טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מורפולוגיה, גודל וכמות של תאים, גרגרי ענבן וגופים חלבון בזרע לקבוע את המשקל ואיכות הזרע. הם שונים באופן משמעותי בין אזורים שונים של זרעים. על מנת להציג את המורפולוגיות של תאים, גרגרי איתילן וגופים חלבון בבירור, וכמותית לנתח את הפרמטרים המורפולוגיה שלהם במדויק, המקטע בגודל כל הזרעים נדרש. למרות כל הזרע בגודל פרפין סעיף יכול לחקור את ההצטברות של חומרי אחסון בזרעים, קשה מאוד לנתח כמותית את הפרמטרים מורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון בשל הרזולוציה הנמוכה של הסעיף העבה. סעיף שרף דק יש ברזולוציה גבוהה, אבל שיטת מקטע שרף שגרתי אינו מתאים להכין את החלק בגודל הזרע כולו של זרעים בוגרים עם נפח גדול ותוכן עעמלן גבוה. במחקר זה, אנו מציגים שיטת מקטע יבש פשוטה להכנת סעיף שבין בגודל זרע כולו. הטכניקה יכולה להכין את הצלב ואת האורך בגודל זרעים של פיתוח, בוגר, נבט, וזרעים מבושלים מוטבע שרף לבן LR, אפילו עבור זרעים גדולים עם תוכן עעמלן גבוה. החלק בגודל זרע כולו יכול להיות מוכתם עם מבהיר פלורסנט 28, יוד, ו Coomassie כחול מבריק R250 כדי להציג באופן ספציפי את המורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון בבירור, בהתאמה. ניתן לנתח את התמונה שהושגה גם באופן כמותי כדי להראות את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע.
מבוא
זרעי צמחים מכילים חומרי אחסון כגון עילן וחלבון ומספקים אנרגיה ותזונה לאנשים. הצורה, הגודל והכמות של תא וחומרי אחסון קובעים את המשקל והאיכות של הזרע. התאים וחומרי האחסון באזורים שונים של זרעים יש מורפולוגיות שונות באופן משמעותי, במיוחד עבור כמה גידולי דגנים עמילוס גבוה עם עיכוב של עמילן הסתעפות אנזים IIb1,2,3. לכן, חשוב מאוד לחקור את המורחולוגיות של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של זרעים.
פרפין קטע היא שיטה טובה כדי להכין את כל הזרע בגודל סעיף יכול להציג את מבנה הרקמה של הזרע ואת הצטברות של חומר אחסון באזורים שונים של זרע4,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת זרע מוטבע שרף (איור 1)
- לתקן שישה גרעינים תירס בוגר ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירה (0.1 M, pH7.2) ב 4 ° C עבור 48 שעות. החוקרים יכולים לבחור תערובות קיבעון אחרות, ריכוזים קיבעון, ותנאי קיבעון על פי מטרות המחקר שלהם וסוגי רקמות.
- להוציא את הגרעינים ולחתוך אותם לאורך או transversally ל 2-3 מ"מ עובי באמצעות להב חד דו צדדי, ולתקן אותם ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירהייד (0.1 M, pH 7.2) שוב במשך 48 שעות.
- לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של 0.1 M פוספט מאגר (pH 7.2) במשך 30 דקות בכל פעם.
- מייבשים את הדגימות בהגדלת הציונים של תמיסת אתנול (10 מ"ל) מ-30% ל-50%, 70%, 90% פעם אחת ו-100% שלוש פעמים במשך 30 דקות בכל פעם....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטת מקטע יבש פשוטה להשגת מקטע בגודל זרע שלם
אנו מקימים שיטת מקטע יבש פשוט להכנת קטע בגודל זרע שלם של זרע מוטבע LR-לבן שף(איור 1). השיטה יכולה להכין מקטעים טרנסוורסאליים ואורך בגודל זרע שלם בעובי של 2 μm(איור 2-5, דמות משלימה 1-4). לדוגמה, הזרע הבוגר של אונס זרעי שמן ניתן לתדרך ולאורך(איור 2). עבור גידולי דגנים, הגרעינים הבוגרים שלהם מלאים גרגרי איתן, מה שמוביל לכך ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הזרעים הם המשאב המתחדש החשוב ביותר למזון, מספוא וחומר גלם תעשייתי, והם עשירים בחומרי אחסון כגון תעילן וחלבון. המורפולוגיה והכמות של תאים והתוכן והתצורה של חומרי אחסון משפיעים על המשקל והאיכות שלזרעים 7,12. למרות טכנולוגיית סטריאוטיפ וניתוח תמונה יכול למדוד את הגודל והכמות של תאים באזור רקמות, הם חסרים במעבדות רבות. מקטעי הפרפין והברף מעניקים תמונה דו-ממדית (דו-ממדית), המובילה בשום אופן בניתוח הגודל והכמות האמיתיים של התאים. עם זאת, התאים נחתכים באופן אקראי בכל המ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
המימון סופק על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071927), פרויקט הכשרונות של אוניברסיטת יאנגז'ואו ופיתוח התוכנית האקדמית העדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומצה אצטית | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| צנצנת כתמים מזכוכית קומפקטית (5 מקומות) | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| Coomassie כחול מבריק R-250 | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| Coverslip | Sangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| להב דו צדדי | ג'ילט שנחאי ושות', בע"מ | 74-S | |
| אתנול מוחלט | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| A500737 שולחן שיטוח | Leica | HI1220 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | אולימפוס | BX60 | |
| מבהיר פלואורסצנטי 28 | סיגמא-אולדריץ' | 910090 | |
| רצועות זכוכית | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% תמיסה במים | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| גליצרול | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| יוד | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| איזופרופנול | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| A507048 מיקרוסקופ אור | אולימפוס | BX53 | |
| LR שרף לבן | אגר מדעי | AGR1281A | |
| תנור | שנחאי ג'ינג הונג מעבדה מכשיר ושות', בע"מ | 9023A | |
| אשלגן יודיד | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| שקופית | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| פינצטה | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| נתרן פוספט דודקהידראט | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| נתרן פוספט מונו-בייסי דיהידראט | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | ||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
מקורות
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
