מאמר שיטה

ניתוח רפרטואר חיסוני של קולטן תאי T ו- B באמצעות רצף הדור הבא

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61792

⸱

12 בינואר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Pediatric Gastroenterology Unit, Edmond and Lily Safra Children's Hospital, Sheba Medical Center, 2Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 4Molecular Hematology Laboratory, Sheba Medical Center

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד DNA מדגימות דם וביופסיות מעיים, יצירת ספריות TCRβ ו- IGH PCR לריצוף הדור הבא, ביצועים של ריצת NGS וניתוח נתונים בסיסי.

תקציר

זיכרון אימונולוגי, סימן ההיכר של חסינות אדפטיבית, מתוזמר על ידי לימפוציטים T ו- B. במחזור ובאיברים שונים, ישנם מיליארדי שיבוטים ייחודיים של תאי T ו- B, וכל אחד מהם יכול לקשור אנטיגן ספציפי, המוביל לשגשוג, בידול ו/או הפרשת ציטוקינים. ההטרוגניות העצומה בתאי T ו- B נוצרת על ידי שילוב אקראי של מקטעים גנטיים שונים. טכנולוגיות רצף הדור הבא (NGS), שפותחו בעשור האחרון, מאפשרות מבט מעמיק וחסר תקדים על הרפרטואר החיסוני של קולטן תאי T ו-B. מחקרים במצבים דלקתיים שונים, כשל חיסוני, זיהומים וממאירות הראו שינויים ניכרים בשיבוטיות, בשימוש בגנים ובתכונות ביופיזיות של רפרטואר מערכת החיסון, וסיפקו תובנות חשובות על תפקידן של תגובות חיסוניות מסתגלות בהפרעות שונות.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור NGS של רפרטואר המערכת החיסונית של תאי T ו- B מן הדם והרקמות. אנו מציגים צינור החל מבידוד DNA דרך הכנת הספרייה, רצף על רצף NGS וכלה בניתוחים בסיסיים. שיטה זו מאפשרת לחקור תאי T ו- B ספציפיים ברמת הנוקלאוטידים או חומצות האמינו, ובכך לזהות שינויים דינמיים באוכלוסיות לימפוציטים ופרמטרים של גיוון במחלות שונות. טכניקה זו נכנסת לאט לפרקטיקה הקלינית ויש לה פוטנציאל לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשניים, ריבוד סיכונים ורפואה מדויקת.

מבוא

המערכת החיסונית האדפטיבית, המורכבת מלטמפוציטים T ו- B, משתמשת בזיכרון אימונולוגי כדי לזהות אנטיגן שנתקל בעבר וליזום תגובה מהירה. לימפוציטים נוצרים במח העצם ומתבגרים בתימוס (תאי T) או במח העצם (תאי B). הן קולטן תאי T (TCR) והן קולטן תא B (BCR) מציגים תצורות ייחודיות המאפשרות זיהוי של אנטיגנים ספציפיים. בתאי הומאוסטזיס, תאי T ו- B מסתובבים כל הזמן וסוקרים את טריליוני הפפטידים השונים המוצגים על תאים המציגים אנטיגן. TCR או קשירת BCR של אנטיגן מסוים עם זיקה גבוהה, יחד עם גירוי משותף מתאים, מוביל להפעלת תאים, וכתוצאה מכך הפרשת ציטוקינים, הרחבת שיבוטים ויצירת נוגדנים, במקרה של תאי B.

המערך העצום של תאי T או B השונים נקרא באופן קולקטיבי רפרטואר חיסוני, המאפשר הכרה באינספור אפיטופים שונים. על מנת ליצור רפרטואר כה עצום, מתרחש תהליך מורכב של הרכבה אקראית של מקטעי גנים שונים, ויוצר שילובים כמעט אינסופיים של קולטנים שיכולים לקשור אנטיגנים ייחודיים1. תהליך זה, הנקרא V(D)J recombination, כולל סידורים מחדש של משתנים שונים (V), גיוון (D) והצטרפות (J) גנים, מלווה מחיקות אקראיות והכנסות של נוקלאוטידים בצמתים2.

הארכיטקטורה של מערכת החיסון האדפטיבית עניינה מדענים בתחומים שונים במשך עשורים רבים. בעבר, רצף סנגר, קביעת אזור משלים 3 (CDR3) ספקטרtyping, ואת cytometry זרימה שימשו כדי לאפיין את הרפרטואר החיסוני, אבל סיפק רזולוציה נמוכה. בעשור האחרון, ההתקדמות בשיטות רצף הדור הבא (NGS) אפשרה תובנה מעמיקה על המאפיינים וההרכב של רפרטואר TCR ו- BCR של הפרט3,4. מערכות תפוקה גבוהה אלה (HTS) רצף ומעבד מיליוני מוצרי TCR או BCR מסודרים מחדש בו זמנית ולאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של תאי T ו- B ספציפיים ברמת נוקלאוטידים או חומצת אמינו. NGS מספק אסטרטגיה חדשה לחקר הרפרטואר החיסוני הן בבריאות והן במחלות. מחקרים העושים שימוש ב- HTS הדגימו רפרטואר TCR ו- BCR שונה במחלות אוטואימוניות5, כשל חיסוני ראשוני6,7, וממאירות, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה8. באמצעות NGS, אנו ואחרים הראו התרחבות אוליגוקלונית של שיבוטים ספציפיים של תאי T ו- B, בחולים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD), כולל קוליטיס כיבית ומחלת קרוהן9,10,11,12,13,14. בסך הכל, מחקרים מתחומים שונים מראים שלשינויים ברפרטואר יש תפקיד מכריע בפתוגנזה של הפרעות בתיווך חיסוני.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד דנ"א מביופסיות מעיים ודם, יצירת ספריות TCRβ ו- IGH PCR עבור NGS וביצוע ריצוף ריצה. אנו מספקים גם שלבים בסיסיים בניתוח נתונים של רפרטואר חיסוני. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור הדור של ספריות TCRα, TCRγ, ו IGL גם כן. השיטה תואמת גם לאיברים אחרים (למשל, בלוטות לימפה, גידולים, נוזל סינוביאלי, רקמת שומן וכו ') כל עוד נעשה שימוש בפרוטוקולי עיכול ספציפיים לרקמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית במרכז הרפואי שיבא, והושגה הסכמה מדעת בכתב מכל הנושאים המשתתפים.

1. בידוד וכימות DNA

  1. עיכול ותא תמוגה של ביופסיות מעיים
    1. יש לאחזר ביופסיות מעיים, שנאספו זה עתה או כאלה המאוחסנות ב-20°C או -80 °C (60 °F). אם משתמשים בביופסיות קפואות, מפשירים על קרח.
    2. הוסף 600 μL של תמיסת תמוגה גרעינית לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי 1.7 מ"ל, מקורר על קרח.
    3. מניחים ביופסיה לתוך צינור microcentrifuge עם פתרון תמיסת תמוגה דגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 15-30 דקות.
    4. יש להוסיף 17.5 מיקרו-ל' של 20 מ"ג/מ"ל חלבון K ולהדגיר במשך הלילה ב-55°C, עם רעידות עדינות.
    5. אפשר מדגם להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפני שתמשיך לשלב 1.3.
  2. תמוגה תאית של דם שלם
    1. השג 3 מ"ל של דם שלם בצינור המכיל EDTA, הפרין או ציטראט.
    2. בעדינות צינור רוק עד מעורבב ביסודיות, ולהעביר דם צינור סטרילי 15 מ"ל צנטריפוגה המכיל 9 מ"ל של פתרון תמוגה התא. הפוך מספר פעמים במהלך תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. צנטריפוגה ב 2,000 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להשליך כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה לבנה גלוי. כ 50-100 μL של שאריות נוזל יישאר.
    4. צינור וורטקס במרץ במשך 15 שניות עד לשימוש חוזר לחלוטין. הוסף 3 מ"ל של תמיסת תמוגה גרעינית ו pipet מספר פעמים. הפתרון צריך להיות צמיג.
  3. משקעים בחלבון
    1. הוסף 200 μL של מאגר משקעים חלבון לרקמה, או 1 מ"ל לדם. וורטקס במרץ במשך 20 s ודגר על קרח במשך 5 דקות. גושי חלבון קטנים עשויים להיות גלויים לאחר מערבולת.
    2. צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 4 דקות. גלולה הדוקה המכילה חלבונים מזורזים צריכה להיווצר.
    3. בזהירות להעביר supernatant, מבלי להפריע גלולה, לצינור חדש 1.7 מ"ל.
      הערה: אם גלולה אינה הדוקה, לשקול צנטריפוגה אחרת ב 16,000 x g במשך 4 דקות.
  4. משקעים והתייבשות DNA
    1. מוסיפים 1 מ"ל של 2-propanol לצינור המכיל את supernatant, בעדינות לערבב על ידי היפוך. הדנ"א צריך להיות גלוי כחומר צף לבן.
    2. צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 1 דקות. הסר את supernatant לחלוטין באמצעות פיפטה.
    3. מוסיפים 1 מ"ל של 70% אתנול טרי, והפך צינור מספר פעמים. צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. השלך על טבעי בזהירות.
    4. חזור על שלב 1.4.3.
    5. מניחים צינור פתוח הפוך על נייר סופג נקי במשך 10-15 דקות. הפוך מחדש את הצינור ואשר הידרציה מלאה. במידת הצורך, השאירו לייבוש אוויר למשך 10-15 דקות נוספות.
      הערה: זה חיוני עבור גלולה להתייבש לחלוטין.
    6. הוסף 50 μL של מים טהורים במיוחד (UPW). במידת הצורך, ניתן לדלל את הדנ"א יותר לאחר כימות.
    7. דגירה במשך 1 שעות על בלוק חום ב 65 מעלות צלזיוס, עבור התייבשות DNA.
  5. כימות דנ"א
    הערה: הדנ"א כומת באמצעות מד פלואורומטר וריאנטים ייעודיים, כפי שצוין בטבלת החומרים.
    1. הביאו תקנים לטמפרטורת החדר והכינו את הערכה, כולל צינורות ייעודיים של 0.5 מ"ל.
    2. מכינים תערובת חיץ וצבע בצינור של 15 מ"ל, לפי מספר הדגימות. הוסף 200 μL של חוצץ ו 1 μL של צבע לכל מדגם. כלול 2 דגימות עבור תקנים. מומלץ לחשב מדגם נוסף כדי למנוע שהמאגר לא יספיק.
      1. עבור 2 סטנדרטים, מקום 190 μL של תערובת מעל מוכן בצינור 0.5 מ"ל. הוסף 10 μL של התקן.
      2. עבור כל מדגם, מקום 199 μL של תערובת שהוכנה לעיל בצינור 0.5 מ"ל. הוסף μL אחד של ה-DNA.
    3. קרא את הדגימות. התוצאה מצביעה על ריכוז הדנ"א של הדגימה.
    4. אם הדגימות נמצאות מעבר לגבול, לדלל את ה-DNA 1:10 עם UPW, ולחזור לקרוא.

2. הכנת הספרייה

הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש בערכת מבחנים מבוססת PCR מרובת-פיקסלים התואמת לרצפי NGS. הערכה מכילה 24 מדדים שונים שכל אחד מהם מכוון לאזורים שמורים בתוךV β ובאזורי Jβ. פעולה זו מאפשרת תגובת PCR חד-שלבית ואיגום של דגימות שונות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.

  1. הכינו דגימות דנ"א. להשיג 150 ng של DNA ולהוסיף UPW עבור סך של 5 μL.
    הערה: ניתן להשתמש פחות מ 150 ng של DNA להכנת הספרייה, עם ריכוז מינימלי של 10 ng / μL.
  2. מניחים פיפטות וטיפים במכסה המנוע עם אור UV במשך 15 דקות כדי לשבור את ה-DNA שיורית. בינתיים, לאפשר צינורות אינדקס שונים (להכנת הספרייה) ופולימראז DNA להפשיר על קרח.
  3. במכסה המנוע הביולוגי, להוסיף 45 μL מצינורות אינדקס שונים לתוך צינורות PCR. כדי לעקוב, להוסיף 0.2 μL של פולימראז DNA ו 5 μL של DNA מוכן בשלב 2.1 לתוך צינורות PCR.
  4. הפעל תגובת PCR באמצעות תוכנית מוגדרת מראש, בהתאם להוראות היצרן.

3. טיהור וכימות הגברה

  1. השתמש חרוזים מגנטיים להסרת פרייומרים עודפים, נוקלאוטידים, ואנזימים.
    1. מחממים את החרוזים לפחות 30 דקות לטמפרטורת החדר. הכן מספיק טרי 80% אתנול עבור 400 μL לכל מדגם.
    2. הוסף 50 μL (IGH) או 35 μL (TCRβ) של החרוזים לכל צינור PCR ומערבבים על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מניחים את המדגם המעורב על המעמד המגנטי במשך 5 דקות.
    4. לשאוף 95 μL (IGH) או 80 μL (TCRβ) של נוזל שקוף להשליך. לשאוף נוזל שנותר באמצעות קצה μL 10.
    5. הוסף 200 μL של 80% אתנול לכל מדגם. דגירה 30 שניות. לשאוף 195 μL של אתנול ולהשליך. לשאוף נוזל שנותר באמצעות קצה μL 10.
    6. חזור על שלב 3.1.5. פותחים את כובעי הצינורות ומניחים לאוויר להתייבש במשך 5 דקות.
    7. מיד לאחר 5 דקות, להסיר מעמד מגנטי ולהוסיף 25 μL של מאגר elution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). מערבבים על ידי pipetting עד הומוגני. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
    8. מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי במשך 5 דקות. העבר 22 μL לצינור PCR חדש. למדוד את ריכוז ה-DNA (שלב 1.5).
  2. כימות אמפרליקון
    הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש במכונת אלקטרופורזה אוטומטית לבקרת איכות של ריכוז DNA, גודל ושלמות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.
    1. מניחים ריאגנטים וקלטת מסך בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות.
    2. בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.7 מ"ל, בצע דילול של 1 ng/μL של דגימות הדנ"א שכומתו בשלב 3.1.8 עם UPW בנפח כולל של לפחות 3 μL.
    3. דנ"א מדולל של וורטקס לפני השימוש. מניחים 2 μL של חוצץ, יחד עם 2 μL של ה- DNA מדולל ברצועות PCR מיוחדות שכותרתו מראש (מסופק בערכה) ומניחים את הכובעים. מניחים על שייקר במשך דקה, ואחריו ספין למטה של רצועות PCR.
      הערה: בשל צמיגות המאגר, ודא שהמאגר העודף מוסר מהקצה לפני ההעברה לצינורות המדגם.
    4. במקום במכונה, רצועת המסך וה- PCR ללא הכובעים. פתח את המכסה של תיבת קצה בתוך המכונה. הקצה את המשרה עם התוויות המתאימות. תפעיל את המכונה.
      הערה: היסטוגרמה הפלט צריכה להיות שיא יחיד בגודל הרצוי של האמפליקונים (איור 1A). בדגימות באיכות ירודה, יצפו פסגות נוספות (איור 1B), המצביעות על ניקוי חרוזים לקוי או היווצרות של דימרים ראשוניים.

4. רצף הדור הבא

  1. כימות ואיגום של ספריה
    1. חשב את ריכוז הדנ"א הסופי ב- nM, באמצעות ערך DNA משלב 3.1.8, ואת הגודל בזוגות בסיסים (bp) של שיא המוצר, המתקבל מתוצאות מכונת אלקטרופורזה (ראה איור 1).
    2. עבור כל דגימה, לחשב את נפח ה-DNA לקחת עבור ריכוז סופי של 4 nM, בנפח הסופי של 10-20 מאגר elution μL.
    3. הכינו תערובת דילול חדשה לכל דגימה וקחו ממנה 2 μL לתערובת בריכה חדשה.
      הערה: עבור דגימות הכוללות פחות מ- 4 ננומטר, הוסף את כמות הדגימה המרבית האפשרית.
  2. הפעלת ספריה של NGS
    הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש בפלטפורמת רצף ספסל עליון. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.
    1. הכינו פתרון טרי של 0.2 N NaOH. הוסף 10 μL של 0.2 N NaOH לספריה מדוללת מוכן בשלב 4.1.3. הוסף 5% PhiX לצינור ומערבולת בקצרה. סובבו את הצינור כדי להבטיח שכל הפתרון התיישב בתחתית הצינור.
    2. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי denature את ה-DNA תקוע כפול. הוסף 980 μL של חיץ מצונן מראש מן הערכה לצינור המכיל DNA ומערבולת בקצרה.
    3. מניחים את הספרייה המדוללת על הקרח, ומכינים את הספרייה כדלקמן. לקבלת שילוב של 17 pM, להוסיף 425 μL של DNA משלב 4.2.2 ו 575 μL של חוצץ. הפוך את הספריה מספר פעמים וסובב למטה. טען 600 μL של הספריה הסופית על המחסנית המיועדת, והנח דגימות במכונה.
    4. הפעל את ההפעלה בהתאם להוראות התוכנה.

5. ניתוח רצף

  1. הורד מדדי רצף מרצף וודא כי נתוני רצף נמצאים בטווחים הבאים (ספציפיים לערכה המשמשת בפרוטוקול הנוכחי). דוגמאות שאינן עומדות בקריטריונים אלה כפופות להפעלה חוזרת:
    צפיפות אשכול (צפיפות (K/mm2)): 945K – 1800K
    אחוז הקריאות העוברות מסנן (אשכולות PF (%)): >90%
    ציוני איכות (%>=Q30): >85%
    יישור PhiX (מיושר%): 1.5% - 10%
    שיעור שגיאות PhiX (%): <1.0%

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בזאת, אנו מתארים שיטה לבידוד DNA מרקמת המעי והדם, הכנת ספריות עבור NGS, וצעדים בסיסיים של ריצוף לרצף רפרטואר חיסוני. הריצה תיצור קבצים fastq, אשר ניתן להמיר עוד יותר קבצי fasta לשימוש בפלטפורמת ImMunoGeneTics הבינלאומית (IMGT)/HighV-QUEST. HTS זה מבצע ומנהל ניתוחים רבים של עשרות אלפי רצפי TCRβ ו- IGH מסודרים מחדש, ברמת הנוקלאוטידים15. IMGT/HighV-QUEST מאפשר ניתוח של TCRs שונים ורפרטואר IGH הן בבריאות והן במחלות. זה יכול להוביל לזיהוי של שיבוטים "ספציפיים למחלה" חדשים, ניתוח של התרחבות שיבוטים ופרמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שינויים בשפע ובתפקוד של לימפוציטים B ו- T נתקלים לעתים קרובות בממאירות שונות18, הפרעות דלקתיות כרוניות (למשל, קוליטיס כיבית ודלקת מפרקים שגרונית)10,19, וב immunodeficiencies שונים17,20. השיטה הנוכחית משתמשת ב- NGS כדי להקל על תצוגה מעמיקה של רפרטואר TCR ו- BCR, ומאפשרת זיהוי של שינויים עדינים בשיבוט תאי T ו- B, שיתוף שיבוטים, שימוש בגנים V(D)J ומידע על מידת מוטציות ההיפר-מוטציות הס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לכל המחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-פרופנולSigmaI9516-500 מ"ל
1.7 מ"ל צינורות מיקרו צנטריפוגהAxygen8187631104051
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהגריינר188261
אתנול מוחלטMerck1.08543.0250
Amplitaq זהבתרמו פישרN8080241
AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63881
בלוק חוםBioerלא ישים
רגישות גבוהה D1000 מאגר מדגםAgilent5067-5603לתחנת טייפ
רגישות גבוהה D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584לתחנת טייפ. צינורות הנמכרים בנפרד
ערכת בדיקת לימפוטראקInvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019כל אחד כולל 24 אינדקסים
ריאגנטים MiSeq v2 (500 מחזורים)IlluminaMS-102-2003כולל סוג תא זרימה סטנדרטי וכל הריאגנטים הנדרשים
MiSeq SequencerIlluminaSY-410-1003
רצועות PCR4titude4ti-0792
Proteinase KInvitrogenEO0491
Qubit 4 פלואורומטרתרמו פישרQ33226
קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקהתרמו פישרQ32854כולל חיץ, צבע, תקנים וצינורות מיוחדים
שייקרביוסןלא ישים
Tapestation 2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
ultra מים טהוריםBio-lab7501
Wizard ערכת בידוד DNAPromegaA1120כוללת תמיסת ליזה של תאים, תמיסת ליזה של גרעינים ומאגר משקעים של חלבון
ערכת

מקורות

  1. Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
  2. Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
  3. Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
  4. Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
  5. Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
  6. Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
  7. Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109(2020).
  8. Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73(2019).
  9. Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
  10. Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
  11. Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
  12. Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
  13. Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
  14. Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
  15. Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333(2013).
  16. H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157(2015).
  17. Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
  18. Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688(2019).
  19. Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
  20. Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
  21. Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9(2018).
  22. Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962(2018).
  23. Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
  24. Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
  25. Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
  26. De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638(2018).
  27. Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
  28. Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TDNANGSVDJ

מאמרים קשורים