מאמר שיטה

הכנת ג'ל פפטיד המוגדר על ידי המשתמש למודלים מבוקרים של תרבית תלת מימדית של סרטן ומחלות

3.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61710

⸱

3 בדצמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer & Stem Cells, School of Medicine, Nottingham Biodiscovery Institute, University of Nottingham, 2Breast Biology Group, Manchester Breast Centre, Division of Cancer Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, 3SGC, Botnar Research Centre, NDORMS, University of Oxford

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שיטה ליצירת סביבת תרבית תאים תלת-ממדית, שניתן להשתמש בה כדי לחקור את החשיבות של אינטראקציות תא/מטריצה בהתקדמות הסרטן. באמצעות אוקטפפטיד פשוט להרכבה עצמית, ניתן לשלוט במטריצה המקיפה תאים עטופים, עם ויסות עצמאי של רמזים מכניים וביוכימיים.

תקציר

ישנה מודעות הולכת וגוברת לכך שתאים שגדלו בתלת-ממד מדגימים טוב יותר התנהגות in vivo מאשר אלה שגדלו בדו-ממד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים הידרוג'ל תלת מימדי פשוט ומתכוונן, המתאים לתרבית תאים ורקמות בסביבה התואמת את הסביבה הטבעית שלהם. זה חשוב במיוחד לחוקרים החוקרים את ההתחלה, הגדילה והטיפול בסרטן כאשר האינטראקציה בין התאים למטריצה החוץ-תאית המקומית שלהם היא חלק מהותי מהמודל. המעבר לתרבית תלת מימדית יכול להיות מאתגר ולעתים קרובות קשור לחוסר יכולת שחזור עקב שונות גבוהה מאצווה לאצווה במטריצות תרבית תלת מימד שמקורן בבעלי חיים. באופן דומה, בעיות טיפול יכולות להגביל את התועלת של הידרוג'לים סינתטיים. בתגובה לצורך זה, ביצענו אופטימיזציה של ג'ל פפטיד פשוט להרכבה עצמית, כדי לאפשר תרבית של מודלים רלוונטיים של קו תאים של סרטן ומחלות, כמו גם רקמות/תאים שמקורם בחולה. הג'ל עצמו נקי מרכיבי מטריצה, מלבד אלה שנוספו במהלך האנקפסולציה או הופקדו בג'ל על ידי התאים העטופים. ניתן לשנות את התכונות המכניות של ההידרוג'לים ללא תלות בתוספת מטריצה. לכן הוא פועל כ'לוח חלק' המאפשר לחוקרים לבנות סביבת תרבית תלת מימדית המשקפת את רקמת המטרה המעניינת ולנתח את ההשפעות של כוחות מכניים ו/או בקרה ביוכימית על התנהגות התא באופן עצמאי.

מבוא

התפקידים הרבים שממלאת הסביבה החוץ-תאית בהתפתחות והתקדמות הסרטן הופכים ברורים יותרויותר. לאחרונה, ניתוחים מפורטים מבוססי פרוטאומיה הוסיפו לבסיס ספרות משכנע כבר, המראים כי רכיבי מטריצה שמקורם בתאי סטרומה הקשורים לסרטן, או תאי הסרטן עצמם, הם גורמי מפתח באירועים כגון קידום מעבר מזנכימלי אפיתל והתפשטות גרורתית 2,3,4. בהתחשב בחשיבות המוכרת הזו של המטריצה החוץ-תאית (ECM), זה הופך להיות חיוני להתקדם לעבר פלטפורמות תרבית תאים המאפשרות שליטה על הסביבה התלת מימדית המוצגת לתאים. בתגובה לצורך זה, פרוטוקול זה מציג שיטה לאנקפסולציה ותרבית תאים בהידרוג'ל תלת מימדי, עם הרכב ECM מוגדר על ידי המשתמש ותכונות מכניות5.

נכון לעכשיו, קיים מתאם גרוע בין היעילות הטיפולית בסרטן בתרבית דו-ממדית במבחנה, ההשפעה של טיפולים אלה במודלים הנוכחיים in vivo (xenograft, PDX) ופעילותם בסופו של דבר בניסויים קליניים 6,7. זה הוביל לכשלים משמעותיים בצנרת גילוי התרופות עם צורך דחוף במודלים משופרים במבחנה המאפשרים לטיפולים שנבדקו "להיכשל מוקדם, להיכשל בזול". חוקרים רבים משתמשים במוצר שמקורו במסטוציטומה של עכברים, למשל, Matrigel (או מוצרים דומים) כדי ליצור סביבות עשירות במטריצות תלת מימד כדי לגדול ולצפות בהתנהגות התאים במבחנה, כולל PDX ותאים אחרים הקרובים לחולה 8,9,10. עם זאת, גישה זו של "מידה אחת מתאימה לכולם" מזניחה את התפקיד המורכב שממלאים חלבוני מטריצה/גליקנים בהתחלה והתקדמות של סרטן.

ההכרה בתפקידה של מטריצה חוץ-תאית (ECM) בשליטה על התנהגות התאים עודדה גם את השימוש בתרבית תלת מימדית בהידרוג'לים או עליהם המורכבים מרכיבי מטריצה ספציפיים11. בעוד שזה שימושי לחקירת אינטראקציות ספציפיות, מערכות אלו סובלות מחוסר יכולת להפריד הוראות מכניות וביוכימיות בין תאים למטריצה. הם עשויים גם להיות קשים לטיפול ויכולים לתת קריאות לא ברורות של התנהגות התא. ג'ל קולגן הוא דוגמה מרכזית לבעיה זו, שכן התכווצות ג'ל בתיווך תאים יכולה להפחית באופן דרמטי את היכולת לדמיין תאים בתוך הג'ל5. ישנן גם כמה מערכות ג'ל אלגנטיות מאוד, מרובות רכיבים, שמומחים השתמשו בהן להשפעה רבה 12,13,14. אלה יכולים לשלב מקשרים רגישים לאנזימים ומוטיבים ביו-אקטיביים, אך הם מורכבים משמעותית בניסוח וביישום שלהם מאשר המערכת המתוארת כאן.

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודלים של תרביות תלת מימד מוגדרים במלואם, המאפשרים לעצב את תפקידי ה-ECM בהתפתחות ובמחלות במבחנה. הבסיס למודל התלת מימד הוא ג'ל פפטיד, אותו תיארנו בעבר כאופטימיזציה של הידרוג'ל אוקטפפטיד פשוט להרכבה עצמית 5,15,16. על ידי התרחקות ממטריצות מורכבות שמקורן בבעלי חיים, מערכת זו מציעה יתרון משמעותי של עקביות משופרת מאצווה לאצווה וטיפול משופר. במצבו הפשוט, הפפטיד אינו מכיל מוטיבים שמקורם במטריצה ומספק למעשה 'לוח חלק' שעליו המשתמש יכול לבנות פונקציונליות.

אנו מדגימים כיצד ניתן לווסת את התכונות המכניות של ג'ל הפפטיד באופן עצמאי, לצד שילוב של חלבוני מטריצה/גליקנים. המערכת ניתנת לכוונון גבוה, ומאפשרת עטיפה של מגוון סוגי תאים בפורמטים שונים. חשוב לבניית מודל סרטני, ניתן לשלב גם תאי סטרומל: או בתרבית משותפת ישירה או מופרדים כדי לאפשר ניתוח ספציפי של אינטראקציות עקיפות בין תאי סרטן לסטרומה. חשוב מכל, הפרוטוקול המתואר כאן אינו דורש ידע מורכב בכימיה וניתן לשחזר אותו בכל מעבדת תרבית תאים ללא צורך בידע או ציוד כימי מיוחד.

יש לנו שיטות אופטימיזציה לחקר התנהגות התאים בג'לים הפפטידיים, כולל הדמיה, ניתוח ריאולוגי, מיצוי חומר ל-PCR5 והטמעה להערכה היסטולוגית. יתרון ברור למערכת ההידרוג'ל הפשוטה הוא היכולת לדמיין ולחקור את המטריצה המופקדת על ידי תאים עטופים. החשיבות של מטריצות שמקורן בתאים והיתרונות של הבנה טובה יותר של האופן שבו תאים מהנדסים מחדש את המיקרו-סביבה המקומית שלהם הודגשה לאחרונה17 ומשקפת מודעות גוברת לחשיבות של לכידת רכיבי מטריצה המופרשים על ידי תאים, באופן דומה לזה המתרחש in vivo. רתימת היכולת למדל תהליכים כאלה עשויה להיות אחד המניעים הבסיסיים לשיפור הרלוונטיות של המטופל במודלים של מחלות מבוססות הידרוג'ל.

פרוטוקול

1. פירוק פפטיד

  1. במכסה מנוע לתרבית רקמות, הוסף 800 מיקרוליטר מים סטריליים לצינור של 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000.
  2. בעזרת איזון עדין, שקלו את אבקת הפפטיד לתוך סירת שקילה לא סטטית. השתמש במסה (במ"ג) של פי 1.25 מריכוז ג'ל הפפטיד הסופי הרצוי (במ"ג/מ"ל, טבלה 1).
    הערה: השיטה המתוארת כאן תייצר נפח של כ-1.25 מ"ל של ג'ל פפטיד לכל שפופרת בנקודת הג'לציה הסופית. ניתן להכין מספר צינורות בכל פעם, או לחילופין ניתן להגדיל את הנפח לכל צינור כאשר המשתמש מנוסה בשיטה המוצגת.
ריכוז פפטידים (לאחר ג'לציה סופית)מסת פפטידתוספת NaOH ראשונית
6 מ"ג/מ"ל7.5 מ"ג30 מיקרוליטר
10 מ"ג/מ"ל12.5 מ"ג60 מיקרוליטר
15 מ"ג/מ"ל18.75 מ"ג100 מיקרוליטר

טבלה 1: מסת פפטיד ותוספת NaOH ראשונית מוצעת לריכוזי ג'ל סופיים טיפוסיים. טווחי ריכוזי הפפטידים המפורטים עשויים להיות מורחבים לכל כיוון, עם זאת, סביר יותר שריכוזי פפטידים נמוכים יותר עשויים שלא ליצור ג'לים יציבים, בעוד שבריכוזים גבוהים הג'ל המתקבל עשוי להיות צפוף מדי מכדי לאפשר חילופי חומרים מזינים מספקים וכדאיות התאים. הריכוז המתאים ידרוש אופטימיזציה לסוגי תאים שונים ואצוות פפטידים.

  1. הוסף את הפפטיד השקול לתוך הצינור של 15 מ"ל. החלק את סירת השקילה כדי להבטיח שלא תישאר אבקה מאחור.
    הערה: אבקת הפפטיד יכולה להיות סטטית מאוד, הקפד למזער את אובדן האבקה. אין צורך לשמור על תנאים סטריליים במהלך שלבים 1.2 ו-1.3 (או עבור מדידות pH כלשהן) מכיוון שעיקור מתרחש במהלך הדגירה ב-80 מעלות צלזיוס בהמשך התהליך.
  2. מערבולת למשך 3 דקות, ואז צנטריפוגה ב -200 x גרם למשך 3 דקות.
  3. מדגרים את תמיסת הפפטיד בתנור המוגדר ל-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. אם קיים פפטיד לא מומס לאחר הדגירה, חזור על שלב 1.4.
    הערה: מכיוון שחימום אחיד הוא חיוני, בלוק חום אינו מתאים לשלב זה. עם זאת, מצאנו שתנורי הכלאה עובדים היטב כמו אמבט מים כל עוד תמיסת הפפטיד שקועה במלואה.

2. היווצרות מבשרי ג'ל

  1. הכן תמיסת נתרן הידרוקסיד סטרילית 0.5 M (NaOH) באמצעות מים סטריליים.
    הערה: תמיסת NaOH מדוללת טרייה מומלצת לקבלת התוצאות העקביות ביותר.
  2. במכסה המנוע של תרבית רקמות, הוסיפו 0.5 M NaOH למרכז הפפטיד המומס וערבבו על ידי ערבוב איטי עם קצה הפיפטה (טבלה 1).
  3. מערבל את הצינור למשך 10 שניות וצנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 10 שניות כדי להסיר בועות.
  4. אם מבשר הג'ל מעונן, חזור על שלבים 2.2 ו-2.3, והוסף מרווחים של 5 מיקרוליטר של NaOH.
    הערה: מדידת pH יכולה לעזור לקבוע אם נוספה מספיק NaOH: ה-pH האופטימלי הוא בין 9-10.5 ועדיף לא לחרוג מכך מכיוון ששימוש בחומצות כדי להוריד את ה-pH בחזרה עלול לגרום לחוסר הומוגניות בג'ל. הנפח המדויק של NaOH הנדרש עשוי להשתנות בהתאם למקור הפפטיד.
  5. ברגע שמבשר הג'ל צלול אופטית ותומך בעצמו (או רק זורם) בהיפוך של צינור ה-15 מ"ל, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי פי 10 במכסה המנוע של תרבית רקמות. מערבולת למשך 10 שניות וצנטריפוגה ב -200 x גרם למשך 10 שניות.
    הערה: אם מבשר הג'ל מעונן, חזור על שלב 2.4 עד שהוא הופך צלול ומוצק למחצה. אם מבשר הג'ל נוזלי (מעל pH ~10.5), הוא לא ייצור ג'ל יציב ויש להשליך אותו.
  6. דוגרים לילה בתנור בחום של 80 מעלות.
  7. בדוק ויזואלית את קודמן הג'ל כדי לוודא שהוא נוזלי לחלוטין ב-80 מעלות צלזיוס.
    1. אם מבשר הג'ל אינו נוזלי לחלוטין ב-80 מעלות צלזיוס, הוא לא נוטרל מספיק, הוסף NaOH לאחר שלב 2.4.
    2. אם מבשר הג'ל נוזלי אך קיימות בועות אוויר או משקעים קטנים, החלק את הצינור בחדות כדי לפזר אותם. אם בועות אוויר או משקעים נמשכים לאחר החלקת הצינור, מערבל את מבשר הג'ל והצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 שניות כל אחד.
  8. לאחר ביצוע אחד משלבים 2.7.1 או 2.7.2, דגרו ג'לים קודמים למשך שעתיים נוספות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לפני שתמשיכו לג'לציה הסופית.
  9. שמור את קודמני הג'ל בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד הצורך (מקסימום 48 שעות).
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, לאחסן קודמני ג'ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 4 שבועות. אם מפעילים מחדש מנקודת הפסקה זו, יש לדגור על קודמני ג'ל בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות, ולהפעיל מחדש משלב 2.7. מומלץ בחום להכין מבשרי ג'ל זמן רב לפני שהם נחוצים לג'לציה הסופית, כדי להבטיח שיש מספיק זמן לשינויים הנ"ל במידת הצורך.

3. הכנת רכיבי מטריצה לזריעה

הערה: דוגמה לחישוב עבור שלבים 3-5 מוצגת באיור 1. ניתן להשמיט את שלב 3 ושלב 4 כדי לייצר ג'ל נטול מטריצה ו/או נטול תאים בהתאמה.

  1. חשב את הנפח המשולב הכולל של תאים, מטריצה ומדיה הנדרשים לזריעה, ואפשר להוסיף 250 מיקרוליטר לכל ג'ל מבשר של 1 מ"ל. הכפל אמצעי אחסון זה ב- 1.1 כדי לאפשר שגיאת פיפטינג. זהו נפח הזריעה, VS.
  2. עבור כל רכיב מטריצה, חשב את נפח תמיסת המלאי שתתווסף לנפח הזריעה באמצעות משוואה 1:
    figure-protocol-1 (1)
    הערה: VS תואם את הנפח הכולל של אמצעי הזריעה הנדרש לזריעת כל הג'לים (שלב 3.1). ודא שסכום כל נפחי רכיבי המטריצה אינו עולה על VS.
  3. הפשירו היטב את כל רכיבי המטריצה (עיינו בהוראות היצרן) ואחסנו על קרח עד הצורך.
    הערה: חלק מרכיבי המטריצה יהיו מועדים מאוד לג'לציה. עיין בהוראות היצרן כדי למנוע זאת.
  4. אם יש להוסיף תמיסת מלאי קולגן חומצית הדורשת נטרול (עיין בהוראות היצרן), הכינו את תמיסת הנטרול באופן הבא:
    1. חשב את נפח תמיסת מלאי הקולגן, VC, הנדרשת באמצעות משוואה 1.
    2. קבע נפח מתאים לתמיסת הנטרול, VN. יש לבחור זאת כך שהנפח המשולב של כל תוספות המטריצה לא יעלה על נפח הזריעה, VS.
      הערה: בדרך כלל, ערך הגיוני עבור VN = 2 x Vc, אך ניתן להתאים זאת בהתאם למספר ולנפח של רכיבי מטריצה אחרים שיש להוסיף.
    3. חשב את הנפח של 1 M NaOH הנדרש לנטרול באמצעות משוואה 2.
      figure-protocol-2 (2)
    4. חשב את הנפח של 10x PBS הנדרש בפתרון הנטרול באמצעות משוואה 3.
      figure-protocol-3 (3)
    5. שלב את הנפחים המחושבים של 1 M NaOH ו-10x PBS, ואז השלם עד VN עם מים סטריליים. מערבבים היטב ושומרים על קרח עד הצורך.
      הערה: אין להוסיף את הקולגן החומצי בשלב זה. ערבוב מוקדם של הקולגן עם תמיסת הנטרול יוביל להתחלת פיברילוגנזה של קולגן, מה שעלול לגרום לחוסר עקביות בתכונות ג'ל הפפטיד הסופי.

4. הכנת תאים לזריעה

  1. אם עדיין לא הושלם, חשב את נפח הזריעה, VS לפי שלב 3.1.
  2. חשב את צפיפות התאים הנדרשת בתרחיף תא זה, על ידי לקיחת צפיפות התאים הרצויה בג'ל הפפטיד הסופי והכפלה ב-5.
    הערה: תרחיף התאים הוא פי 5 מריכוז הקצה הרצוי כדי להסביר דילול בעת ערבוב עם מבשר הג'ל. יש לייעל את צפיפות התאים עבור כל קו תאים חדש הנבדק. בהתאם לסוג התא, צפיפויות בין 1 x 104 ל-1 x 106 תאים/מ"ל בג'ל הפפטיד הסופי עשויות להיות מתאימות.
  3. חשב את המספר הכולל של התאים הדרושים לזריעה (הכפל את צפיפות התאים בנפח הזריעה VS המחושב בשלב 4.1.).
  4. באמצעות שיטות תרבית/מעבר סטנדרטיות לתאים בשימוש, הכינו כדור תא המכיל את כמות התאים הנדרשת כפי שחושב בשלב 4.3.

5. ג'לציה/אנקפסולציה סופית של תאים

  1. כאשר מוכנים להתחיל בג'לציה הסופית, העבירו את קודמני הג'ל מהתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: קודמני הג'ל צריכים להיות תומכים בעצמם ב-37 מעלות צלזיוס. אם הם נוזליים, אין זה סביר שתתרחש ג'לציה מלאה, ויש להשליך את מבשרי הג'ל.
  2. הכינו צלחת 96 בארות, או לחילופין צלחת 24 באר (או דומה) עם תוספות תרבית תאים.
    הערה: ודא שיש פער בין בסיס התוספת לצלחת הבאר בעת ציפוי ג'ל פפטיד ב-24 תוספות באר. זה מבטיח שהג'ל נמצא במגע עם מדיה.
  3. אם יש להוסיף מטריצה, שלב את כל רכיבי המטריצה ופתרונות הנטרול (שלב 3). הכינו עד VS (שלב 3.1) באמצעות מדיום תרבית תאים וערבבו היטב. אם יש להוסיף תאים, השעו מחדש את כדור התא שהוכן בשלב 4 באמצעות נפח הזריעה VS.
    הערה: אם לא הוכנו רכיבי מטריצה בשלב 3, השתמש במדיום תרבית התאים לנפח הזריעה. זהו בדרך כלל מדיום התרבות הסטנדרטי לסוג התא בשימוש, אם כי ייתכן שיהיה צורך לאמת זאת אם נעשה שימוש בתערובת של סוגי תאים.
  4. בעזרת פיפטה P1000, מוסיפים 250 מיקרוליטר מתערובת התאים/מטריצה בעדינות על גבי מבשר הג'ל.
    הערה: רכיבי מטריצה, במיוחד תמצית קרום הבסיס, עשויים להתחיל להתפלמר לאחר הוספתם למבשר הג'ל. לכן, חשוב לעבור לשלב הבא במהירות האפשרית.
  5. מערבבים בעדינות על ידי פעולה משולבת של פיפטינג וערבוב. הג'ל מדלל גזירה ולכן יהיה קל יותר לערבב עם פיפטינג/ערבוב עדין. כאשר מערבבים היטב, מוסיפים 100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת 96 בארות, או 200 מיקרוליטר לכל תוספת תרבית תאים.
    הערה: בעת ערבוב, פיפטינג הפוך באמצעות סט P1000 ב-200 מיקרוליטר יכול להועיל כדי למנוע הכנסת בועות אוויר. הג'ל עשוי להיות קשה לערבוב בתחילה, אך בהמשך הערבוב אמור להיות קל יותר - זה מצביע על כך שהערבוב יעיל.
  6. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 ואווירה לחה.
    הערה: שלב זה אינו הכרחי אם ג'ל הפפטיד אינו מכיל תוספות מטריצה.
  7. הוסף 200 מיקרוליטר מדיה לכל באר של צלחת 96 הבארות, או 1 מ"ל לחלק החיצוני של תוספת תרבית התאים עם כמה טיפות על החלק העליון של הג'ל. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 ואווירה לחה.
  8. החלף מדיה פעמיים במהלך השעה הקרובה, ושוב לאחר מספר שעות (או למחרת).
    הערה: היזהר כאן מכיוון שהג'לים יהיו לא יציבים במשך מספר שעות.
  9. החלף מדיה כל 2-3 ימים (או לפי פרוטוקול תרבית סטנדרטי לתאים בשימוש).

6. תרבות משותפת עקיפה

הערה: שיטה זו ישימה רק כאשר ג'לי הפפטיד נזרעים לתוך 24 תוספות צלחת באר, או פורמטים דומים שבהם ניתן לתמוך בג'ל מעל חד-שכבת תא. ניתן להכניס תרבית משותפת עקיפה במקרה זה על ידי הכנת שכבת הזנה דו-ממדית של תאים בתחתית צלחת הבאר.

  1. הכינו צלחת 24 באר לזריעה. זו צריכה להיות צלחת נפרדת לג'ל הפפטיד אך צריכה להיות מאותו מותג כדי להבטיח תאימות לתוספות המשמשות (ראה שלב 5.2).
  2. חשב את צפיפות התאים הדרושה לזריעת התרבות המשותפת העקיפה, בהתאם לסוג התא הנבדק.
    הערה: יש למטב את צפיפות זריעת התאים עבור כל שורת תאים חדשה הנבחנת. יש לצבוע תאים כך שייתנו מפגש של כ-30-50%. כדוגמה, קו תאי הפיברובלסטים של החלב האנושי HMFU19 מצופה בדרך כלל בצפיפות של 1-5 x 104 תאים לבאר.
  3. באמצעות שיטות תרבית/מעבר סטנדרטיות לתאים הנמצאים בשימוש, הכינו תרחיף תאים המתאים לזריעה ב-1 מ"ל/באר, תוך שימוש במצע הגידול האופייני לתאים אלה.
  4. זרע את תרחיף התאים לצלחת הבאר, 1 מ"ל לבאר.
  5. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 ואטמוספירה לחה להיצמדות למספר שעות, או למשך הלילה. ואז הסר את המדיום מהבארות.
  6. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את 24 תוספות צלחת הבאר המכילות את ג'לי הפפטיד לבארות החדשות המכילות את התאים שנזרעו מראש בדו-ממד. הוסף 1 מ"ל של טיפה בינונית לחלק החיצוני של התוספת וכמה טיפות על פני הג'ל.
    הערה: בדרך כלל, המדיום המשמש בשלב זה הוא זה המתאים לתאים העטופים בג'ל, אך התאמתו של מדיום זה לתאים בדו-ממד עשויה להזדקק לאימות או אופטימיזציה עבור הניסוי הספציפי הנבדק.
  7. הכינו באופן קבוע שכבות הזנה טריות כדי למנוע מפגש יתר, והעבירו ג'לים פפטידים לבארות החדשות הללו באותה שיטה כמו לעיל.
    הערה: בדרך כלל, תאים לתרבית משותפת עקיפה מוכנים במקביל לזריעת ג'ל הפפטיד. לאחר מכן ניתן להעביר ג'ל פפטיד לתרבית משותפת בנקודת שינוי המדיה לאחר מספר שעות או דגירה של לילה, ראה שלב 5.8.

7. ריאולוגיה תנודתית בתפזורת של ג'לים פפטידים

הערה: כסטנדרט, אפיון ריאולוגי מתבצע 24 שעות לאחר זריעת ג'ל, שאמורה להתרחש ב-24 תוספות צלחת באר.

  1. הגדר וכייל את הריאומטר בהתאם להוראות היצרן. השתמש בגיאומטריית צלחת מקבילה עם קוטר צלחת קרוב ככל האפשר לקוטר הכנסת תרבית התאים.
    הערה: ניתן לבצע בדיקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס אם תרצה, תוך שכפול הסביבה במהלך התרבית.
  2. הסר את דגימת הג'ל הפפטיד הראשונה שתיבדק מתוספת תרבית התאים על ידי היפוך התוספת וחיתוך קרום הפלסטיק באמצעות אזמל.
    הערה: ודא שהצלחת המכילה את ג'לי הפפטיד נמצאת מחוץ לחממת תרבית התאים לזמן קצר ככל האפשר לפני הבדיקה. מדיה עם מערכת חציצה ביקרבונט מסתמכת על נוכחות של CO2 כדי לשמור על pH. ג'לים ששהו מחוץ לחממה זמן רב מדי ייסחפו ב-pH, מה שיכול להשפיע על ההערכה הריאולוגית. זה יכול להיות מועיל לתחזק את הג'לים עם 10 מ"מ HEPES שנוספו למדיה כדי למנוע השפעה זו.
  3. העבירו בזהירות את הג'ל לצלחת הריאומטר. לאחר מכן, בעזרת אזמל, חתוך את גובה הג'ל לכ-1 מ"מ כדי למזער את עיוות הג'ל כאשר הוא נטען מתחת לצלחת הריאומטר.
    הערה: היזהר לא לגעת או לפגוע בלוחית הריאומטר בעת השימוש באזמל.
  4. הגדר את מרווח הלוחות המקבילים ל-1 מ"מ. חתוך כל ג'ל עודף שאינו מכוסה על ידי לוחות הריאומטר.
  5. הפעל את הגדרות הבדיקה הרצויות על הריאומטר, בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: עבור כל מצב דגימה חדש, מומלץ להפעיל סריקת משרעת ממתח של 0.1-100% כדי להבטיח שכל הבדיקות מבוצעות ברמת מתח בתוך האזור הויסקו-אלסטי הליניארי של הדגימה.

8. צביעה חיה/מתה של תאים עטופים

  1. הסר את המדיום מהבארות, ושטוף ג'ל פפטיד פעמיים עם 1x PBS, באותה טכניקה כמו להחלפת מדיה (שלב 5.7).
  2. הסר ג'ל פפטיד שתורבת בתוספות צלחת 24 באר לפי שלב 7.2. שמור את הג'לים ב-1x PBS בצלחת הבאר המקורית עד שהם מוכנים להכתמה.
    הערה: היזהר מכיוון שהג'לים יכולים להיות שבירים בשלב זה, במיוחד לאחר תרבית ממושכת.
  3. הכן תמיסת צביעה חיה/מתה, המאפשרת צביעה של 500 מיקרוליטר לכל תוספת צלחת של 24 בארות, או 50 מיקרוליטר לכל באר של צלחת של 96 בארות. כתם אופייני הוא 4 מיקרומטר אתידיום הומודימר ו-2 מיקרומטר קלצאין AM ב-1x PBS. הגן על התמיסה המתקבלת מפני אור.
    הערה: ריכוזים של ריאגנטים חיים/מתים עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת בהתאם לסוג התא המשמש וספק הריאגנטים.
  4. הסר בזהירות PBS מכל ג'ל והחלף בכמה טיפות מתמיסת הצביעה, וודא שכל ג'ל מכוסה היטב.
  5. דגרו ג'לים בתמיסת הצביעה בחושך למשך 10-15 דקות, ולאחר מכן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי/פלואורסצנטי.
    הערה: לתמונות באיכות גבוהה יותר, זה יכול להיות מועיל להעביר את הג'לים לצלחות עם תחתית זכוכית בעובי כיסוי.

9. קיבוע ג'ל פפטיד להדמיית נקודת קצה

  1. שטפו ג'ל פפטידים לפי שלב 8.1.
  2. הוסף 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x PBS: 100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת 96 באר ו-1 מ"ל לכל ג'ל בתוספת צלחת של 24 באר (יש להוסיף כמה טיפות על גבי הג'ל בתוך התוספת).
    אזהרה: פרפורמלדהיד (PFA) רעיל מאוד ונספג בקלות דרך העור. זה הרסני ביותר לעור, לעיניים, לריריות ולדרכי הנשימה העליונות. יש לטפל ב-PFA במכסה אדים והמשתמשים צריכים ללבוש ביגוד מגן וכפפות. ניתן להשתמש בקיבוע כימי חלופי באותו אופן בהתאם ליישום הסופי.
  3. דגירה של ג'לי פפטיד בקיבוע PFA למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את מקבע ה-PFA ושטוף ג'ל פפטיד פעמיים עם 1x PBS.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, לאחסן ג'לים פפטידים קבועים ב-4 מעלות צלזיוס ב-1x PBS למשך עד 4 שבועות, וודא שהצלחת אטומה היטב עם סרט פרפין.

10. הטמעת ג'לים פפטידים לחיתוך

הערה: הטמעת ג'ל פפטיד באגר 4% היא צעד מכריע לפני הטמעת פרפין לאימונוהיסטוכימיה. לחלופין, ניתן להטמיע ג'לים באגר 2% ולחתוך אותם באמצעות ויברטום (בדרך כלל קטעים של 500 מיקרומטר נותנים תוצאות טובות). זהו שלב אופציונלי, הפקת קטעי ג'ל מיובשים שיכולים להועיל לצביעה של לוקליזציה של מטריצה חוץ-תאית בג'ל, תוך שימוש בשיטות בסעיף 11.

  1. הכינו תמיסת אגר מותכת של 2% או 4% ב-1x PBS (ראו הערה למעלה), על ידי רתיחה במיקרוגל. מניחים להתקרר מספר דקות לפני השימוש.
    הערה: אגר מותך מהווה סכנת חום - טפל בזהירות באמצעות הגנה על הידיים והפנים. לאחר ההכנה, ניתן לאחסן את תמיסת האגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
  2. הסר ג'ל פפטיד מתוספת תרבית התאים לפי שלב 7.2.
  3. בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק מכסים את בסיס תבנית הטבעה היסטולוגית בשכבה דקה של תמיסת אגר. מניחים להתקרר בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך מספר שניות.
  4. בעזרת מרית מניחים את ג'ל הפפטיד במרכז האגר. לאחר מכן מכסים לחלוטין את ג'ל הפפטיד באגר.
    הערה: הג'ל לא אמור לשקוע באגר. אם כן, הסר את הג'ל והמתן עוד כמה שניות עד שהאגר יתמצק יותר ונסה שוב. נסו לא לתת להתמצקות רבה מדי להתרחש אחרת יהיה חיבור חלש בין שתי השכבות.
  5. הניחו לג'ל המוטבע להתקרר למשך שעה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הוצאתם מהתבנית ההיסטולוגית.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, לאחסן ג'לים משובצים ב-4 מעלות צלזיוס ב-1x PBS למשך עד 4 שבועות.
  6. אם יש לבצע אימונוהיסטוכימיה, הכניסו ג'לים משובצים למעבד רקמות, והמשיכו בשיטות מעבדה סטנדרטיות.
    הערה: לחלופין, ניתן לחתוך ג'לים משובצים לחלקים מיובשים באמצעות ויברטום. יש לאחסן חלקים מיובשים בצלחות אטומות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-1x PBS למשך עד 4 שבועות.

11. צביעת תאים בג'לים באמצעות אימונוציטוכימיה

  1. הסר את ה-PBS 1x המכסה את חלקי הג'ל/ג'ל הפפטידים. הסר את כל הג'לים שעדיין נמצאים ב-24 תוספות צלחת באר לאחר שלב 7.2.
  2. מכסים את חלקי הג'ל/ג'ל במאגר חוסם ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
    הערה: מאגר חסימה טיפוסי מורכב מ-0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-1x PBS עם 0.1% Triton X-100. Triton X-100 רעיל וגורם לנזק חמור לעיניים, גירוי בעור והוא רעיל מאוד לבעלי החיים הימיים. על המשתמשים ללבוש ביגוד מגן, מגן עיניים וכפפות.
  3. הכן נוגדנים ראשוניים במאגר חוסם בריכוזי עבודה אופטימליים. אפשר 200 מיקרוליטר לכל ג'ל צלחת 24 בארות, 100 מיקרוליטר לכל קטע ג'ל ו-50 מיקרוליטר לכל צלחת 96 באר.
    הערה: בדרך כלל, ריכוזי הנוגדנים המשמשים לצביעה תלת מימדית בג'לים צריכים להיות כפולים מהריכוז המשמש בדו-ממד.
  4. הסר את המאגר החוסם והוסף תמיסת נוגדנים לג'לים בטיפה.
  5. אוטמים את הצלחת בניילון פרפין ודוגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. יש להסיר את תמיסת הנוגדנים ולשטוף פעמיים עם חוצץ חוסם.
  7. הוסף נוגדן משני בהתאם לאותם הליכים המתוארים בשלבים 11.3 ו-11.4.
  8. יש לדגור בחושך למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, או למשך 3 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
  9. יש להסיר את תמיסת הנוגדנים ולשטוף פעמיים עם PBS 1x.
  10. מכסים דגימות בתמיסת DAPI של 1:1,000 ודוגרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה.
  11. העבירו את הג'ל לכיסוי זכוכית והדמינו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית/קונפוקלית.

12. מיצוי RNA

הערה: הנפחים המשמשים בשיטה זו ישימים כאשר ג'לי הפפטיד נזרעים לתוך תוספות צלחת של 24 בארות. ניתן להשתמש בפורמטים אחרים של ג'ל, ולהתאים את הנפחים בהתאם.

  1. הסר את המדיום מהבארות, ושטוף ג'ל פפטיד פעמיים עם 1x PBS, באותה טכניקה כמו להחלפת מדיה (שלב 5.7).
  2. הסר ג'ל פפטיד שתורבת בתוספות צלחת 24 באר לפי שלב 7.2. מניחים כל ג'ל בצינור צנטריפוגה נפרד של 15 מ"ל.
    הערה: היזהר מכיוון שהג'לים יכולים להיות שבירים בשלב זה, במיוחד לאחר תרבית ממושכת.
  3. בעזרת P1000, הוסף 500 מיקרוליטר טריפסין-EDTA (0.25%) לכל צינור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב, ושבש את הג'ל.
  4. דגרו ג'לים בטריפסין-EDTA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
    הערה: זמני הדגירה עשויים לדרוש אופטימיזציה בהתאם לסוג התא בו נעשה שימוש.
  5. הוסף 5 מ"ל של 1x PBS כדי לדלל את ה-Trypsin-EDTA.
  6. צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות לתאי גלולה.
  7. הסר את ה-supernatant.
    הערה: היזהר מכיוון ששכבת ג'ל עלולה להיווצר בין כדורית התא לסופרנטנט.
  8. השעו מחדש את כדור התא במאגר ליזה, בהתאם להוראות היצרן, והמשיכו לפי הפרוטוקולים הסטנדרטיים למיצוי RNA.

תוצאות

שיטת ייצור ג'ל הפפטיד המתוארת כאן מאפשרת למשתמש להגדיר וליצור סביבת תרבות תלת מימדית בהתאמה אישית. בעוד שהסביבה המכנית נקבעת בעיקר על ידי ריכוז הפפטידים, ניתן להוסיף רכיבי מטריצה מעניינים גם בצפיפות מבוקרת, כפי שמוצג בחישוב הדוגמה באיור 1. עם זאת, בצורתו הפשוטה ביותר, פרוטוקול ג'ל הפפטיד מספק שיטה לעטיפת תאים בסביבה תלת מימדית נטולת מטריצות. איור 2 מראה כיצד ניתן לשלב גישה זו עם מגוון רחב של מודלים של סרטן, כולל קווי תאים סרטניים המסומנים באופן פלואורסצנטי (איור 2A) וחומר קסנוגרפט שמקורו בחולה (PDX) (איור 2B,C). חשוב לציין, קווי תאים וחומר PDX עשויים להיות מתורבתים בתוך הג'לים בתנאים נטולי סרום (איור 2C,D), ומספקים מערכת תרבית תלת-ממדית עם הרכב מוגדר במלואו.

מכיוון שהפפטיד עצמו אינו מכיל מוטיבים של קשירת תאים, תאים עטופים מציגים בדרך כלל מורפולוגיה מעוגלת בג'לים הפפטידים הלא מותאמים. איור 3A מדגים זאת עבור פיברובלסטים של חלב אנושי בג'ל פפטיד של 6 מ"ג/מ"ל, בהשוואה למורפולוגיה המוארכת הקלאסית שלהם הנראית במטריג'ל טהור ובג'ל קולגן טהור. עם זאת, חשוב לציין שפרוטוקול ג'ל הפפטיד מאפשר שילוב של רכיבי מטריצה מעניינים. איור 3A מדגים כיצד תוספת של 200 מיקרוגרם/מ"ל קולגן I יכולה לשחזר את המורפולוגיה הפיברובלסטים המוארכים בג'לים הפפטידיים.

תוספות מטריצה יכולות גם לתמוך בצמיחה ובארגון של סוגי תאים אחרים, למשל MCF10A, כפי שמוצג באיור 3B. במקרה זה, תוספת של 100 מיקרוגרם/מ"ל קולגן I לג'ל פפטיד של 6 מ"ג/מ"ל מאפשרת היווצרות מבנים אצינאריים עד היום השביעי. מורכבות נוספת עשויה להיווצר גם על ידי שילוב של שכבת תאים תומכת בתרבית משותפת עקיפה. איור 3C מדגים כיצד הגישה המשולבת של שילוב מטריצה ותרבות משותפת עקיפה עם פיברובלסטים של חלב אנושי יכולה לשפר את הצמיחה והארגון של MCF10A.

פרמטר חשוב נוסף הוא ריכוז הפפטיד המשמש לייצור ג'ל פפטיד. איור 4A מראה דוגמה לאופן שבו שליטה בריכוז הפפטידים, במקרה הזה בין 4 ל-10 מ"ג/מ"ל, מביאה לנוקשות שנעה בין 100 ל-1000 שניות של Pa. ג'לים אלה עשויים להיות מיוצרים ללא מטריצה או שניתן ליצור אותם עם תוספות מטריצה כדי לאפשר שליטה בו זמנית הן על הנוקשות והן על ההרכב. ג'לים פפטידיים עם תוספות מטריצה עשויים להיות חתוכים ומוכתמים כדי לאפשר הדמיה של התפלגות התוספות הללו. איור 4B, C מציג שתי גישות לעשות זאת: הטמעה באגר 4% ואחריו עיבוד רקמות סטנדרטי והטמעת פרפין לאימונוהיסטוכימיה (איור 4B) או הטמעה באגר 2% ואחריו חתך ויברטום וצביעה פלואורסצנטית (איור 4C).

בעת שינוי הרכב הג'לים הפפטידיים, חיוני לוודא ששינויים אלה לא ישפיעו על הסביבה המכנית שהוצגה בתחילה לתאים. איור 4D מדגים כיצד ניתן להשתמש בשינויים בריכוז הפפטיד כדי לקזז כל שינוי בקשיחות ג'ל הפפטיד בשילוב המטריצה. מדידות ריאולוגיה תנודתיות בתפזורת של קשיחות ג'ל (מודול אחסון, G') יכולות להבחין בין ההשפעות של הרכב הג'ל והנוקשות על מורפולוגיה של התא. כפי שמוצג בתמונות השדה הבהיר, תאי MDA MB 231 מפתחים מורפולוגיה מוארכת בתוספת קולגן לג'ל פפטיד של 10 מ"ג/מ"ל או 15 מ"ג/מ"ל. איור 4E מראה כי תאים מוארכים אלה צובעים חיובי עבור pFAK, מה שמעיד על אינטראקציה עם המטריצה הסובבת אותם. הסביבה נטולת המטריצה בתחילה של ג'לי הפפטיד הופכת אותם גם לפלטפורמה אידיאלית לחקר סינתזה תאית ושקיעה של רכיבי מטריצה מעניינים. איור 4F מציג את התצהיר המקומי של קולגן I על ידי תאי MCF7 עטופים בג'ל פפטיד של 10 מ"ג/מ"ל.

אחד היתרונות המרכזיים של ג'לי הפפטיד הוא הקלות שבה ניתן ליישם שיטות מעבדה סטנדרטיות לניתוחם. ניתן לחלץ חומר עבור qRT-PCR כדי לקבוע פרופילי ביטוי גנים (כפי שמוצג בפרסום האחרון שלנו5). הדמיה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר מאפשרת בנוסף הדמיה בזמן אמת של צמיחת התאים. איור 5 מציג כמה מבעיות פתרון הבעיות האופייניות שעלולות להיתקל בג'ל פפטיד לא מוצלח: ערבוב לא שלם של קודמן הג'ל (איור 5A,B); אופטימיזציה שגויה של ריכוז הפפטידים (איור 5C,D) או צפיפות הזריעה (איור 5E,F); ונטרול שגוי של קולגן חומצי לפני שילובו בג'ל הפפטיד (איור 5G,H). ריכוז הפפטידים וצפיפות הזריעה, בפרט, חייבים להיות אופטימליים עבור כל קו תאים ומקור פפטיד, כדי להבטיח שסביבת התרבית מוגדרת כראוי, ומייצגת את היישום המעניין.

figure-results-1
איור 1: חישוב לדוגמה עבור הרכב המטריצה וצפיפות הזריעה. זרימת עבודה לדוגמה זו מתארת את ההליך שיבוצע כדי לזרוע שני קודמני ג'ל פפטיד עם תוספות של 100 מיקרוגרם/מ"ל קולגן, בצפיפות תאים סופית של 1 x 105 תאים/מ"ל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ג'לים פפטידים נטולי מטריצה מספקים פלטפורמת תרבית תלת-ממדית מתאימה עבור קו תאים ומודלים של סרטן שמקורם בחולה. (A) קווי תאי סרטן המעי הגס HCT116 וסרטן השד MCF7, המבטאים באופן מכונן את הסמנים הפלואורסצנטיים mCherry ו-tdTomato בהתאמה, יוצרים אשכולות תאים בג'לים של 6 מ"ג/מ"ל עד היום התשיעי (משמאל), וניתן לצלם אותם בשידור חי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (מימין, סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר); (B) תאי קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה סרטן שד טריפל נגטיב (BR8) יוצרים אשכולות תאים עד היום השביעי בג'ל פפטיד של 10 מ"ג/מ"ל; (C) ניתן לגדל תאי PDX מגידולי שד חיוביים לקולטן אסטרוגן (BB3RC31) בתנאים נטולי סרום18, המוצגים עם בקרת מטריצת קרום הבסיס (למשל Matrigel) במעבר תואם להשוואה; (D) תאי סרטן שד MCF7 ברי קיימא בג'ל פפטיד של 6 מ"ג/מ"ל בתנאים נטולי מטריצה וללא סרום, כפי שהוערך באמצעות בדיקת תאים חיים/מתים ביום השביעי. KSR = תחליף סרום נוק-אאוט, MS בינוני = ממוספרה בינונית19. סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר אלא אם צוין אחרת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מורכבות ג'ל פפטיד עשויה להיות מוגברת על ידי הכנסת תוספות מטריצה ותרבית משותפת. (A) קו תאי פיברובלסטים של חלב אנושי HMFU19 דורש תוספות קולגן כדי לשחזר מורפולוגיה מוארכת בג'ל פפטיד של 6 מ"ג/מ"ל, המוצג עם מטריצת ממברנת בסיס טהורה (למשל Matrigel) ו-1.5 מ"ג/מ"ל קולגן זנב חולדה I ג'ל להשוואה, סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר; (B) תאי שד רגילים MCF10A יוצרים מבנים אצינאריים ביום 7 בג'ל פפטיד של 6 מ"ג/מ"ל בתוספת של 100 מיקרוגרם/מ"ל קולגן אנושי I, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר; (C) תוספת משולבת של רכיבי מטריצה פיברונקטין/HA (חומצה היאלורונית, משקל מולקולרי 804 kDa) ו-HMFU19 בתרבית משותפת עקיפה מגדילה את הגודל והארגון של MCF10A acini בג'ל פפטיד של 10 מ"ג/מ"ל כפי שהוערך על ידי צביעת קספאז 3 שסועה, סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4 : ג'ל פפטיד מאפשר בקרה עצמאית על קשיחות והרכב, והערכה של מטריצה מופקדת בתא. (A) מדידות ריאולוגיה בתפזורת המדגימות טווח קשיחות טיפוסי (מודול אחסון, G') שניתן להשיג על ידי בקרה על ריכוז הפפטיד, * מציין p < 0.05; (B) אימונוהיסטוכימיה שמראה צביעה של 150 מיקרוגרם/מ"ל קולגן I בג'ל פפטיד של 10 מ"ג/מ"ל עם MCF7 עטוף (יום 7, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר); (C) אימונופלואורסצנציה של התפלגות קולגן I בג'ל פפטיד של 6 מ"ג/מ"ל עם 200 מיקרוגרם/מ"ל קולגן אנושי I, על ידי הטמעת אגר וחתך ויברטום, סרגל קנה מידה 25 מיקרומטר; (D) תוספת של 200 מיקרוגרם/מ"ל קולגן I נותנת ירידה מתונה במודול האחסון, G', של ג'ל פפטיד של 10 מ"ג/מ"ל (ריאולוגיה תנודתית בתפזורת), המתקזזת על ידי הגדלת ריכוז הפפטידים ל-15 מ"ג/מ"ל. תאי סרטן שד טריפל נגטיב MDA MB 231 מוצגים בכל מצב (יום 7, סרגל סולם 50 מיקרומטר); (E) MDA MB 231 בג'ל פפטיד של 15 מ"ג/מ"ל עם קולגן אנושי של 200 מיקרוגרם/מ"ל I מראה התארכות ואינטראקציה עם המטריצה באמצעות צביעת pFAK (יום 14, סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר); (F) צביעה במקום של קולגן MCF7 I משקע בג'ל פפטיד 10 מ"ג/מ"ל נטול מטריצה בהתחלה (יום 10, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5 : בעיות נפוצות בפתרון בעיות ג'ל פפטיד עשויות להיפתר באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר. התאים המוצגים הם תאי אפיתל שד תקינים MCF10A, ביום 7 אלא אם צוין אחרת. (A) קודמן ג'ל מעורבב כהלכה צריך להיות שקוף אופטית ללא חוסר עקביות, בעוד (B) ערבוב/נטרול לא מספיק יכול לגרום לחוסר הומוגניות/פסים גלויים בג'ל הפפטיד (חיצים לבנים); (C) MCF10A יוצר מבנים אצינאריים בג'ל פפטיד של 6 מ"ג/מ"ל בתוספת של תרבית משותפת עקיפה HMFU19, אולם (D) ב-15 מ"ג/מ"ל ריכוז הפפטיד גבוה מכדי לאפשר היווצרות אצינארית; (E) MCF10A שנזרע ב-5 x 105 תאים/מ"ל יוצר מבנים אצינאריים בג'ל של 6 מ"ג/מ"ל בתוספת של 100 מיקרוגרם/מ"ל קולגן I, אולם (F) בצפיפות תאים של 2 x 105 תאים/מ"ל נמוכה מכדי לאפשר היווצרות אצינארית; (G) תוספות קולגן יכולות לייצר אשכולות תאים גדולים עד היום ה-14, אולם (H) הוספה לא נכונה (נטרול קולגן מוקדם מדי בתהליך) יכולה למנוע צמיחת אשכולות. סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

מצאנו שג'לי הפפטיד המתוארים כאן הם פתרון פשוט, חסכוני וגמיש לתמיכה בתרבית תלת-ממדית של סוגי תאים מרובים. על ידי מתן שליטה מלאה על ריכוז הפפטיד המשמש ותוספות החלבון או הגליקן שנעשו, שיטה זו מאפשרת להתאים בקפידה את ג'לי הפפטיד ליישום שלהם.

היתרון המכריע של ג'לי הפפטיד על פני השיטות הקיימות הוא שניתן לשלוט בהרכב המטריצה ובתכונות המכניות באופן עצמאי, בשיטה פשוטה שאינה דורשת הליכים כימיים מורכבים. התכונות המכניות של ג'ל הפפטיד נקבעות בעיקר על ידי ריכוז הפפטיד במבשר הג'ל הראשוני. הוספה עוקבת של תאים ו/או רכיבי מטריצה מאפשרת יצירת סביבת מבחנה מוגדרת במלואה על ידי המשתמש. למרות שתוספות מטריצה עשויות לשנות את התכונות המכניות הראשוניות של הג'ל, ניתן לקזז זאת בקלות על ידי וריאציה בלתי תלויה של ריכוז הפפטיד5. זה מספק יתרון מוחשי על פני מערכות קיימות, למשל ג'ל קולגן, שבהן פרמטרים השולטים בנוקשות גורמים בדרך כלל גם לשינוי במוטיבים של קשירת אינטגרין20,21.

הדגמנו את היישום של ג'ל הפפטיד לתרבית חוץ גופית של קווי תאים סרטניים וחומר שמקורו בחולה5. טווח הנוקשות הנגיש עם ג'ל הפפטיד (בטווח של 100 עד 1000 שניות של Pa) מתאים באופן אידיאלי לשכפול סביבות נורמליות ומטריצת גידול ברקמות רכות כגון השד. עם זאת, אנו מכירים בכך שיישומים אחרים דורשים סביבות נוקשות הרבה יותר, למשל בטווח של 10-20 kPa עבור התחדשות עצמות. יידרש שינוי נוסף של הפרוטוקול המוצג כאן כדי להרחיב את הנוקשות הניתנת להשגה לטווח זה, האופייני יותר לגישות אלטרנטיביות כגון ג'ל אלגינט22. באופן דומה, כאן תיארנו שיטה פשוטה לפונקציונליזציה על ידי לכידה פיזית של חלבוני מטריצה/גליקנים בתוך ג'ל הפפטיד. עבור היישומים המתוארים כאן, גישה זו עובדת היטב ומותאמת בקלות לשימוש על ידי קבוצות לא מומחיות המעוניינות להשתמש במודלים תלת מימדיים במבחנה של מחלות. כמו הידרוג'לים רבים אחרים11, ניתן להרחיב את הפפטיד המשמש כאן כך שיכלול קשירת תאים או מוטיבים ביולוגיים אחרים ועבור יישומים מסוימים גישה זו עשויה להיות עדיפה.

זיהינו כמה נקודות מפתח שדורשות תשומת לב קפדנית כדי להבטיח הצלחה. היווצרות מבשר הג'ל היא שלב ביניים קריטי המאפשר למשתמש לבדוק שהתנאים המשמשים נכונים לפני שילוב התאים. ניתן לאחסן קודמן זה במשך מספר שבועות (ב-4 מעלות צלזיוס) אך יש לדגור אותו ב-80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. קודמן מתאים יהיה נוזלי לחלוטין ב-80 מעלות צלזיוס, ותומך בעצמו ב-37 מעלות צלזיוס. בדיקות אלו חיוניות כדי להבטיח שהג'לציה תתרחש כהלכה. לאחר מכן ניתן לשלב תאים ו/או מטריצה בתנאים פיזיולוגיים.

מעבדות שכבר משתמשות במטריצות תלת מימד יכירו את הטיפול הזהיר הדרוש כדי לעטוף תאים בג'לים הפפטידיים. יש להקפיד להגביל את תסיסה של תאים לפני ובמהלך שלבי האנקפסולציה. מצאנו שסוגי תאים ספציפיים רגישים באופן דיפרנציאלי לנזק במהלך תהליך זה ויש להעריך זאת בקפידה על ידי המשתמש. ריכוזי ג'ל הפפטיד המתוארים כאן מאפשרים לג'לציה להתקדם במסגרת זמן אשר, עבור התאים שהוזכרו, מאפשרת לעטוף תאים לפני שהם שוקעים לתחתית באר היציקה אך לאט מספיק כדי שלא ייפגעו מתהליך זה. עם זאת, יש לציין כי סוגי תאים רגישים מסוימים עשויים לדרוש נטרול מהיר יותר כדי למנוע חשיפה ממושכת ל-pH מוגבר. במקרה זה, תוספת של 10 מ"מ HEPES למדיום המקיף את ג'ל הפפטיד יכולה להועיל.

כאשר מאמצים את השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, חשוב מאוד לשקול היטב את איכות מקור הפפטיד. במקום לשמש כמוטיב או ציפוי פונקציונלי, הפפטיד כאן הוא כל החלק הלא מסיס של ההידרוג'ל. לכן, כל מזהמים או וריאציה במבנה הפפטיד עשויים להשפיע באופן משמעותי על השלמות או היכולת לתמוך בכדאיות התא בהידרוג'ל הסופי. כאשר עוברים לאצווה חדשה של פפטיד, יש להקפיד על כך שיש עקביות טובה מאצווה לאצווה מהספק וכן לבדוק את התנהגות הפפטיד בעת יצירת מבשר הג'ל.

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבית תלת מימדית עם התמקדות מכרעת בבקרה עצמאית של תכונות מכניות וביולוגיות. הפשטות ויכולת ההתאמה של השיטה הופכות אותה למתאימה לאימוץ על ידי כל מעבדה לתרביות תאים, ולמגוון רחב של יישומים5. בעתיד, פרוטוקול זה עשוי להיות מורחב כדי לאפשר שינוי קוולנטי של רצף הפפטידים. ניתן לשלב זאת עם שיטות מיקרוסקופיה מתקדמות כדי לחקור את כוחות המתיחה המופעלים על ידי תאים על המטריצה הסובבת אותם. עם זאת, חשיבות מרכזית היא היכולת להבחין בין מטריצה המשולבת באופן מלאכותי, לבין מטריצה המסונתזת על ידי התאים העטופים עצמם. יכולת זו לשלוט ולנטר שינויים במטריצות לאורך זמן תאפשר תובנות חסרות תקדים לגבי התפקידים של אינטראקציות בין תא למטריצה בהתפתחות סרטן ומחלות אחרות.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות למימון מהמרכז הלאומי להחלפה, עידון והפחתה של בעלי חיים במחקר NC/N0015831/1 ל-JCA, GF ו-CLRM, NC/T001267/1 ל-RBC, CLRM, JCA, KL-S, ו-KS, NC/T001259/1 ל-JCA, KL-S ו-CLRM ו-NC/P002285/1 ל-AMG, SJ ו-CLRM. כמו כן מימון ממועצת המחקר להנדסה ומדעי הפיזיקה EP/R035563/1 ל-KL-S ו-CLRM ו-EP/N006615/1 ל-JLT ו-CLRM. איור 1 נוצר באמצעות גרפיקה מותאמת מ-Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier מורשה תחת רישיון Creative Commons Attribution 3.0 Unported.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<ייצור חזק>ג'ל - ריאגנטים
FEFEFKFKPepceuticals לא ישיםפוליפפטיד; זמין מספקים שונים. Pepceuticals הוא הספק המומלץ שלנו בשל איכות המוצר.
PBS 10Xגיבקו 70011-036
נתרן הידרוקסיד (1 מ')סיגמא-אולדריץ' S2770NaOH; לדלל ל-0.5 מ' לפני השימוש
WaterSigma-AldrichW3500
<חזק>ג'ל - ציוד וחומרים מתכלים
15 מ"ל צינורות בזGreiner 188261אם משתמשים במותג אחר, ודא שהחומר עומד בטמפרטורות של עד 90 מעלות; C
24 בארצלחת קורנינג קוסטאר 3524ניתן להשתמש במותגים/ספקים חלופיים כל עוד יש פער בין בסיס ההכנסה למשטח הצלחת
צנטריפוגהכל<חזקה>200 x גרם למשך 3 דקות
ארון בטיחות מיקרוביולוגי Class IIכל
איזון עדיןכלקריאות 0.1 מ"ג
תוספת תלויה לצלחת 24 בארMillipore MCRP24H48ניתן להשתמש במותגים/ספקים חלופיים כל עוד יש פער בין בסיס ההכנסה למשטח הצלחת
אינקובטורכל37° C, 5% CO2, סביבה לחה
תנורכלסט ל 80° C
P1000/200/20/10 פיפטהכלזה חיוני שהפיפטות המשמשות להליך מכוילות
P1000/200/20/10טיפים כל
מד pH עם מיקרו-בדיקהכל
מריתכל
/חזקה>
קולגן I (אנושי)טכנולוגיות תאי גזע 07005
קולגן I (זנב עכברוש)Gibco A10483
פיברונקטיןטכנולוגיות תאי גזע 07159
חומצה היאלורוניתאידורון HA804
מטריג'לקורנינג 354234
<חזק>אנקפסולציה/תרבית תאים
תוסף B27 (ללא חומצה רטינואית)Gibco 12587010תוספות מדיה לתרביות חופשיות בסרום (<חזק>איור 2D)
רעלן כולרהסיגמא-אולדריץ' C-8052תוספות מדיה לתאי MCF10A (<חזק>איור 3, 5)
DMEMGibco 21969-035
DMEM/F12Sigma-AldrichD8062תוספות מדיה לתאי MCF10A (<חזק>איור 3, 5)
DMEM/F12 פנול אדוםחופשי Gibco 21041-025תוספות מדיה לתרביות חופשיות בסרום (<חזק>איור 2D)
DPBSGibco 14190-094
מקור EGFBiosciences ABC016תוספות מדיה לתאי MCF10A (<חזק>איור 3, 5)
סרום בקר עובריGibco 10500-064
סרום סוסיםGibco 26050-070תוספות מדיה לתאי MCF10A (<חזק>איור 3, 5)
סרטן אנושי/קווילמשל MCF7/tdTomato MCF7/MCF10a/HCT116-mדובדבן
פיברובלסטיםלמשל HMFU19
הידרוקורטיזוןסיגמא-אולדריץ' H-0888תוספות מדיה לתאי MCF10A (<חזק>איור 3, 5)
אינסוליןסיגמא-אולדריץ' I9278תוספות מדיה לתאי MCF10A (<חזק>איור 3, 5)
החלפת סרום נוקאאוטGibco 10828-028תוספות מדיה לתרביות חופשיות בסרום (<חזק>איור 2D)
L-גלוטמיןGibco 25030-024
RPMIגיבקו 21875-034
<חזק>RPMI פנול אדום חופשי<חזק>סיגמא-אולדריץ'  <חזק>R7509
<חזק>הדמיה ובדיקות אחרות
4% פרפורמלדהידPolysciences 18814
אגרSLS 
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ' 5482
מיקרוסקופ קונפוקלי ו/או פלואורסצנטיכללמשל מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי Leica TCS SPE (<חזק>איורים 2-4)
תמיסת DAPIInvitrogen D3571300 uM פתרון עבודה
DPX הרכבה בינוניתכיסוי זכוכית ThermoFisher Scientific
מחליקכלכיסויים No1 בעובי 0.13 - 0.17 מ"מ
כלי תחתית זכוכיתMatTek
עז נגד ארנב IgG H& L (פולימר HRP)Abcam ab214880
המטוקסילין ואאוזיןכל
תבניות היסטולוגיה (חד פעמי, פלסטיק)כל
תוכנה לניתוח תמונהImageJ
ערכת בדיקה חיה/מתהInvitrogen L3224
מיקרוטוםכל
PhalloidinLife Technologies F432/R415
Pierce Peroxidase ערכת זיהוי IHCThermoFisher Scientific 36000
ראשי Ab Caspase 3Abcam ab34710מוצג ב<חזק> איור 3C
Primary Ab Collagen Iטכנולוגיית איתות תאי I 9661מוצג ב<חזק> איור 4B, C, F
ראשי Ab pFAK Tyr 397ThermoFisher Scientific 44-624Gמוצג ב<חזק>איור 4E
להאריך זהב/יהלום נגד דהייה עםבדיקות מולקולריות DAPI S36939
ריאומטר Physica MCR 301אזמל אנטון פאר
כל
נוגדן משני עז אנטי ארנב AF488nvitrogen a11034
נוגדן משני עז אנטי ארנב AF546Invitrogen a11010
SuperFrost שקופיותציפוי מדעילמשל APES יכול לעזור לשמור על קטעי מיקרוטום בשקופיות.
טריטון X 100סיגמא-אולדריץ' X100
טריפסין-EDTA (0.25%)Gibco 
VibratomeLeica
בייצור <חזק>תוספת מטריקס < תאי אפיתל של חלב אנושי CHE1070 של ThermoFisher 25300054

מקורות

  1. Hynes, R. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  2. Tian, C., et al. Cancer-cell-derived matrisome proteins promote metastasis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Research. 80 (7), 1461-1474 (2020).
  3. Hebert, J. D., et al. Proteomic profiling of the ECM of xenograft breast cancer metastases in different organs reveals distinct metastatic niches. Cancer Research. 80 (7), 1475-1485 (2020).
  4. Vennin, C., et al. CAF hierarchy driven by pancreatic cancer cell p53-status creates a pro-metastatic and chemoresistant environment via perlecan. Nature Communication. 10 (1), 3637(2019).
  5. Ashworth, J. C., et al. Peptide gels of fully-defined composition and mechanics for probing cell-cell and cell-matrix interactions in vitro. Matrix Biology. 85, 15-33 (2020).
  6. Toniatti, C., Jones, P., Graham, H., Pagliara, B., Draetta, G. Oncology drug discovery: Planning a turnaround. Cancer Discovery. 4 (4), 397-404 (2014).
  7. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  8. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5, 539-551 (2020).
  9. Onion, D., et al. 3-Dimensional patient-derived lung cancer assays reveal resistance to standards-of-care promoted by stromal cells but sensitivity to histone deacetylase inhibitors. Molecular Cancer Therapy. 15 (4), 753-763 (2016).
  10. Saunders, J. H., et al. Individual patient oesophageal cancer 3D models for tailored treatment. Oncotarget. 8 (15), 24224-24236 (2017).
  11. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  12. Kühn, S., et al. Cell-instructive multiphasic gel-in-gel materials. Advanced Functional Materials. 30, 1908857(2020).
  13. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  14. Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Synthesis and characterization of well- defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and organoid culture. Nature Protocols. 12 (11), 2263-2274 (2017).
  15. Saiani, A., et al. Self assembly and gelation properties of α-helix versus β-sheet forming peptides. Soft Matter. 5 (1), 193-202 (2008).
  16. Wan, S., et al. Self-assembling peptide hydrogel for intervertebral disc tissue engineering. Acta Biomaterialia. 46, 29-40 (2016).
  17. Blache, U., Stevens, M. M., Gentleman, E. Harnessing the secreted extracellular matrix to engineer tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 357-363 (2020).
  18. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  19. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  20. Barcus, C. E., Keely, P. J., Eliceiri, K. W., Schule, L. A. Stiff collagen matrices increase tumorigenic prolactin signaling in breast cancer cells. Journal of Biological Chemistry. 288, 12722-12732 (2013).
  21. Bax, D. V., et al. Impact of UV- and carbodiimide-based crosslinking on the Integrin-binding properties of collagen-based materials. Acta Biomaterialia. 100, 280(2019).
  22. Huang, B. P., et al. Multi-peptide presentation and hydrogel mechanics jointly enhance therapeutic duo-potential of entrapped stromal cells. Biomaterials. 245, 119973(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Blank Slate Hydrogel
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.