במאמר זה נתאר בידוד של תאי גזע שמקורם במקוק רזוס (ADSCs) באמצעות פרוטוקול עיכול רקמות אנזימטי. לאחר מכן, אנו מתארים התפשטות ADSC הכוללת ניתוק תאים, ספירה וציפוי. לבסוף, התמיינות ADSC מתוארת באמצעות סוכני גרימה אדיפוגניים ספציפיים. בנוסף, אנו מתארים טכניקות צביעה כדי לאשר את ההבחנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד, שגשוג והתמיינות של תאי גזע שמקורם בשומן מקוק רזוס
במאמר זה
סיכום
תקציר
רקמת השומן מספקת מקור עשיר ונגיש של תאי גזע רב-פוטנטיים, המסוגלים לחדש את עצמם. תאי גזע אלה שמקורם בשומן (ADSCs) מספקים מערכת תאי ex vivo עקבית הדומה מבחינה תפקודית לזו של אדיפוציטים in vivo. שימוש ב-ADSCs במחקר ביו-רפואי מאפשר חקירה תאית של ויסות ותפקוד מטבולי של רקמת השומן. התמיינות ADSC נחוצה להרחבת אדיפוציטים נאותה, והבחנה לא אופטימלית היא מנגנון מרכזי של תפקוד לקוי של השומן. הבנת השינויים בהתמיינות ADSC היא חיונית להבנת ההתפתחות של תפקוד מטבולי לקוי ומחלות. הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה, כאשר עוקבים אחריהם, יניבו אדיפוציטים בוגרים שיכולים לשמש למספר בדיקות פונקציונליות במבחנה כדי להעריך את תפקוד חילוף החומרים של ADSC, כולל אך לא מוגבל למבחנים המודדים ספיגת גלוקוז, ליפוליזה, ליפוגנזה והפרשה. קופי מקוק רזוס (Macaca mulatta) דומים מבחינה פיזיולוגית, אנטומית ואבולוציונית לבני אדם וככאלה, רקמותיהם והתאים שלהם שימשו רבות במחקר ביו-רפואי ולפיתוח טיפולים. כאן אנו מתארים בידוד ADSC באמצעות רקמת שומן תת עורית ואומנטלית טרייה המתקבלת מקופי רזוס בני 4-9. דגימות רקמת שומן מתעכלות באופן אנזימטי בקולגנאז ואחריו סינון וצנטריפוגה כדי לבודד ADSCs מהחלק הסטרומלי של כלי הדם. ADSCs מבודדים מתרבים במדיה סטרומלית ולאחר מכן כ-14-21 ימים של התמיינות באמצעות קוקטייל של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל דקסמתזון, 0.5 mM איזובוטיל מתיל-קסנטין, ו-50 μM אינדומתצין במדיה סטרומלית. אדיפוציטים בוגרים נצפים בכ -14 יום של התמיינות. בכתב יד זה אנו מתארים פרוטוקולים לבידוד, התפשטות והבחנה במבחנה של ADSC. אמנם, התמקדנו ב-ADSCs מרקמת השומן של מקוק רזוס, אך ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה לרקמת שומן המתקבלת מבעלי חיים אחרים עם התאמות מינימליות.
מבוא
רקמת השומן מורכבת מתערובת הטרוגנית של תאים, בעיקר אדיפוציטים בוגרים וחלק כלי דם סטרומלי הכולל פיברובלסטים, תאי חיסון ותאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs)1,2,3. ניתן לבודד ADSCs ראשוניים ישירות מרקמת השומן הלבן ולעורר אותם להתמיין לאדיפוציטים, סחוס או תאי עצם4. ADSCs מציגים מאפיינים קלאסיים של תאי גזע כגון תחזוקה של מולטיפוטנטיות במבחנה והתחדשות עצמית; ודבקים בפלסטיק בתרבות 5,6. ADSCs הם בעלי עניין חשוב לשימוש ברפואה רגנרטיבית בשל הרב-תכליתיות שלהם ויכולתם להיקצר בקלות בכמויות גדולות באמצעות טכניקות לא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הרקמות וההליכים שהתקבלו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת לואיזיאנה ובוצעו בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות (פרסום NIH מס '85-12, מתוקן 1996).
1. הכנת מאגרים ופתרונות
- הכינו תמיסת מי מלח סטרילית עם מאגר 5-פוספטים (5-PBS) על ידי הוספת 5% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפ) ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל של מעכב פטרייתי ל-PBS אחד. הכן תמיסת חיץ כביסה סטרילית של 2-PBS (2-PBS) על-ידי הוספת 2% עט/סטרפ ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל של מעכב פטרייתי ב-PBS אחד. ניתן לאחסן מאגרי כביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי ויש להשתמש בהם תוך 4 שבועות.
הערה: חיץ 5-PBS משמש לאיסוף רקמת שומן ושטיפה ראשונית כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ה-ADSCs שבודדו מדגימות רקמת השומן של קופי מקוק רזוס נזרעו על צלחות תרבית ומוצגות באיור 1. ביום הציפוי, התאים אינם דבקים וצפים בצלחת התרבית כפי שמוצג באיור 1A. תוך 72 שעות, ADSCs יהפכו למפגש של 80% ויהיו מוכנים להתמיינות אדיפוציטים (איור 1B). ADSCs מפגינים תכונות אדיפוגניות חזקות לאחר אינדוקציה כימית. לאחר 14 ימים של התמיינות ניתן לצפות באדיפוציטים בוגרים באמצעות מיקרוסקופיית אור (איור 2A). כדי לאשר התמי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקולי בידוד, התפשטות והתמיינות של ADSC הם ישרים וניתנים לשחזור, אך הם דורשים טכניקה זהירה כדי להבטיח בידוד הולם, התרחבות בריאה ובידול יעיל. סביבת עבודה סטרילית היא קריטית לכל הניסויים בתרביות תאים. חיידקים או פטריות עשויים להיות מוחדרים לתרביות תאים באמצעות כלים מזוהמים, מדיה או סביבת עבודה. זיהום פטרייתי מסומן על ידי צמיחת נבגים בתרבית, בעוד זיהום חיידקי מסומן על ידי נוכחות של עכירות של התקשורת. אנו מציעים לחטא את ארון הביו-בטיחות ואת כל הפיפטות, הבקבוקים והכלים לפני השימוש, להפעיל את זרימת האוויר הלמינרית לפחות 15 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
המחברים רוצים להודות לקרטיס ונדה סטווה על עזרתו הטכנית. המחקר שבבסיס הפיתוח של הפרוטוקולים נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול ואלכוהוליזם (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 ו- 1F31AA028459-01).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.4% טריפאן כחול | תרמו-פישר | 15250061 | |
| 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100% איזופרופנול | סיגמא-אולדריץ' | PX1838-P | |
| 100 מ"מ צלחת תרבית תאים | קורנינג | 430167 | |
| 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין | סיגמא-אולדריץ' | I7018 | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי מפלסטיק | פישר סיינטיפיק | 50-465-232 | |
| 70-& מסננת תאים m | קורנינג | CLS431751 | |
| a-MEM | תרמו-פישר | 12561056 | |
| רדיד אלומיניום | ריינולדס לעטוף | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| אלבומין סרום בקר (BSA) | סיגמא-אולדריץ' | 05470 | |
| צנטריפוגה | אפנדורף | 5810 R | |
| קולגנאז, סוג I | תרמו-פישר | 17100017 | |
| דקסמתזון-מסיס במים | סיגמא-אולדריץ | D2915 | |
| דימתיל סולפוקסיד, DMSO | סיגמא-אולדריץ' | D2650 | |
| מים מזוקקים | תרמו-פישר | 15230162 | |
| סרום בקר עוברי, מאושר על ידי USDA | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | תרמו-פישר | 15290018 | |
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) | תרמו-פישר | 14175095 | |
| המציטומטר עם החלקת כיסוי | סיגמא-אולדריץ | Z359629 | |
| אינדומתצין | סיגמא-אולדריץ' | I7378 | |
| מיקרוסקופ אור הפוך | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-גלוטמין (200 מ"מ) | 25030081 | ||
| , 0.5 עד 1.0 הרץ | מדעי אמין | 55 פורמלין | |
| (10%) | שמן Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| אדום O | סיגמא-אולדריץ' | O0625 | |
| פרפורמלדהיד | סיגמא-אולדריץ' | P6148 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC) | Qiagen | 158904 | |
| פיפטות סרולוגיות, 2 עד 25 מ"ל | Costar Stripettes | ||
| חממת תרבית תאים לחה סטנדרטית, 37 מעלות; C, 5% CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | תרמו-פישר | 25200056 |
מקורות
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
