

  1. יום 1
    1. טפלו מראש בכלי תרבית בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית בתמיסת הדבקת תאים.
    2. תאי צלחת במנות שטופלו מראש יום לפני הטיפול. התא צריך להתחלק באופן פעיל ו 50-70% במפגש ביום הניסוי.
      הערה: תאי HeLa שימשו בניסוי זה עם Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 1x פניצילין / סטרפטומיצין. אין הגבלה על קווי תאים דבקים. עם זאת, תאים שאינם דבקים חייבים להיות צנטריפוגות על שקופיות ולתקן לפני הניתוח על ידי PLA.
  2. יום 2
    1. הכן תמיסת מלאי של Digoxigenin Trimethyl psoralen (Dig-TMP) על ידי השעיה מחדש של aliquot קפוא של Dig-TMP מסונתז בעבר ב 1:1 EtOH:H 2 O. קבע את הריכוז על ידי מדידת OD ב 250 ננומטר של דילול 100x (ב H2O) של Dig-TMP מומס. מקדם ההכחדה של Dig-TMP הוא 25,000. ודא את הריכוז על ידי מדידת OD ב- 250 ננומטר לפני כל שימוש וחשב ריכוז במלאי: ABS x 100 x 106/25,000 = ריכוז (במיקרומטר). בדרך כלל, פתרון המניות הוא סביב 3 mM. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כחודש.
      הערה: Dig-TMP חייב להיות מסונתז כימית מראש, בהתאם להליך המתואר כאן. ריפלוקס 4'-כלורומתיל-4,5',8-טרימתילפסוראלן עם 4,7,10-טריוקסה-1,13-טרידקנדי-אמין בטולואן תחת חנקן למשך 12 שעות. הסר את הממס ולשחזר את 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen המוצר על ידי כרומטוגרפיה ג'ל סיליקה. הצמידו את המוצר לדיגוקסיגנין NHS אסטר בדימתיל פורממיד וטריאתילאמין ב-50°C למשך 18 שעות. הסר את הממס ולטהר את השאריות על ידי הכנת שכבה דקה סיליקה ג'ל כרומטוגרפיה. יש להדליק את רצועת המוצר כלורופורם: מתנול: 28% תערובת אמוניום הידרוקסיד (8:1:0.1). אידוי הממסים והמסת הגלולה ב-50% EtOH:H2O.
    2. הוסף את מניית Dig-TMP ב-50% EtOH:H2O למדיום תרבית התאים לריכוז סופי של 5 מיקרומטר. הבא את המדיום ל-37°C. שאפו את התווך מהצלחות, הוסיפו את ה-Dig-TMP שחומם מראש והניחו את הצלחות באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-Dig-TMP להתאזן.
    3. בזמן שהתאים דוגרים, חממו מראש את קופסת ה-UV (ראו טבלת חומרים) ל-37°C.
    4. הניחו את הצלחות בקופסת UV מחוממת מראש וחשפו את התאים למינון של 3 J/cm2 של אור UVA למשך 5 דקות עבור ניסוי זה. לוחות הונחו על גבי בלוק תרמי שנשמר ב 37 מעלות צלזיוס, במהלך הקרנה. חשב את הזמן באמצעות הנוסחה:
      figure-protocol-1
    5. שואפים את המדיום באמצעות פיפטה, מוסיפים מדיום טרי שחומם מראש ומניחים את הצלחות בחזרה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך שעה אחת.
    6. יש להסיר את המדיה ולשטוף כלים פעם אחת בעדינות במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
    7. הסר PBS והוסף 0.1% פורמלדהיד (FA) ב- PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). זה מונע ניתוק תאים במהלך CSK-R (cytoskeleton extraction buffer containing RNase, המתואר ב-1.2.9.) טיפול מקדים הנדרש כדי לחלץ את האלמנטים הציטופלזמיים ולהפחית את רקע ה-PLA.
    8. שאפו לצאת מה-FA ולשטוף כלים עם PBS פעם אחת.
    9. הוסף חיץ CSK-R ודגור במשך 5 דקות ב- RT כדי להסיר ציטופלסמה [מאגר CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM סוכרוז, 3 mM MgCl2, 0.5%Triton X-100, 300 מיקרוגרם / מ"ל RNase A]. שאפו את החיץ, הוסיפו CSK-R טרי ודגרו במשך 5 דקות ב-RT.
      הערה: ניתן לאחסן מלאי של מאגר CSK בטמפרטורה של 4°C, ולהוסיף Triton X ו-RNaseA ממש לפני השימוש.
    10. יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים.
    11. תקן תאים עם 4% פורמלדהיד ב- PBS למשך 10 דקות ב- RT.
    12. לשטוף תאים עם PBS. בצע שלב זה שלוש פעמים.
    13. מוסיפים 100% מתנול קר ודגורים במשך 20 דקות בטמפרטורה של -20°C.
    14. לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים. בשלב זה ניתן לאחסן תאים PBS בתא לח ב 4 ° C למשך עד שבוע.
    15. לדגור על תאים ב 80 μL של 5 mM TritonX-100 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    16. לדגור על תאים עם 100 μL של 5 mM EDTA ב PBS בתוספת 1 μL של 100 מ"ג / מ"ל RNase A במשך 30 דקות ב 37 ° C.
    17. לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים.
    18. יש לאחסן תאים במאגר חוסם (5% BSA ו-10% סרום עיזים ב-PBS) בתא לח למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.

2. בדיקת קשירת קרבה

הערה: בצע בדיקת קשירת קרבה ביום השלישי.

  1. הכתמת נוגדנים
    1. הכינו 40 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית לכל צלחת: הוסיפו את הנפח המתאים של נוגדנים ראשוניים כדי להשיג את הדילול הרצוי (עכבר אנטי דיגוקסיגנין ונוגדן ארנב כנגד רכיב רפליזום כגון MCM5, CDC45, PSF1 או pMCM2, דילולים המפורטים בטבלת החומרים) למאגר חוסם (כדי להגיע לנפח סופי של 24 μL). ערבבו על ידי הקשה ותנו לו לעמוד במשך 20 דקות ב- RT. הכינו תערובת אב למספר דוגמאות וערבבו על ידי הקשה לפני החלת על הבארות.
    2. הוסף 40 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית למרכז הבאר ודגר בתא לח במשך 1 שעה ב 37 ° C. במהלך הצביעה, אפשרו לבדיקות ה-PLA ולמאגר החוסם להתחמם לטמפרטורת החדר.
    3. שטוף תאים עם PBS-T [PBS-T: 0.05% Tween-20 in 1X PBS] ב-RT. בצע שלב זה שלוש פעמים.
    4. בזמן השטיפה, הכינו 40 מיקרוליטר של תמיסת בדיקת PLA לכל צלחת (בדיקות PLA מורכבות מנוגדן משני המזהה IgG של ארנב או עכבר, הקשור באופן קוולנטי לאוליגונוקלאוטיד PLUS או מינוס): 8 μL של נוגדן PLA probe anti mouse-PLUS + 8 μL של נוגדן PLA probe anti rabbit-MINUS + 24 μL של חיץ חוסם. מערבבים ומניחים לו לעמוד במשך 20 דקות ב-RT. הכינו תערובת אב למספר דגימות וערבבו היטב לפני החלת על הבארות. מניחים את התמיסה באמצע הבאר בצלחת.
    5. הסר את השטיפה האחרונה, הוסף 40 μL של תמיסת בדיקה PLA למרכז הבאר, ודגר בתא לח במשך 1 שעה ב 37 ° C.
    6. יש לשטוף במאגר A שלוש פעמים, למשך 10 דקות כל אחת, על משטח הטיה ב-RT. במהלך השטיפה, הביאו את תערובת הקשירה ל-RT.
  2. קשירה והגברה
    1. מכינים 40 μL של תערובת קשירה לצלחת: 8 μL (5x) של ציר קשירה + 31 μL של מים מזוקקים + 1 μL של ליגאז. הכינו תערובת מאסטר למספר צלחות וערבבו היטב לפני החלת על הבארות.
    2. הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת קשירה לכל צלחת ודגרו בתא לח למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
    3. שטפו את התאים 3x עם חיץ A, כל אחד למשך 2 דקות, על משטח הטיה ב-RT.
    4. להכין 40 μL של תמיסת הגברה לכל מנה: 8 μL (5x) של מלאי הגברה + 31.5 μL של מים מזוקקים + 0.5 μL של DNA פולימראז. הכינו תערובת אב למספר דגימות וערבבו היטב לפני החלת הבארות.
    5. הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת הגברה לכל צלחת ודגרו בתא לח בטמפרטורה של 37°C למשך 100 דקות.
    6. יש לשאוף מתמיסת ההגברה ולשטוף עם חיץ B. לבצע 6 שטיפות כל אחת במשך 10 דקות, על משטח הטיה ב-RT.
    7. שטפו פעם אחת עם חיץ B 0.01x למשך דקה אחת ב-RT.
    8. שאפו חיץ B ודגרו על צלחות עם נוגדנים משניים, Alexa Fluor 488 Anti-mouse IgG ו-Alexa Fluor 568 Anti-rabbit IgG בתמיסת חסימה בדילול מתאים בחיץ חוסם, בתא לח, למשך 30 דקות ב-37°C או לילה ב-4°C.
    9. שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS-T, למשך 10 דקות כל אחד על משטח הטיה ב-RT.
    10. שאפו PBS-T והרכבו בתווך הרכבה עם DAPI. ניתן לצלם את הלוחות המותקנים באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך לא יותר מ-4 ימים לפני ההדמיה.

3. הדמיה וכימות

  1. בצע הדמיה במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי (אם רצוי הדמיה תלת-ממדית, כסה לפחות 3 מיקרומטר ב-15 ערימות). בצע ניסויים במשולש וצלם מספר מספיק של שדות כדי לבצע לפחות 100 תצפיות לכל דגימה או תנאי. צייר את כל השדות והדגימות, כולל פקדים, באמצעות אותן הגדרות חשיפה.
  2. כימות באמצעות תוכנה מתאימה לניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים עבור קוד פתוח ותוכנות מסחריות המסוגלות לבצע ניתוח זה בתמונות מישוריות בודדות או מרובות).
    1. גרעיני תאים מגזריים המבוססים על צביעת DAPI. בצע זיהוי של נקודות PLA גרעיניות. הקצה נקודות PLA לגרעין המתאים להם. ייצוא נקודות PLA לכל גרעין תוצאות כקובץ csv (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2).
  3. ניתוח סטטיסטי (ראה טבלת חומרים לקבלת הצעות לקוד פתוח ולתוכנות מסחריות).
    1. יש לוודא אם הדגימות עוקבות אחר התפלגות תקינה באמצעות בדיקת שפירא-וילק.
    2. קבע אם יש הבדל משמעותי בין שתי דגימות באמצעות מבחן Student-t (אם הנחת ההתפלגות הנורמלית התקיימה) או מבחן Wilcoxon-Rank Sum (אם הנחת ההתפלגות הנורמלית מופרת עבור מדגם).
  4. תצוגה חזותית של נתונים: צור תרשימי נקודות בשילוב עם תרשימי תיבות כדי להציג באופן חזותי את התפלגות הנתונים, החציון (Q2), האחוזון ה-25 (Q1)והאחוזון ה-75 עבור הדגימותהשונות (ראה טבלת חומרים לקבלת קוד פתוח מוצע ותוכנה מסחרית).

4.3D תצוגה של pMCM2: אינטראקציות כיל

  1. תמונה לוחות PLA על מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב, באמצעות מטרת שמן צמצם מספרי Plan Fluor 60x/1.25. רכוש 16 ערימות המכסות 1.6 מ"מ וצור את השחזור התלת-ממדי באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה (ראה טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

PLA של Dig-TMP עם חלבונים replisome
המבנה של Dig-TMP מוצג באיור 1. פרטי הסינתזה, שבה טרימתיל פסאורלן צומד באמצעות מקשר גליקול לדיגוקסיגנין, נדונו בעבר17,21. דגירה של תאים עם התרכובת ואחריה חשיפה לאור 365 ננומטר (UVA) פוטואקטיבית את התרכובת ומניעה את תגובת הקרוסלינקינג. קצת יותר מ-90% מהחברות הן של כיל16. התג Dig יכול להיות מומחש על-ידי immunofluorescence אשר חושף את נוכחותם של ICL ברחבי הגר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות שה- PLA היא טכניקה חזקה מאוד, ישנם חששות טכניים שיש לפתור על מנת להשיג תוצאות ברורות וניתנות לשחזור. הנוגדנים חייבים להיות בעלי זיקה גבוהה וספציפיות. יתר על כן, חשוב להפחית את אותות הרקע הלא ספציפיים ככל האפשר. גילינו שקרומים ופסולת תאית תורמים לרקע, והסרנו אותם ככל האפשר. השטיפות עם חומר ניקוי המכיל חוצצים לפני הקיבוע, והשטיפה עם מתנול לאחר התיקון עוזרות להפחית את הקשירה הלא ספציפית. האזהרה היא שטיפול בחומרי ניקוי לפני הקיבוע עלול לגרום לניתוק תאים. אנו מוצאים כי טיפול בצלחות עם דבק תאים וקידומת עם 0.1% FA לפני הט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך, בחלקו, על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, המכון הלאומי להזדקנות, ארצות הברית (Z01-AG000746-08). J.H. נתמך על ידי הקרנות הלאומיות למדעי הטבע של סין (21708007 ו -31871365).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 568, עיזים נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולבInvitrogenA-100111 ב-1000
צלחות 35 מ"מ עם זכוכית 1.5 כיסויMatTekP35-1.5-14-Cזכוכית תחתונה כלי מיקרווול 35 מ"מ צלחת פטרי Microwell
Alexa Fluor 488, עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולבInvitrogenA-100011 ב-1000
סרום בקר אלבומין (BSA)SeraCare1900-0012פתרון חסימה, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C
CDC45 נוגדן (ארנב)Abcamab1267621 ב 200
דבק תאיםמדעי החיים354240לתמיסת TAK
מיקרוסקופ קונפוקליNikkonTE2000 מיקרוסקופ דיסק מסתובבמצויד בתוכנת Volocity
נוגדן Digoxigenin (Dig) (עכבר)Abcamab4201 ב 200
Dig-TMPמסונתז ב ריאגנטים
(5&)DUO82010של סיגמא-אולדריץ'בטמפרטורה של -20 מעלות; יש
ריאגנטים לזיהויסיגמא-אולדריץ'DUO92007בטמפרטורה של -20 ו-deg; C
Duolink באתרו אוליגונוקלאוטיד בדיקת PLA MINUSSigma-AldrichDUO92004נגד עכבר MINUS, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C
Duolink באתרו אוליגונוקלאוטיד בדיקת PLA PLUSSigma-AldrichDUO92002אנטי-ארנב PLUS, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C
Duolink במאגר כביסה באתרו Aמאגרי כביסה של Sigma-AldrichDUO82046Duolink, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C
Duolink במאגר כביסה באתרו BSigma-AldrichDUO82048Duolink Wash Buffers, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות;
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיCמיקרוסקופ Zeiss Axiovert 200Mמצויד בחבילות התוכנה Axio Vision (Zeiss, גרמניה)
פורמלדהיד 16%Fisher ScientificPI28906לתיקון תמיסת
סרום עיזיםThermo31873תמיסת חסימה, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות;
C תוכנת ניתוח תמונהבקוד פתוחCell profilerעובד לניתוח תמונות מישור יחיד
נדרש רישיוןתוכנת ניתוח BitplaneImarisמודול ביולוגיה של התא. יכול לכמת נקודות/גרעינים PLA בערימות תמונות (3D) ולבצע שחזורים תלת מימדיים
Ligase (1 יחידה/μ l)DUO82029של סיגמא-אולדריץ'בטמפרטורה של -20 מעלות; מגיב קשירה C
(5&)DUO82009של סיגמא-אולדריץ'בטמפרטורה של -20 מעלות;
C נוגדן MCM2 (ארנב)Abcamab44611 ב-200
נוגדן MCM5 (חד-שבטי ארנב)AbcamAb759751 ב-1000
MethanolLab ALLEYA2076טרום קר ב-20° C לפני השימוש
פוספוMCM2S108 נוגדן (ארנב)Abcamab1092711 ב-200
פולימראז (10 יחידות/μ l)DUO82030של סיגמא-אולדריץ'בטמפרטורה של -20 ו-deg; C
להאריך את אמצעי ההרכבה מזהב עם נוגדן DAPIThermoFisher ScientificP36935
PSF1 (ארנב)Abcamab1811121 ב-200
RNAse A 100 מ"ג/מ"לQiagen19101ריאגנטים צריכים להיות מאוחסנים ב-4 מעלות; C
תוכנה לניתוח סטטיסטי והדמיית נתוניםבקוד פתוחR studioggplot2 חבילה ליצירת תרשים נקודות ותיבה
סטטיסטי והדמיית נתונים תוכנת רישיוןSystat SoftwareSigmaplot V13
TMP (trioxalen)Sigma-AldrichT6137_1G
TritonX-100Sigma-AldrichT8787_250ML
טווין 20סיגמא-אולדריץ'P9416_100ML
תיבת UVדרום ניו אינגלנד אולטרה סגולהופסק. ראה תא בדיקת UV של Opsytec כתחליף אפשרי
תא בדיקת UV תא בדיקת UVOpsytecUV TEST CHAMBER BS-04
VE-821SelleckchemS8007הריכוז הסופי הוא 1µ מ
תא להגברה Duolink של מעבדת זיידמןיש לאחסן ריאגנטים לאחסן C Duolink יש לאחסן ריאגנטים יש לאחסן ריאגנטים יש לאחסן ריאגנטים ניתוח

מקורות

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24(2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541(2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון


Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 1/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

תגיות

DNAATR

מאמרים קשורים