הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61950

⸱

9 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Chemistry, Azusa Pacific University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית באמצעות 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) כדי לבחון אוקסימים ספירוציקליים שסונתזו בעבר.

תקציר

הטרוציקלים ספירוציקליים דווחו לאחרונה בספרות כתרופות פוטנציאליות לטיפול בסרטן. הסינתזה של מערכות טבעות אורתוגונליות חדשניות אלה מאתגרת. לאחרונה פורסמה מתודולוגיה יעילה לסינתזה של תרכובות אלה, שתיארה את סינתזת הפאזה המוצקה בארבעה שלבים במקום חמשת השלבים שדווחו קודם לכן. היתרון של סינתזה קצרה זו הוא חיסול השימוש של ריאגנטים רעילים. שרף מבוסס קישור של מיכאל (REM) בטעינה נמוכה נמצא כחיוני בסינתזה, שכן גרסאות בעלות עומס גבוה מנעו הוספת ריאגנטים המכילים פניל מגושם ושרשראות צד ארומטיות. בדיקת הקולורימטריה 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) שימשה לבחינת הציטוטוקסיות של ריכוזי מיקרומולאר של מולקולות ספירוציקליות חדשניות אלה במבחנה. MTT זמין בקלות מסחרית ומפיק תוצאות מהירות ואמינות יחסית, מה שהופך את הבדיקה הזו לאידיאלית עבור הטרוציקלים ספירוציקליים אלה. נבדקו מבני טבעת אורתוגונליים וכן פורפורילאמין (מבשר בשיטת הסינתזה המכיל מוטיב טבעת דומה בן 5 איברים).

מבוא

עיכוב מולקולות קטנות של האינטראקציה של עכבר יוביקוויטין-ליגאז E3 דקה כפולה 2 הומולוג (MDM2) עם p53 ידוע לשחזר אינדוקציה בתיווך p53 של אפופטוזיס תאי גידול 1,2,3. MDM2 הוא מווסת שלילי של מסלול p53 ולעתים קרובות הוא מבוטא יתר על המידה בתאים סרטניים 4,5,6,7,8,9. מחקרים קריסטלוגרפיים וביוכימיים אחרונים גילו כי מולקולות קטנות המכילות מסגרת ספירוציקלית יכולות לעכב ביעילות אינטראקציות MDM2-p5310. המסגרת הספירוציקלית (איור 1, המוצללת בכחול) נחשבת למוטיב מיוחס מכיוון שנגזרת של מערכת הטבעות האורתוגונלית הנוקשה הזו הובילה לגילוי תרופות טיפוליות חדשניות. הגישה לארכיטקטורה מעניינת זו מציבה אתגר בעת שימוש בטכניקות סינתזה אורגניות מסורתיות. למרות שההשפעות הטיפוליות של מולקולות ספירוציקליות במערכות ביולוגיות נחקרו, סינתזה של מולקולות אלה היא עדיין תהליך מסורבל. מוצרי לוואי לא רצויים, שימוש בתנאים קשים ומתכות מעבר מסוכנות הם לעתים קרובות בעייתיים.

השימוש הפוטנציאלי במוטיב הספירוציקלי בפיתוח תרופות הוביל לפיתוח פרוטוקול המשתמש בסינתזה בפאזה מוצקה כדי ליצור ספרייה של מולקולות עם המוטיב בנוסף לקבוצות תפקודיות אחרות הניתנות להחלפה11,12. הפרדת המוצרים והמגיבים בין השלבים יכולה להיות מושגת פשוט על ידי שימוש במקשר REM המחובר לחרוז שרף וכלי מסנן פאזה מוצקה. זה יצמצם את הצעדים ואולי יעלה את התשואות. גישה סינתטית זו יכולה לייצר מגוון גדול של מועמדים פוטנציאליים לתרופות. עם זאת, היעילות של מולקולות אלה במערכת ביולוגית תדרוש חקירה נוספת.

כדי לקבוע את הציטוטוקסיות של תרכובות ספירוציקליות אלה, נעשה שימוש במבחן MTT13,14. שיטה זו מודדת את כדאיות התא וניתן להשתמש בה כדי לקבוע בעקיפין ציטוטוקסיות של תאים. ריכוזים שונים של המעכבים נוספו לתאים בתרבית בצלחת של 96 בארות, ושיעור התאים החיים נמדד על-ידי ניתוח קולורימטרי של מידת ההפחתה של MTT צהוב על-ידי דהידרוגנזות מיטוכונדריאליות לתרכובת הפורמזן הסגולה (איור 2). הפעילות מדווחת לרוב כערך IC 50 - הריכוז שבו צמיחת התאים מעוכבתב-50% ביחס לבקרה שאינה מטופלת. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול של בדיקת MTT ואת התוצאות הראשוניות של מולקולות ספירוציקליות חדשניות אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: מספר כימיקלים וריאגנטים ביולוגיים המשמשים בפרוטוקול זה הם רעילים ומסרטנים. יש להתייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (משקפי בטיחות שאושרו על ידי מינהל הבטיחות והבריאות התעסוקתית, כפפות מתאימות, מעילי מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעליים סגורות) לפני תחילת הניסוי. בנוסף, לאמץ נוהלי בטיחות מתאימים בעת ביצוע סינתזה וטיפול בכימיקלים רעילים וריאגנטים (אדים מכסה אדים).

1. סינתזת פאזה מוצקה של הטרוציקלים ספירוציקליים 6 ו-7

הערה: הסינתזה התבססה על עבודה שפורסמה בעבר11,12. הפרוטוקול המעודכן מגלה כי לא היה צורך בפתיחת הטבעת המזורזת של הטטרבוטילמוניום פלואוריד של ההטרוציקלית הטריציקלית, ולכן חיסולה מקצר את ההליך הסינתטי.

  1. בצע מיכאל תוספת של פורפורילאמין למקשר REM (משך: 25 דקות התקנה + 24 שעות זמן תגובה).
    1. הוסף 1 גרם (1 שווה ערך [שווה ערך]) של שרף REM, 20 מ"ל (20 שווה ערך) של דימתילפורמיד (DMF), ו-2.4 מ"ל של פורפורילאמין לכלי תגובה בפאזה מוצקה של 25 מ"ל. התסיסו את כלי התגובה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לאחר תחילת התגובה.
      הערה: הקפידו על ערבוב יסודי כדי שהשרף לא יישב בתחתית הכלי.
    2. יש לשטוף את השרף עם DMF 1x לאחר השלמת התגובה. לאחר מכן, יש לשטוף 4x, לסירוגין בין דיכלורומתאן (DCM) למתנול. יש לייבש היטב את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
  2. בצע טנדם מיכאל תוספת/ציקלואדיטור 1,3-דיפולרי (משך: 25 דקות התקנה + 48 שעות זמן תגובה).
    1. לשרף היבש, יש להוסיף 1.48 מ"ל (שווה ערך ל-5) של טריאתילאמין (TEA), 0.637 גרם (שווה ערך ל-2) של ניטרו-אולפין ו-10 מ"ל של טולואן יבש לכלי התגובה.
    2. לאחר מכן, הוסיפו 1.085 מ"ל (שווה ערך ל-4) של טרימתילסיליל כלוריד (TMSCl) לכלי התגובה במכסה אדים מאוורר היטב.
      הערה: מכיוון שתגובה זו מייצרת גז HCl, אין לכסות את כלי התגובה עד שהגז משתחרר מתחת למכסה אדים.
    3. יש לכסות היטב את כלי התגובה, ולהתסיס בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות.
      הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של השרף עם הריאגנטים.
    4. השתמש 5 מ"ל של מתנול כדי להרוות את התגובה.
    5. מסננים את הכלי כדי להסיר את הפתרון, ולאחר מכן לשטוף 4x, לסירוגין בין DCM ו מתנול. יש לייבש היטב את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
  3. בצע N-alkylation של הטרוציקל הקשור לשרף כדי ליצור את האמין הרבעוני (משך: 10 דקות הגדרה + 24 שעות זמן תגובה).
    1. לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 5 מ"ל של DMF ו-10 שווה ערך של אלקיל הליד, והתסיסו בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
      הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של הריאגנטים עם השרף.
    2. יש לשטוף את השרף עם DMF 1x לאחר השלמת התגובה. לאחר מכן, יש להשתמש ב-DCM ובמתנול לסירוגין כדי לשטוף פי 4. יבשו את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
  4. בצע חיסול β של האמין הרבעוני לביקוע מתמיכת הפולימר (משך: 15 דקות התקנה + זמן תגובה של 24 שעות).
    1. לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 3 מ"ל של DCM ו-1.49 מ"ל (שווה ערך ל-5) של TEA כדי לבקע את ההטרוציקל מתמיכת הפולימר.
    2. התסיסו את תערובת התגובה במשך 24 שעות כדי להבטיח ערבוב יסודי של השרף עם התמיסה. יש לשטוף 4x, לסירוגין בין DCM למתנול. אוספים את השטיפה מכל השטיפות, ומתרכזים באמצעות אידוי סיבובי.
    3. טריטורט עם מתנול כדי לטהר את האוקסימה הספירוציקלית. יבשו את השרף ביסודיות בכלי התגובה לאחר שטיפות לשימוש חוזר בניסויים עתידיים.

2. בדיקת ציטוטוקסיות באמצעות MTT 14

  1. יש להכין 20 מ"ל של תמיסת MTT של 5 מ"ג/מ"ל באמצעות תמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS, 0.9% NaCl במים) כמדלל. מסננים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C. לאחר מכן, הכן דילול 1:1 של תמיסת MTT משלב 2.1 במדיום תרבית תאים ללא סרום (DMEM).
  2. הכן 1 מ"ל כל אחד מפתרונות מלאי בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל של 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0.1 μM ו- 0.01 μM של תרכובות בדיקה בדימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. הכן 200 μL למנה של תמיסות העבודה של תרכובות בדיקה על ידי דילול ריכוזי מלאי 1:1000 במדיום ללא סרום בצינורות 1.5 מ"ל.
  3. במכסה המנוע של תרבית הרקמה, זרעו תאי COS-7 (תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי, כליית Cercopithecus aethiops ) במדיום שלם [DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS)] על צלחות 96-well שטופלו בתרבית רקמה בריכוז של 4 × 103 תאים /200 μL לבאר באמצעות פיפטור רב-ערוצי. תאי COS-7 נבחרו מכיוון ש-(1) אלה תאים נפוצים לבדיקות ציטוטוקסיות ו-(2) אלה כבר היו זמינים במוסד.
  4. לדגום תאי COS-7 במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO2.
  5. שאפו את הסופר-נטנט מהבארות באמצעות פיפטה מזכוכית פסטר המחוברת למשאבת ואקום. מינון התאים במשולש עם תרכובות הבדיקה באמצעות פתרונות העבודה שהוכנו בשלב 2.2 (ראה טבלה 1). דגירה של תאים כמתואר בשלב 2.4.
  6. שאפו את הסופרנטנט מהבארות. הוסף 200 μL של תמיסת MTT לכל באר. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO2 למשך 4 שעות.
  7. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט מהבארות מבלי להפריע לגבישי הפורמזן הסגולים. הוסף 200 μL של DMSO לכל באר כדי להמיס את גבישי הפורמזן הסגולים. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  8. מדוד את הספיגה ב-590 ננומטר14 או 600 ננומטר עבור כל באר באמצעות קורא צלחות של 96 בארות. השתמש בארות ללא תאים כרקע וממוצע ערך הספיגה. הפחת את ערך הרקע הממוצע של הספיגה מערך הספיגה של כל מטופל היטב. נרמל את הנתונים כאחוז מערך המינון האפס הממוצע (ממוצע שלושת ערכי מינון אפס). נתוני התווייה על ציר y: ליניארי (% כדאיות תא יחסית); ציר x: לוג (ריכוז). התווה כל סדרה כעקומה נפרדת (לדוגמה, נתונים משולשים צריכים לכלול 3 עקומות)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אוקסימים ספירוציקליים 6 ו-7 סונתזו באמצעות פרוטוקול שונה (איור 1). תוספת מיכאל של פורפורילאמין למקשר REM 1b העניקה שרף הקשור לפולימר 2. התקדמות התגובה הייתה מנוטרת על ידי ספקטרוסקופיית אינפרה-אדום (IR) על ידי גילוי היעלמות האסטר הבלתי רווי α,β בעומק 1722 ס"מ-1 (איור 3). שרף הקשור לספירוציקלית 4 נוצר מ-2 דרך ביניים חולף 3. הידרוליזה מתנולית של 4 מיוצרת 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-פניל-3-הידרוקסימינו 4-הידרוקסימתיל-פירולידין-1-yl]-חומצה פרופיונית מתיל א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הסינתזה של התרכובות הספירוציקליות התבססה על מחקר קודם שנערך במעבדה זו, אך עם כמה שינויים (איור 1)11,12. ההתקדמות של כל שלב תגובה הייתה מנוטרת על ידי ספקטרוסקופיית IR. תוספת מיכאל של מקשר REM 1 עם פורפורילאמין ניתנת לפולימר 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). מהדו"ח הקודם, ISOC של 2 ייצר את התרכובת הטרוציקלית הטריציקלית 3

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענק ממועצת המחקר של הפקולטה לק.ס.ה. (משרד המחקר והמענקים, אוניברסיטת אזוסה פסיפיק-ארה"ב). A.N.G. ו- J.F.M. הם מקבלי מלגת התנסות מחקרית לתואר ראשון (SURE). S.K.M. ו-B.M.R. זוכים במענקי מלגת מחקר STEM (המרכז למחקר במדע, אוניברסיטת אזוסה פסיפיק-ארה"ב). אנו מודים לד"ר מתיו ברזוק ולד"ר פיליפ קוקס על ההדרכה על הבדיקות הביולוגיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<תאים חזקים>
תאי COS-7 (ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651תאי כליה של קופים ירוקים אפריקאים
<חזקים>כימיקלים
1-ברומואוקטןסיגמא-אולדריץ'152951אלקיל-הליד
אלילברומידסיגמא-אולדריץ'337528אלקיל-הליד
בנזילברומידסיגמא-אולדריץ'B17905אלקיל-הליד
ציספלטיןקיימן כימיקל13119בקרת ציטוטוקסיות
דיכלורומתאן (DCM)סיגמא-אולדריץ'270997ממס
דימתילפורממיד (DMF)סיגמא-אולדריץ' 227056ממס
דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'276855
ממס DMEM, גלוקוז גבוה, עם L-גלוטמיןGenesee Scientific25-500מדיה לתרבית תאים
FBS (סרום בקר עוברי)Sigma-AldrichF4135מדיה לתרבית תאים
FurfurylamineAcros Organics119800050 ריאגנט 
יודומתאןסיגמא-אולדריץ'289566אלקיל-הליד
מתנולסיגמא-אולדריץ'34860ממס
MTT ((3-(4,5-דימתילתיאזול-2-יל)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד)EMDMilliporeCalbiochem 475989-1GMמגיב
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)Genesee Scientific25-507מדיה תרבית תאים
שרף REMNova Biochem8551010005תמיכה בפולימר; 0.500 מילימול/גרם העמסה
trans-β-ניטרוסטירןSigma-AldrichN26806מגיב ניטרו-אולפין
טולואןסיגמא-אולדריץ'244511ממס
טריאתילאמין (TEA)Sigma-AldrichT0886מגיב לסילוק בטא
טרימתילסיליל כלוריד (TMSCl)סיגמא-אולדריץ'386529ריאגנט; זהירות - תנודתי מאוד; יוצר HCl גז
<חזק>כלי זכוכית/מכשור
25 מ"ל כלי תגובה מוצקChemglassCG-1861-02כלי זכוכית עם מסנן
96 Well קורא צלחותPromega (Turner Biosystems)9310-011מכשיר
AVANCE III NMR ספקטרומטרBrukerN/Aמכשיר; 300 מגה-הרץ; ממיסים: CDCl3 ו-CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZAמכשיר
שייקר פעולת שורש כף הידBurrell מכשיר 757950819 מדעי

מקורות

  1. Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
  2. Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
  3. Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
  4. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
  5. Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
  6. Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
  7. Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
  8. Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  9. Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
  10. Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
  11. Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
  12. Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).
  13. Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
  14. MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MTTCisplatin
סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.