הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

4.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61809

⸱

1 באפריל 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology, 2Department of Pharmacology, Pennsylvania State University College of Medicine

במאמר זה

סיכום

ההליך מתאר בידוד של villi מן אפיתל מעי העכבר עובר דיפרנטיציה כדי לקבוע את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.

תקציר

קלוגוגניות של organoids מן האפיתל המעי מיוחסת לנוכחות של תאי גזע בו. האפיתל המעי הקטן של העכבר ממודר לתוך קריפטות ו villi: הגבעול ותאי המתרבים מוגבלים הקריפטות, ואילו אפיתל villi מכיל רק תאים מובחנים. לפיכך, קריפטות מעיים נורמליות, אבל לא villi, יכול להוליד organoids בתרבויות 3D. ההליך המתואר כאן חל רק על אפיתל villus העובר דיפרנציה המובילה לגבעול. השיטה המתוארת משתמשת Smad4-אובדן-פונקציה:β-catenin רווח של פונקציה (Smad4KO:β-cateninGOF) עכבר מוטציה מותנה. המוטציה גורמת לוילי המעיים להשפריץ וליצור תאי גזע בוילי. villi מעיים עוברים דיפרנציה הם גירד את המעי באמצעות שקופיות זכוכית, להציב מסננת 70 מיקרומטר ונשטף מספר פעמים כדי לסנן את כל תאים רופפים או קריפטות לפני ציפוי במטריצה BME-R1 כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם ליצירת organoid. שני קריטריונים עיקריים שימשו כדי להבטיח כי organoids וכתוצאה מכך פותחו מתא villus dedifferentiating ולא מן הקריפטות: 1) הערכה מיקרוסקופית villi מבודד כדי להבטיח היעדר כל קריפטות קשורות, הן לפני ואחרי ציפוי במטריצה 3D, ו 2) ניטור מסלול הזמן של התפתחות organoid מן villi. חניכת אורגנויד מן villi מתרחשת רק יומיים עד חמישה ימים לאחר ציפוי ונראה בצורה לא סדירה, ואילו organoids נגזר קריפטה מאותו אפיתל מעיים נראים בתוך שש עשרה שעות של ציפוי ונראה כדורי. המגבלה של השיטה, עם זאת, היא כי מספר organoids נוצר, ואת הזמן הנדרש עבור חניכה organoid מן villi להשתנות בהתאם למידת הדיפרנציה. לפיכך, בהתאם לייחודיות המוטציה או העלבון הגורם להשתמטות, יש לקבוע אמפירית את השלב האופטימלי שבו ניתן לקצור את villi כדי לבחון את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.

מבוא

קריפטות מעיים אבל לא villi, ליצור organoids כאשר תרבית מטריצת מטריגת מטריגת מטריגת BME-R1. אורגנוידים אלה הם מבנים המארגנים את עצמם, המכונים לעתים קרובות "מיני מעיים" בשל נוכחותם של שושלות שונות, אבות ותאי גזע הנמצאים אפיתל המעי ב vivo. הפוטנציאל ליצור organoids מ קריפטות מיוחס לנוכחות של תאי גזע1. villi המעיים לעומת זאת מורכב רק תאים מובחנים, ולכן לא יכול ליצור organoids. עם זאת, מוטציות 2 אותנאים המאפשרים דיפרנטיציה של אפיתל villus עלול להוביל לתאי גזע villi2,3. שינוי גורל זה וכתוצאה מכך גזענות אפיתל villi יכול להיות מאושר על ידי ציפוי אפיתל villus dedederentiating במטריצה 3D כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם יצירת organoid כאינדיקטור של גזעיות דה נובו אפיתל villus. לפיכך, ההיבט הקריטי של הליך זה הוא להבטיח היעדר זיהום קריפטה.

Smad4KO: מוטציה מותנית β-קטניןGOF גורמת להפיכת האפיתל במעיים המסומנים על ידי ביטוי של סמני התפשטות ותאי גזע בוילי, ובסופו של דבר היווצרות מבנים דמויי קריפטה בוילי המכונה קריפטות חוץ רחמיות נוכחותם של תאי גזע אלה וילי מפוזרים נקבעה על ידי ביטוי של סמני תאי גזע בקריפטות ה חוץ רחמיות (בוויוו) והיכולת של הווילי המוטנטי ליצור אורנואידים wh en plated Matrigel3. הנוהל המוזכר להלן מפרט את המתודולוגיה המשמשת לאישור הגבעול של אפיתל המעיים המשתמט ב- Smad4KO: β עכברי מוטציה מסוג Smad4-cateninGOF. מאפיין מרכזי של מתודולוגיה זו לבידוד villi היה השימוש של גירוד של לומן המעי, בניגוד לשיטת כלציה EDTA4. שלא כמו בשיטת EDTA chelation, בידוד villi על ידי גירוד שומר על רוב mesenchyme הבסיסי ומאפשר להתאים את הלחץ של גירוד כדי להניב villi ללא קריפטות קשורות. הלחץ של גירוד הוא סובייקטיבי למפעיל, ומכאן, הלחץ האופטימלי להניב villi ללא קריפטות קשורות חייב להיקבע אמפירית על ידי המפעיל. ההיבט הקריטי של הליך זה הוא להבטיח את היעדר זיהום הקריפטה על ידי בדיקה מיקרוסקופית של villi הן לפני ואחרי ציפוי במטריצה BME-R1.

villi מעיים הם גירד את לומן המעי עם שקופיות זכוכית להציב מסנן 70 מיקרומטר ונשטף עם PBS כדי להיפטר תאים רופפים או קריפטות, אם בכלל, לפני ציפוי במטריצה BME-R1. השיטה מדגישה את הקריטריונים הבאים כדי למנוע זיהום קריפטה: א) ממזג את הקציר villi החצי הפרוקסימלי של התריסריון שבו villi הם הארוכים ביותר, ב) מזעור מספר שריטות מניב villi, ג) שטיפת המסנן המכיל את villi באמצעות סדרה של PBS בצלחת שש באר, ו- d) המאשר את היעדר זיהום קריפטה על ידי בדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי ציפוי מטריצת BME-R1. בידוד Villi על ידי גירוד, ולא על ידי EDTA chelation, מונע אובדן מוחלט של mesenchyme הבסיסי שעשוי לספק את אותות הנישה5,6,7,8, במידת הצורך, עבור חניכה organoid מן אפיתל villus.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויי העכבר שנערכו, כולל שימוש בטמוקסיפן ובהמתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם, קיבלו את אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכון סטיבנס לאכינולוגיה.

1. עכברים

הערה: הדור של Smad4f /f; קאטנבלקס (אקס3)/+; עכברי ויללין-קרERT2 תוארו בעבר3. עכברות בוגרות בין שמונה ל-12 שבועות של גיל היו בשימוש.

  1. לגרום למוטציה של Smad4KO:מוטצייתGOF β קטנין ב- Smad4f/f; קאטנבלקס (אקס3)/+; Villin-CreERT2 עם הזרקה תוך-חניתית של טמוקסיפן בשמן תירס במשך ארבעה ימים רצופים.
  2. להקריב את נקע צוואר הרחם עכברים עשרה ימים לאחר הזרקת הטמוקסיפן הראשונה.
  3. לרסס את הבטן עם 70% אתנול כדי למנוע פרוות עכבר להיכנס לחלל הצפק.
  4. פתח את חלל הבטן עם מספריים דיסקציה כדי לחשוף את המעי. לבודד את המעי בעזרת המספריים והמלקחיים.
    הערה: אובדן במקביל של Smad4 יחד עם רווח של מוטציה פונקציה של β-קטנין (Smad4KO; β-cateninGOF) באפיתל מעיים הושג על ידי הזרקתSmad4f / f; קאטנבלקס (אקס3)/+; עכברי Villin-CreERT2 כל יום במשך ארבעה ימים רצופים עם 0.05 גרם טמוקסיפן/ק"ג משקל גוף בשמן תירס. עכברים אלה נקצרים עשרה ימים לאחר הזרקת הטמוקסיפן הראשונה כדי להבטיח את נוכחותם של תאים המבטאים סמנים הקשורים לתאי גזע בווילי המשתנה.

2. בידוד ותריסריון והכנה

  1. לנתח את החצי הפרוקסימלי של התריסריון.
  2. שטפו את התריסריון עם 5 מ"ל של PBS קר כקרח במזרק של 10 מ"ל כדי לנקות את התוכן הזוהר.
  3. פתחו את התריסריון לאורך עם מספריים זוויתיים והניחו את התריסריון שטוח על צלחת פטרי באורך 15 ס"מ על קרח עם הלומן של התריסריון מול המפעיל.

3. בידוד Villi על ידי גירוד

  1. לפני תחילת השריטה, מניחים מסננת רשת 70 מיקרומטר באחת בארות של צלחת תרבית רקמות 6-well. מלאו את כל הבארות ב-4 מ"ל של 1x PBS והניחו את צלחת תרבית הרקמות 6-well על קרח(איור 1).
  2. לגרד את villi כדלקמן באמצעות שתי שקופיות זכוכית מיקרוסקופית: אחד להחזיק את התריסריון למטה והשני לגרד(איור 1B1).
    1. מגרדים את הצד הזוהר של התריסריון באופן שטחי פעמיים כדי להסיר את הריר. החל לחץ כך שלב זה מסיר את שכבת הריר, אבל לא את villi.
    2. לגרד את התריסריון שוב, הלוך ושוב מפעיל פעמיים את אותו הלחץ כמו ב 3..1, שבמהלכו ניתן לראות villi איסוף על השקופיות(איור 1B2). זהו הלחץ האופטימלי (אשר חייב להיקבע אמפירית על ידי המפעיל) כדי להניב את villi ללא הקריפטות קשורות.
  3. השתמש צינור העברה 1 מ"ל המכיל PBS להעביר את villi (כי הם נאספים על השקופית מן השלב 3.2.2.) כדי מסננת רשת 70 מיקרומטר להציב בצלחת 6 טוב. הווילי נאספים כך, אחרי כל שריטה(איור 1B2).
  4. לשטוף את villi שנאסף במסננת 70 מיקרומטר (מ שלב 3.3) על ידי העברת מסננת (עם villi) דרך סדרה של בארות בצלחת 6 טוב המכיל PBS קר (~ 4 מ"ל / טוב). זה כדי להסיר קריפטות רופפות, אם בכלל.
  5. באמצעות צינור p1000, להעביר את השעיית villi ב PBS (~ 3 מ"ל) מן מסננת 70 מיקרומטר לצינור חדש 15 מ"ל על קרח.
  6. השתמש 0.1% BSA מצופה קצה צינור p200 קהה כדי לשאוף נפח 50 μL של התלי villi על שקופית זכוכית. לספור את מספר villi בטיפת 50 μL תחת הגדלה 4x כדי לקבוע את הריכוז של villi בהשעיית PBS. לדוגמה, אם יש 10 villi ב השעיה 50 μL נבדק, אז ריכוז villi הוא 0.2 villi/ μL. זה גם הזמן לאשר את היעדר קריפטות קשורות.
  7. חשב את הנפח של השעיית villi הנדרש צלחת בריכוז של 0.5 villi / μL של מטריצת BME-R1. הוסף 100 μL נוסף כדי להסביר את השגיאה pipetting ואת הנפח הנדרש לבדיקה מיקרוסקופית הנדרש כדי להבטיח את טוהר villi.
    זהירות: הלחץ המשמש בשתי השריטות הראשונות, שמסיר את הריר אך לא את הווילי, יש להשתמש בשאריות הבאות שבמהלכם וילילי ישוחרר. הגבל את מספר השריטות הלוך ושוב לשניים לאחר שחרור villi הוא ציין לראשונה. אמצעי זה מונע שחרור של villi עם קריפטות קשורות. זה חיוני כדי להעריך מיקרוסקופית את villi כדי להבטיח את היעדר קריפטות קשורות.

4. ציפוי של villi על מטריצת BME-R1

  1. באמצעות קצה צינור מצופה P200 מצופה BSA 0.1% p200 קהה, להעביר לצינור microcentrifuge את נפח villi (משלב 3.6) נדרש צלחת בצפיפות של ~ 6 villi לבאר ב 12.5 μL של מטריצת BME-R1. השימוש בקצה קהה מצופה BSA בשלב זה מבטיח כי villi, שהם גדולים מדי עבור קצה מחודד שואפים מבלי להיות חסום או איבד מלהיות תקוע לצדי הקצה.
  2. מסובבים את הווילי במשך 2 דקות ב-200 x גרם בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס) ומסירים את הסופר-נט.
  3. חזור על שלב 4.2 כדי להסיר את כל שאריות PBS ולהמשיך לשלב הבא תחת מכסה המנוע זרימה למינאר.
  4. יש להפשיר בעדינות את כדורי הווילי בכמות הנדרשת של BME-R1 קר המופשר על קרח.
  5. באמצעות צינור p20, צלחת 12.5 μL / טוב של villi במטריצה BME-R1 בתלת-ממד בלוח U-תחתון 96-טוב מוזהר מראש.
  6. לדגור את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות ב 37 °C (5 °F) במשך 15 דקות כדי לאפשר התגבשות של מטריצת BME-R1.
  7. הוסף 125 μL / באר של ENR התחמם מראש (גורם גדילה אפידרמלי / Noggin / R-ספונדין1) מדיה: מתקדמת DMEM F-12 מדיה, בתוספת פניצילין 1x: סטרפטומיצין, 10 mM HEPES, גלוטמקס, 50 ננוגרם /מ"ל EGF, 100 ננוגין נופין/ מ"ל, 5% מדיה מותנית מתאי HEK293-T המבטאים R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-אצטיל ציסטאין, ו 0.05 מ"ג / מ"ל פרימוצין.
  8. לדגור את villi מצופה אינקובטור תרבית רקמות נשמר ב 37 °C (5% CO2,ולשנות את התקשורת כל יומיים.
  9. להשליך כל באר שבה organoids מופיעים לפני יומיים של ציפוי, שכן נקודת הזמן המוקדמת ביותר שבה אורגנוידים נגזר villi צפויים לאחר יומיים.
    הערה: כל וילילי שיש לו חצי או יותר ממחצית אורך של villi נספרים כמו villus אחד. שלא כמו אורגנוידים שמקורם בקריפטה, אורגנוידים שמקורם בווילי אינם צפויים בתוך 24 שעות לאחר הציפוי. נראה כי הווילי יוזם האורגנויד מחשיך ומתכווץ לפני היווצרות האורגנוידים. לפיכך, כל בארות עם organoids המתפתח בתוך יום של ציפוי צריך להיות מושלך כדי למנוע את הסבירות של נגזר זיהום קריפטה מתקבל על הדעת. המתודולוגיה המשמשת להפקת המדיה המותנית זמינה על פי בקשה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הגורם הקובע להצלחת ההליך הוא מניעת זיהום קריפטה. התפתחות האורגנויד מן villi (ולא מכל קריפטות מזהמות) מובטחת על ידי אישור ארבעה קריטריונים עיקריים: 1) הבטחת טוהר villi שנקטף על ידי בדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי ציפוי villi ב BME-R1, 2) ציפוי מספר מוגבל של villi לבאר כדי לאפשר הדמיה של כל villi מצופה בנפרד, 3) על ניתוח התפתחות organoid מדי יום; תמונות של קורס הזמן מראות התפתחות של אורגנויד מווילי(איור 3)ו-4) המביטות את הקינטיקה ואת המראה המורפולוגי של האורגנוידים היוזמים מווילי; האורגנוידים היו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטה זו יכולה לאשר את יכולת ההתחדשות העצמית של אפיתל villi dedifferentiating שרוכשים סמני תאי גזע ב vivo. אפיתל המעיים הרגיל יכול להוליד אורגנוידים מהקריפטה אך לא את תא villi, כאשר תרבית בתלת ממד בגלל נוכחותם של תאי גזע בקריפטות1. לכן, היווצרות organoid מן אפיתל villi מפוזר בתרבית תרביתות 3D מאשר היווצרות תאי גזע מהיפוך גורל התא. דיווחים על היפוך גורל התא באפיתל המעי הנובע מוטציות ו /או פציעה גדלים2,3,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

תודות

פרסום זה נתמך על ידי פרס מספר K22 CA218462-03 מהמכון הלאומי לסרטן NIH. תאי HEK293-T המבטאים R-Spondin1 היו מתנה נדיבה מד"ר מייקל פ Verzi.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM F-12 מדיה מתקדמתGibco12634010
3,3-diaminobenzidineVector LabsSK-4105
96 באר U-bottom plateFisher ScientificFB012932
ABC KitVector Labs  PK4001
מספריים זוויתייםפישר סיינטיפיק11-999
בעלי חיים רקומביננטי אנושיEGF PeprotechAF-100-15
B-27 תוסף תזונה (50X), מינוס ויטמין AGibco12587010
סרום בקר אלבומין (BSA) אבקה ללא פרוטאזפישר סיינטיפיקBP9703100
נוגדן CD44 BioLegend
1030001 נוגדן Cdx2איתות תאים12306
שמן תירססיגמא-אולדריץ'C8267-500ML
מסננת תאים קורנינג 70 מיקרוןמדעי החיים431751
Cultrex תמצית קרום מרתף עם גורם גדילה מופחת, סוג R1R& D3433-005-R1
מספריים לדיסקציהפישר סיינטיפיק22-079-747
מלקחייםפישר סיינטיפיק17-456-209
גלוטמקס (100X)Gibco35050-061
תאי HEK 293-T המבטאים RSPO-1מתנה מד"ר מיכאל ורזי
HEPES (1M)Gibco15630-080
היסטוג'לThermoscientificHG-4000-012
מסנן רשתפישר סיינטיפיק07-201-431
שקופית זכוכית מיקרוסקופVWR89218-844
N-2 תוסף (100X)Gibco17502048
N-אצטיל ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'A9165
p200 טיפים קהיםVWR46620-642
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)גיבקו15140-122
פרימוצין (50 מ"ג/מ"ל)Invivogenant-pm-1
איכות ביולוגית בע"מ PBS (10X)פישר סיינטיפיק50-146-770
עכברים רקומביננטיים נוגיןפפרוטק250-38
איתות תאיםמדלל אותות8112L
טמוקסיפןסיגמא-אולדריץ'T5648-1G
צלחת תרבית רקמות 6 בארותפישר סיינטיפיק50-146-770
ללא

מקורות

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
  3. Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
  4. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
  5. Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
  6. Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
  7. Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
  8. Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
  9. Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
  10. Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
  11. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  12. Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  13. Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
  14. Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
  15. Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
  16. Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
  17. Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
  18. Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
  19. Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757(2013).
  20. Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

היווצרות אורגנואידיםפרוטוקול דה-דיפרנציאציהשביטה של Smad4תפקוד-יתר של Beta-cateninשיטת גירוד וילוסיםזריעת מטריצה BME-R1תזמון ייזום אורגנואידיםמניעת זיהום קריפטותניתוח פנוטיפי
פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.