מאמר שיטה

שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

DOI:

10.3791/61822

⸱

23 בינואר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, 2Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province/Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מורפולוגיה, גודל וכמות של תאים, גרגרי ענבן וגופים חלבון בזרע לקבוע את המשקל ואיכות הזרע. הם שונים באופן משמעותי בין אזורים שונים של זרעים. על מנת להציג את המורפולוגיות של תאים, גרגרי איתילן וגופים חלבון בבירור, וכמותית לנתח את הפרמטרים המורפולוגיה שלהם במדויק, המקטע בגודל כל הזרעים נדרש. למרות כל הזרע בגודל פרפין סעיף יכול לחקור את ההצטברות של חומרי אחסון בזרעים, קשה מאוד לנתח כמותית את הפרמטרים מורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון בשל הרזולוציה הנמוכה של הסעיף העבה. סעיף שרף דק יש ברזולוציה גבוהה, אבל שיטת מקטע שרף שגרתי אינו מתאים להכין את החלק בגודל הזרע כולו של זרעים בוגרים עם נפח גדול ותוכן עעמלן גבוה. במחקר זה, אנו מציגים שיטת מקטע יבש פשוטה להכנת סעיף שבין בגודל זרע כולו. הטכניקה יכולה להכין את הצלב ואת האורך בגודל זרעים של פיתוח, בוגר, נבט, וזרעים מבושלים מוטבע שרף לבן LR, אפילו עבור זרעים גדולים עם תוכן עעמלן גבוה. החלק בגודל זרע כולו יכול להיות מוכתם עם מבהיר פלורסנט 28, יוד, ו Coomassie כחול מבריק R250 כדי להציג באופן ספציפי את המורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון בבירור, בהתאמה. ניתן לנתח את התמונה שהושגה גם באופן כמותי כדי להראות את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרעי צמחים מכילים חומרי אחסון כגון עילן וחלבון ומספקים אנרגיה ותזונה לאנשים. הצורה, הגודל והכמות של תא וחומרי אחסון קובעים את המשקל והאיכות של הזרע. התאים וחומרי האחסון באזורים שונים של זרעים יש מורפולוגיות שונות באופן משמעותי, במיוחד עבור כמה גידולי דגנים עמילוס גבוה עם עיכוב של עמילן הסתעפות אנזים IIb1,2,3. לכן, חשוב מאוד לחקור את המורחולוגיות של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של זרעים.

פרפין קטע היא שיטה טובה כדי להכין את כל הזרע בגודל סעיף יכול להציג את מבנה הרקמה של הזרע ואת הצטברות של חומר אחסון באזורים שונים של זרע4,5,6. עם זאת, סעיפים פרפין בדרך כלל יש 6-8 μm עובי עם רזולוציה נמוכה; לכן, קשה מאוד להתבונן בבירור ולנתח באופן כמותי את המורפולוגיה של תא וחומרי אחסון. מקטעים שרין בדרך כלל יש 1-2 μm עובי ברזולוציה גבוהה והם מתאימים מאוד להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תא וחומריאחסון 7. עם זאת, שיטת ניתוח שרין שגרתית מתקשה להכין את המקטע בגודל זרע כולו, במיוחד עבור זרעים עם נפח גדול ותוכן איתן גבוה; לפיכך, אין דרך להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של הזרע. שרף לבן LR הוא שרף אקרילי ומציג צמיגות נמוכה וחחללות חזקה, המוביל יישומים טובים שלה בהכנת סעיף שרף של זרעים, במיוחד עבור גרעינים בוגרים דגנים עם נפח גדול ותוכן איתילן גבוה. בנוסף, המדגם מוטבע LR לבן שסוף ניתן להכתים בקלות עם צבעים כימיים רבים כדי להציג בבירור את המורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון תחת אור או מיקרוסקופפלורסנט 7. בעיתון הקודם שלנו, דיווחנו על שיטת מקטע יבש להכנת חלקים בגודל זרע של גרעיני דגנים בוגרים מוטבע שרף לבן LR. השיטה יכולה גם להכין את החלק בגודל זרע של פיתוח, נביטה ומבושלת גרעין דגנים8. הסעיף שהתקבל בגודל זרע כולו יש יישומים רבים תצפית מיקרומורפולוגיה וניתוח, במיוחד עבור צפייה ברורה וניתוח כמותי של הבדלי מורפולוגיה של תא וחומרי אחסון באזורים שונים שלזרע 8,9.

טכניקה זו מתאימה לחוקרים שרוצים לבחון את מבנה המיקרו של רקמות ואת הצורה והגודל של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות מיקרוסקופ אור. ניתן לנתח את התמונות של חלקים בגודל זרעים שלמים המוכתמים במיוחד עבור תאים מוצגים, גרגרי איתילן וגופים חלבון על ידי תוכנת ניתוח מורפולוגיה כדי למדוד באופן כמותי את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע. על מנת להדגים את הישימות הטכנית ויישומי סעיף בגודל זרעים שלמים, חקרנו את הזרעים הבוגרים של תירס ואונס זרעי שמן ואת הגרעינים המתפתחים, נבט, ומבושל של אורז במחקר זה. הפרוטוקול מכיל ארבעה תהליכים. כאן, אנו משתמשים בליבת תירס בוגרת, שהיא הקשה ביותר בהכנת המקטעים בגודל כל הזרע בשל נפח גדול ותוכן מעילן גבוה, כדגימה כדי להציג את התהליכים צעד אחר צעד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת זרע מוטבע שרף (איור 1)

  1. לתקן שישה גרעינים תירס בוגר ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירה (0.1 M, pH7.2) ב 4 ° C עבור 48 שעות. החוקרים יכולים לבחור תערובות קיבעון אחרות, ריכוזים קיבעון, ותנאי קיבעון על פי מטרות המחקר שלהם וסוגי רקמות.
  2. להוציא את הגרעינים ולחתוך אותם לאורך או transversally ל 2-3 מ"מ עובי באמצעות להב חד דו צדדי, ולתקן אותם ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירהייד (0.1 M, pH 7.2) שוב במשך 48 שעות.
  3. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של 0.1 M פוספט מאגר (pH 7.2) במשך 30 דקות בכל פעם.
  4. מייבשים את הדגימות בהגדלת הציונים של תמיסת אתנול (10 מ"ל) מ-30% ל-50%, 70%, 90% פעם אחת ו-100% שלוש פעמים במשך 30 דקות בכל פעם.
  5. לחדור את הדגימות ב 10 מ"ל הגדלת ציונים של פתרון LR לבן שרפים מדולל עם אתנול מ 25% כדי 50%, 75% פעם אחת, ו 100% פעמיים ב 4 ° C עבור 12 שעות בכל פעם.
  6. הכינו את הדומיות לדגימות לפני ההטיה. להוסיף 0.25 מ"ל של 100% LR לבן שף לתוך צינור צנטריפוגה 2 מ"ל, ופולימר אותו ב 60 ° C עבור 48 שעות.
  7. ברציפות להוסיף שרף לבן LR טהור (0.5 מ"ל) ואת הדגימה הסתננה לתוך צינור צנטריפוגה עם ה-Pedestal. מיישרים את הדגימות עם המחט האנטומית, וממירים אותן ב-60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 48 שעות.

2. מקטע יבש להכנת חלק בגודל זרע שלם (איור 1)

  1. להוציא את הגרעינים מוטבעים מצינור הצנטריפוגה ולחתוך את שרף עודף סביב המדגם באמצעות להב חד.
  2. מהדק את בלוק הברסין במחזיק המדגם של אולטרה מיקרוטומי (EM UC7), ולקצץ את את השנין המיותר על פני השטח של המדגם וסביב הדגימה עם להב.
  3. ללטש את פני השטח של המדגם דק עם סכין זכוכית עד שניתן יהיה לגבש קטע שלם.
  4. לשים וו נחושת קטן על 2 מ"מ מעל קצה הלהב לפני חיתוך ולחתוך את הדגימה לתוך סעיף 2 μm. התפקיד של הוו הוא למנוע את התלתל כלפי מעלה של המקטע.
  5. שים את הוו מתחת למקטע כדי לתמוך בו כאשר המקטע הופך ארוך.
  6. מוסיפים 100 μL של מים על מגלשה לא מטופלת, ומעבירים בזהירות את החלק המלא והבלתי שבור למים עם הפינצטה.
  7. על מנת להחליק את החלק המקומט, מחממים ויבשים את הדגימה על שולחן השיטח ב-50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    1. אם המקטע מתפורר או דמעות, להאריך את הזמן עבור כל חדירה של שריון של המדגם מ 12 שעות כדי 24 שעות או 48 שעות.
    2. אם בחלק יש כמה קווים מקבילים לסכין, מהדק את בלוק הדגימה בחוזקה. אם בחלק יש כמה קווים אנכיים לסכין, אנא השתמש בסכין חדשה.

3. הכתמה והתבוננות בסעיף

הערה: על מנת לבחון את מבנה הרקמות ומורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון, להכתים את החלקים עם כתמים ספציפיים על פי מטרת המחקר. כאן, אנו משתמשים במבהיר פלורסנט 28, תמיסת יוד, ו- R250 כחול מבריק Coomassie כדי להכתים את קירות התא, גרגרי עילן, וגופים חלבון, בהתאמה.

  1. להתבוננות מורפולוגיה של תאים, להכתים את המקטע עם 40 מ"ל של 0.1% (w / v) מבהיר פלורסנט 28 פתרון מים בצנצנת כתמים זכוכית קומפקטית 70 מ"ל ב 45 ° C במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו עם מים זורמים במשך 5 דקות. צפה וצלם את החלק תחת מיקרוסקופ פלואורסציטי מצויד במצלמת CCD.
  2. להתבוננות מורפולוגיה של גרגרי עען, להכתים את המקטע עם 40 μL של תמיסת יוד (0.07% (w /v) I2 ו 0.14% (w / v) KI ב 25% (v /v) גליקרול עבור 1 דקות, ולכסות את המדגם המכיל פתרון יוד עם כיסוי. הצג וצלם את הדגימה תחת מיקרוסקופ אור המצויד במצלמת CCD.
  3. להתבוננות מורפולוגיה של גופים חלבון, לטבול את המקטע עם 40 מ"ל של 10% (v /v) חומצה אצטית בצנצנת ויטראז' קומפקטית 70 מ"ל במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להכתים אותו ב 40 מ"ל של 1% (w / v) Coomassie כחול מבריק R250 ב 25% (v / v) isopropanol ו 10% (v / v) חומצה אצטית במשך 15 דקות ב 45 ° C. שוטפים את החלקים המוכתמים במים זורמים במשך 5 דקות, וייבאשו. צפה וצלם את החלק תחת מיקרוסקופ אור מצויד במצלמת CCD.

4. ניתוח כמותי של פרמטרים מורפולוגיים

  1. תהליך וכמותי לנתח את התמונות המצולם עבור אזור, ציר ארוך / קצר, מעוגל של תאים, גרגרי מעילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה (Image-Pro פלוס 6.0 תוכנה) בעקבות ההליכים של Zhao etal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת מקטע יבש פשוטה להשגת מקטע בגודל זרע שלם
אנו מקימים שיטת מקטע יבש פשוט להכנת קטע בגודל זרע שלם של זרע מוטבע LR-לבן שף(איור 1). השיטה יכולה להכין מקטעים טרנסוורסאליים ואורך בגודל זרע שלם בעובי של 2 μm(איור 2-5, דמות משלימה 1-4). לדוגמה, הזרע הבוגר של אונס זרעי שמן ניתן לתדרך ולאורך(איור 2). עבור גידולי דגנים, הגרעינים הבוגרים שלהם מלאים גרגרי איתן, מה שמוביל לכך ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרעים הם המשאב המתחדש החשוב ביותר למזון, מספוא וחומר גלם תעשייתי, והם עשירים בחומרי אחסון כגון תעילן וחלבון. המורפולוגיה והכמות של תאים והתוכן והתצורה של חומרי אחסון משפיעים על המשקל והאיכות שלזרעים 7,12. למרות טכנולוגיית סטריאוטיפ וניתוח תמונה יכול למדוד את הגודל והכמות של תאים באזור רקמות, הם חסרים במעבדות רבות. מקטעי הפרפין והברף מעניקים תמונה דו-ממדית (דו-ממדית), המובילה בשום אופן בניתוח הגודל והכמות האמיתיים של התאים. עם זאת, התאים נחתכים באופן אקראי בכל המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון סופק על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071927), פרויקט הכשרונות של אוניברסיטת יאנגז'ואו ופיתוח התוכנית האקדמית העדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
צנצנת כתמים מזכוכית קומפקטית (5 מקומות)סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
Coomassie כחול מבריק R-250סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
CoverslipSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מ
להב דו צדדיג'ילט שנחאי ושות', בע"מ74-S
אתנול מוחלטסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
A500737 שולחן שיטוחLeicaHI1220
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסBX60
מבהיר פלואורסצנטי 28סיגמא-אולדריץ'910090
רצועות זכוכיתLeica840031
Glutaraldehyde 50% תמיסה במיםסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
גליצרולסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
יודסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
איזופרופנולסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
A507048 מיקרוסקופ אוראולימפוסBX53
LR שרף לבןאגר מדעיAGR1281A
תנורשנחאי ג'ינג הונג מעבדה מכשיר ושות', בע"מ9023A
אשלגן יודידסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
שקופיתסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
פינצטהסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
נתרן פוספט דודקהידראטסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
נתרן פוספט מונו-בייסי דיהידראטסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
UltramicrotomeLeicaEM UC7
A501931E678013A100472F518211A600875A600232A500538A100512F518101F519022A607793A502805

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
  5. Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099(2013).
  6. Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
  7. Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8(2020).
  8. Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
  11. Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
  12. Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LR Whitefluorescent brightener 28Coomassie Brilliant Blue

מאמרים קשורים