מאמר שיטה

לכידת מיקרו-דיסקציה בלייזר על רקמות כירורגיות לזיהוי ביטוי גנים חריג בריפוי פצעים לקוי בסוכרת מסוג 2

DOI:

10.3791/62091

⸱

13 בינואר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Skin Sciences, University of Bradford, 2The Charles Institute of Dermatology, School of Medicine, University College Dublin, 3University of Baghdad

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה זו מספקת מדריך לגרימת פצעים מחוץ לגוף , ביצוע מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר וכימות שינויים בביטוי גנים הקשורים לתהליכי ריפוי פצעים לקויים בסוכרת באמצעות רקמה אנושית רלוונטית קלינית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השכיחות העולמית של סוכרת מסוג 2 (T2DM) עולה בקצב מהיר. חולים עם סוכרת מסוג 2 סובלים ממספר רב של סיבוכים ואחד מהם הוא פגיעה בריפוי פצעים. זה יכול להוביל להתפתחות פצעים או כיבים בכף הרגל שאינם נרפאים ובסופו של דבר לקטיעה. אצל אנשים בריאים, ריפוי פצעים עוקב אחר רצף מבוקר וחופף של אירועים הכוללים דלקת, התפשטות ועיצוב מחדש. בסוכרת מסוג 2, אחד או יותר מהשלבים הללו הופך לבלתי מתפקד. המודלים הנוכחיים לחקר פגיעה בריפוי פצעים בסוכרת מסוג 2 כוללים בדיקות פצע שריטות במבחנה, מקבילות עור או מודלים של בעלי חיים לבחינת מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס ריפוי פצעים ו/או אפשרויות טיפוליות פוטנציאליות. עם זאת, אלה אינם מסכמים במלואם את תהליך ריפוי הפצעים המורכב בחולי סוכרת מסוג 2, ובדיקות עור אנושיות ex vivo הן בעייתיות בשל האתיקה של לקיחת ביופסיות אגרוף ממטופלים שבהם ידוע שהם יחלימו בצורה גרועה. כאן, מתוארת טכניקה לפיה ניתן לבחון פרופילי ביטוי של התאים הספציפיים המעורבים בתגובת ריפוי הפצע (הלקויה) התפקודית בחולי T2DM באמצעות רקמות עודפות שהושלכו לאחר קטיעה או ניתוח קוסמטי אלקטיבי. בפרוטוקול זה נאספות דגימות של עור שנתרם, פצועות, מתורבתות ex vivo בממשק נוזל האוויר, מקובעות בנקודות זמן שונות ונחתכות. סוגי תאים ספציפיים המעורבים בריפוי פצעים (למשל, קרטינוציטים אפידרמיסיים, פיברובלסטים עוריים (פפילרי ורשתית), כלי הדם) מבודדים באמצעות לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה והבדלים בביטוי גנים המנותחים על ידי ריצוף או מיקרו-מערך, עם גנים מעניינים מאומתים עוד יותר על ידי qPCR. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות הבדלים מובנים בביטוי הגנים בין עור שהחלים בצורה גרועה ועור שלם, בחולים עם או בלי סוכרת, באמצעות רקמות שהושלכו בדרך כלל לאחר ניתוח. זה יניב הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים התורמים לפצעים כרוניים של T2DM ואובדן גפיים תחתונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שכיחות סוכרת מסוג 2 גדלה ברחבי העולם, מונעת על ידי מגיפת השמנת יתר וחוסר פעילות גופנית. ריפוי פצעים לקוי שכיח בחולים אלה ועד 25% מהחולים יפתחו פצע כרוני שאינו מרפא1. המנגנונים העומדים בבסיס זה מורכבים ולא מובנים לחלוטין, ומגבילים את קצב הגילוי של טיפולים חדשים. אחד הגורמים התורמים לכך הוא היעדר מודל מתאים לחקר ריפוי פצעים בחולי סוכרת מסוג 2. לפיכך, מטרת שיטה זו היא לספק מודל ex vivo רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לבחינת ריפוי פצעים אצל אנשים בסיכון לפצעים כרוניים, המאפשר ניתוח טרנסקריפטומי כדי לקדם את הזיהוי של מטרות טיפוליות חדשות.

ישנם מספר מודלים זמינים כיום לחקר ריפוי פצעים, ולכל אחד מהם יש את החוזקות והחולשות שלו. מודלים של בעלי חיים in vivo, כגון עכבר db/db2 או חולדות סוכרתיות המושרות על ידי סטרפטוזוטוצין3 נמצאים בשימוש נרחב; עם זאת, פצעים במודלים של מכרסמים נרפאים באמצעות התכווצות, השונה מאוד מהמנגנון המופעל בגוף האדם, ויש להם הצלחה מוגבלת בתרגום לניסויים קליניים 4,5. היתרונות של שימוש ברקמה אנושית מוכרים היטב4, אך הם מסובכים על ידי האתיקה של גרימת פצעים ניסיוניים לאנשים שכבר ידועים כסובלים מתגובת ריפוי פצעים לקויה. כתוצאה מכך, מחקרים על נבדקים אנושיים עם סוכרת מכוונים בדרך כלל לתגובה הדלקתית ולא לניסויים ברקמה שנכרתה6. ניתן להשיג גם דגמי איבר על שבב7 ועור מלאכותי8. לאלה יש יתרון בכך שהם יכולים לנתח תרומות של תאים אנושיים אך נותנים אינדיקציה מועטה לשונות בין מטופלים. לפיכך, מודלים רלוונטיים מבחינה קלינית לחקר התקדמות ריפוי הפצעים באוכלוסיות חולים פגיעות יכולים להאיץ את ההבנה המכאניסטית וגילוי התרופות בתחום זה.

פרוטוקול הפציעה ex vivo המתואר להלן מותאם מ- Stojadinovic and Tomic-Canic, 20139. הוא מתאים לבחינת נתוני שעתוק מפציעה מבוקרת של דגימות רקמה אנושית ex vivo וניתן ליישם אותו על דגימות קליניות של חולים עם ריפוי פצעים לקוי (למשל, סוכרת מסוג 2, קשישים), על מנת לקדם את הידע על האופן שבו ריפוי פצעים מושפע במצבים אלה וכיצד ניתן לשחזר אותו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מסתמך על אספקת רקמה כירורגית אנושית. אישור אתי והסכמה מדעת של המטופל הושגו לפני הניסוי, והמחקר תאם את העקרונות המתוארים בהצהרת הלסינקי.

1. איסוף רקמות ופציעה ex vivo

  1. אסוף רקמה כירורגית לאחר קטיעה/ניתוח גפיים למיכל סטרילי המכיל את מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) עם 5% פניצילין-סטרפטומיצין-פטרייזון, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-10% סרום בקר עוברי (FBS; מדיום גידול מלא).
    הערה: ניתן לאחסן רקמות שנאספו באופן זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני הניסוי. כדי להבטיח את כדאיות הרקמה לניסויים ex vivo , מומלץ לעבד את הרקמה בהקדם האפשרי או לשמור על מרווח זמן קבוע בין איסוף לפציעה כדי לתקנן ניסויים על פני תרומות רקמות מרובות. אם יש לאחסן את הרקמה למשך זמן כלשהו, יש להוסיף לדגימה תמיסת ייצוב RNA כדי לשמור על שלמות ה-RNA.
  2. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את הרקמה לצלחת פטרי בגודל 60 מ"מ מלאה בתמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) בתוספת 5% פניצילין-סטרפטומיצין-פטרייה. חתוך את השומן מהדרמיס באמצעות אזמל סטרילי ו/או מספריים כירורגיים והשליך. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי טרייה במילוי PBS סטרילי.
  3. חבר שני להבים סטריליים יחד כך שיהיה רווח של 1 מ"מ בין שני הלהבים. ציון שני קווים ליניאריים מקבילים, ~1 מ"מ זה מזה, לאורך האפידרמיס והחלק העליון של הדרמיס הפפילרי10,11.
  4. הסר את האפידרמיס בין קווי הניקוד באמצעות מלקחיים סטריליים ומספריים כירורגיים ליצירת פצע ליניארי.
  5. השתמש באזמל כדי לחתוך את הרקמה למלבנים קטנים (גודל מקסימלי של 1 ס"מ2) המקיפים את הפצע עם אפידרמיס שלם משני הצדדים.
    הערה: כדי לשמור על שלמות הרקמה וה-RNA שלאחר מכן, יש לבצע את שלבים 1.2-1.5 במהירות האפשרית.
  6. צלם תמונה של הרקמה הפצועה באמצעות מיקרוסקופ מיקרודיסקציה בהגדלה פי 4 כדי להבטיח ששדה הראייה לוכד את כל הפצע ואת רקמת האפידרמיס השלמה שמסביב.
  7. בעזרת מלקחיים סטריליים, הניחו את מלבני הרקמה על תוספת תרבית רקמות בצלחת בת 6 בארות והשליכו בעדינות 2 מ"ל של מדיום גידול שלם לבאר. זה יבטיח שהדגימה מתורבתת בממשק נוזל-אוויר.
  8. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5%CO2 באוויר למשך עד 120 שעות.
    הערה: יש לדמות את הרקמה במיקרוסקופ מיקרודיסקציה באותה הגדלה כמו בשלב 1.6 בסוף הדגירה. ניתן גם לצלם תמונות כל 24 שעות במידת הצורך.

2. קיבוע רקמות והקפאה

  1. הצמד להקפיא את הרקמה בחנקן נוזלי. הנח כמות קטנה של מדיום חיתוך תואם קריוסטט על צ'אק קריוסטט והטמיע את הרקמה בתוכו. כוון את הרקמה בניצב לצ'אק כך שהפנים החותכות יחתכו את כל שכבות העור כולל האזור הפצוע. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  2. נקו את הקריוסטט בטמפרטורת החדר עם 70% אתנול ותרסיס טיהור RNase. הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ל-28 מעלות צלזיוס.
  3. בדוק שהכיוון של הצ'אק ולהב הקריוסטט יכול לייצר קטעים המקיפים את מלוא עובי הרקמה כולל הרקמה הפצועה והדרמיס שמתחתיה.
  4. בעזרת הקריוסטט, חותכים עד עשרה מקטעים של 7 מיקרומטר מכל פצע ומניחים על שקופיות מיקרו-דיסקציה נטולות RNA.
  5. אחסן את השקופיות בקופסה המקורית שבה סופקו שקופיות המיקרו-דיסקציה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי להבטיח סביבה נטולת RNase.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, אך שים לב שפירוק ה-RNA יגדל ככל שזמן האחסון ארוך יותר.

3. לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה

  1. הנח את שקופיות המיקרו-דיסקציה עם קטע הרקמה בקרח יבש ועבור לחדר מיקרוסקופ לכידת לייזר.
  2. יבש באוויראת השקופית הראשונה והמשך במהירות להכתים את החלקים בהמטוקסילין באמצעות ערכת צביעה המטוקסילין ואאוזין ללא RNase מיד לפני ביצוע מיקרודיסקציה של לכידת לייזר.
  3. דמיין את הרקמה הפצועה באמצעות מיקרוסקופ מיקרודיסקציה ללכידת לייזר בהגדלה של פי 10 וצלם תמונה של אזור העניין שיצולם בלייזר.
  4. עקוב אחר אזור זה (לדוגמה, לשון אפיתל, רקמת גרנולציה, מיקרו-כלים) ואסוף למיקרודיסקציה מכסי בידוד מפזר של 0.5 מ"ל באמצעות הוראות התוכנה למיקרוסקופ המסוים שבו נעשה שימוש.
  5. דמיין מחדש ודמיין את אזור העניין שצולם בלייזר באמצעות מיקרוסקופ מיקרודיסקציה לכידת לייזר בהגדלה של פי 10 כדי להדגים את המיקום והכריתה המלאה של הרקמה המנותחת.
    הערה: בצע לכידת לייזר עבור כל דגימה (עד 10 חלקים) למשך זמן מקסימלי של שעה אחת כדי למזער את פירוק ה-RNA.
  6. הוסף מאגר אחסון RNA לצינור המכיל את הרקמה המיקרו-מנותחת בהתאם להוראות היצרן, ואחסן בקרח יבש עד שניתן יהיה להעבירו למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול באופן זמני כאן.

4. כימות ביטוי גנים דיפרנציאלי

  1. צנטריפוגה את צינורות הדגימה במהירות מלאה למשך דקה.
  2. בודד RNA מהרקמה המיקרו-מנותחת בהתאם להוראות היצרן.
  3. יש לנטרל את ה-RNA בנפח סופי של 12 מיקרוליטר של מים נטולי RNase ולהגביר את ה-RNA באמצעות ערכת הגברת RNA ומחזור תרמי, בהתאם להוראות היצרן. מומלץ לבצע שני סבבי הגברה כדי להבטיח מספיק RNA להמשך ניתוח. השתמש בתנאי ההגברה בטבלה 1.
סיבוב הגברה ראשוןסיבוב הגברה שני
סינתזת גדיל ראשוןסינתזת גדיל ראשון
צעדטמפרטורהזמןצעדטמפרטורהזמן
165 מעלות צלזיוס5 דק'165 מעלות צלזיוס5 דק'
24 מעלות צלזיוסאחז24 מעלות צלזיוסאחז
342 מעלות צלזיוס45 דק'325 מעלות צלזיוס10 דק'
44 מעלות צלזיוסאחז437 מעלות צלזיוס45 דק'
537 מעלות צלזיוס20 דק'54 מעלות צלזיוסאחז
695 מעלות צלזיוס5 דק'
74 מעלות צלזיוסאחזסינתזת גדיל שני
צעדטמפרטורהזמן
סינתזת גדיל שני195 מעלות צלזיוס2 דק'
צעדטמפרטורהזמן24 מעלות צלזיוסאחז
195 מעלות צלזיוס2 דק'337 מעלות צלזיוס15
24 מעלות צלזיוסאחז470 מעלות צלזיוס5 דק'
325 מעלות צלזיוס5 דק'54 מעלות צלזיוסאחז
437 מעלות צלזיוס10 דק'
570 מעלות צלזיוס5 דק'שעתוק במבחנה
64 מעלות צלזיוסאחזצעדטמפרטורהזמן
142 מעלות צלזיוס6 שעות
שעתוק במבחנה24 מעלות צלזיוסאחז
צעדטמפרטורהזמן337 מעלות צלזיוס15 דק'
142 מעלות צלזיוס3 שעות44 מעלות צלזיוסאחז
24 מעלות צלזיוסאחז
337 מעלות צלזיוס15 דק'
44 מעלות צלזיוסאחז

טבלה 1: תנאי הגברה.

  1. כמת את הריכוז והטוהר של ה-RNA המוגבר. יחסי ספיגה של A260/230 (טוהר) ו-A260/280 (מזהמים) >-1.8 מתאימים לניתוח נוסף.
    הערה: ניתן להשתמש ב-RNA מוגבר מטוהר למחקרי ביטוי גנים ממוקדים (שלבים 4.5-4.6) או לשלוח אותו לניתוח מיקרו-מערך.
  2. סנתז cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוך cDNA בעלת קיבולת גבוהה בהתאם להוראות היצרן. התנאים הייצוגיים הם כדלקמן:
    • 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
    • 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים
    • 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות
    • החזקה של 4 מעלות צלזיוס
  3. בצע PCR כמותי באמצעות 0.5 מיקרוליטר cDNA ופריימרים של 1 מיקרומטר (של הגן המבוקש) בהתאם להוראות היצרן. תנאים מייצגים ורצפי פריימר הם כדלקמן.
    1. השתמש בתנאים הבאים לתנאי PCR כמותיים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 40 מחזורים של 95°C למשך 15 שניות ו-62°C למשך דקה אחת; 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; ואחיזה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. השתמש ברצפי הפריימר הבאים:
      GAPDH
      פורוורד 5'-TATAAATTGAGCCCCGCC-3'
      הפוך 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'

      KRT17
      קדימה 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      הפוך 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. פרשנות נתונים

  1. חשב את קצב ריפוי הפצע באמצעות התמונות של רקמת ex vivo שנוצרה בשלבים 1.6-1.8 באמצעות ImageJ. ישנם מספר פרסומים אחרונים המדגישים וריאציות שונות כיצד לנתח באופן אוטומטי אזורי פצע ב-ImageJ 12,13,14.
  2. לכמת את ביטוי הגנים באמצעות שיטת ΔCT , תוך השוואת מחזורי הסף של הגן המעניין בהשוואה לזה של עוזרת הבית (למשל, גליצרלדהיד-3-פוספט; GAPDH). לשם כך, שימו לב לערך ה-CT עבור עוזרת הבית ועבור הגן המעניין.
    1. חשב את ההבדל בין שני ערכי ה-CT כדי לנרמל את כמות ה-mRNA הקיימת ולשלוט בהבדלים בריכוזי מיצוי RNA בין בידודים שונים:
      ΔCT = CT (גן מעניין) - CT (עוזרת בית)
    2. חשב את גודל ההבדל בין ערכי CT כדי לתת את הכימות היחסי של הגן המעניין, מבוטא כאחוז של עוזרת הבית:
      כימות יחסי = (2-ΔCT) x 100
    3. לבחון את ההבדלים בין תורמים/מצבי מחלה שונים של חולים על ידי השוואת הכימות היחסי של הגנים המעניינים עבור כל דגימה.
      הערה: ניתן למצוא סכימה של הטכניקה כולה באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול, נבחרה נקודת זמן של 48 שעות כדי להפיק תוצאות מייצגות. ניתן לראות את יצירת הפצע הראשוני ברקמה עודפת מניתוחים קוסמטיים אלקטיביים באיור 2A שבו הפצע שנכרת נראה בבירור. צביעת המטוקסילין ואאוזין מאשרת שזה יצר פצע בעובי מלא (איור 2B). אחרי 48 שעות, סגירה חלקית של הפצע נראית במיקרוסקופ האור (איור 2C). צביעה היסטולוגית חושפת את לשון האפיתל שמתקדמת לריפוי הפצע (איור 2D), מה שמדגים שמודל ריפוי הפצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ככל שהשכיחות של הפרעות כרוניות כמו סוכרת מסוג 2 עולה ברחבי העולם, הצורך בטכניקות שיכולות להקל על מחקרים רלוונטיים מבחינה פתופיזיולוגית הופך דחוף יותר. הפרוטוקול המתואר לעיל מספק שיטה סטנדרטית לבחינת נתונים טרנסקריפטומיים מפצעי ריפוי ex vivo המשתמשים ברקמה אנושית.

פרוטוקול זה תלוי באספקת רקמה קלינית עודפת שלגביה ניתן אישור אתי מהרשות הרלוונטית, וממטופלים שנתנו הסכמה מדעת. בדרך כלל זה יהיה ממטופלים שעוברים קטיעה או ניתוחים קוסמטיים אלקטיביים. יש לשקול ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP נתמך על ידי תוכנית המסגרת השביעית של הנציבות האירופית למחקר ופיתוח טכני - Marie Curie Innovative Training Networks (ITN), הסכם מענק מס': 607886. RW נתמכה על ידי Aveda, Hair Innovation & Technology, ארה"ב. RB, SS נתמכו על ידי המרכז למדעי העור, אוניברסיטת ברדפורד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת Arcturus RiboAmp PLUSערכת הגברת RNAThermoFisher ScientificKIT0521
כובעי מפזר 0.5 מ"לMMIK10028161כובעי מיקרודיסקציה לכידת לייזר; 50 חבילות
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6046עם 1000 מ"ג/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן ביקרבונט, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים
סרום בקר עוברי תרמופישר סיינטיפיק10270106תוסף תרבית תאים
H& ערכת צביעה E בתוספתMMIK10028305ערכת צביעה המטוקסילין ואאוזין ללא Rnase
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה ערכת שעתוק הפוךApplied Biosystems4368814ערכת שעתוק הפוך
L-גלוטמיןThermo Fisher Scientific25030149תוסף תרבית תאים
MembraneSlidesMMIK10028153Laer לכידת שקופיות מיקרו-דיסקציה; 5 לקופסה
Netwell Mesh InsertCorning3479Cell Culture
Insert Penicillin-Streptomycin-FungizoneThermo Fisher Scientific15070-063תוסף תרבית תאים
15290-026
OCTTissue-Tek Sakura4583תואם קריוסטט חיתוך בינוני
PBSThermo Fisher Scientific10209252חמש טבליות לכל 100 מ"ל מים סטריליים ולאחר מכן חיטוי לתרבית תאים השתמש
ב-RNeasy Micro KitQiagen74004ערכת מיצוי RNA
RNase AwaySigma-Aldrich83931תרסיס RNase
להבים סטרילייםציוד מעבדה מדעית INS4974מיישמי דיסקציה של רקמות
תמיכה שקופיתMMIK10028159לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה שקופית תמיכה,
מספריים כירורגייםציוד מעבדה מדעיתINS4860דיסקציה של רקמות מיישמת
מלקחיים כירורגייםציוד מעבדה מדעיתINS2026דיסקציה של רקמות מיישמת
SYBR Green SupermixApplied Biosystems4344463PCR כמותי mastermix
של ללא RNase

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gianino, E., Miller, C., Gilmore, J. Smart Wound Dressings for Diabetic Chronic Wounds. Bioengineering. 5 (3), Basel. (2018).
  2. Song, M., et al. Cryptotanshinone enhances wound healing in type 2 diabetes with modulatory effects on inflammation, angiogenesis and extracellular matrix remodelling. Pharmaceutical Biology. 58 (1), 845-853 (2020).
  3. Liu, J., et al. Involvement of miRNA203 in the proliferation of epidermal stem cells during the process of DM chronic wound healing through Wnt signal pathways. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 348(2020).
  4. Pastar, I., Wong, L. L., Egger, A. N., Tomic-Canic, M. Descriptive vs mechanistic scientific approach to study wound healing and its inhibition: Is there a value of translational research involving human subjects. Experimental Dermatology. 27 (5), 551-562 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Mirza, R. E., Fang, M. M., Weinheimer-Haus, E. M., Ennis, W. J., Koh, T. J. Sustained inflammasome activity in macrophages impairs wound healing in type 2 diabetic humans and mice. Diabetes. 63 (3), 1103-1114 (2014).
  7. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  8. Yun, Y., Jung, Y. J., Choi, Y. J., Choi, J. S., Cho, Y. W. Artificial skin models for animal-free testing. Journal of Pharmaceutical Investigation. 48, 215-223 (2018).
  9. Stojadinovic, O., Tomic-Canic, M. Human ex vivo wound healing model. Methods in Molecular Biology. 1037, 255-264 (2013).
  10. Castellano-Pellicena, I., et al. Does blue light restore human epidermal barrier function via activation of Opsin during cutaneous wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 51 (4), 370-382 (2019).
  11. Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies. Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).
  12. Castellano-Pellicena, I., Thornton, M. J. Isolation of epidermal keratinocytes from human skin: The scratch-wound assay for assessment of epidermal keratinocyte migration. Methods in Molecular Biology. 2154, 1-12 (2020).
  13. Suarez-Arnedo, A., et al. An imaje J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS ONE. 15 (7), 0232565(2020).
  14. Venter, C., Niesler, C. U. Rapid quantification of cellular proliferation and migration using ImageJ. Biotechniques. 66 (2), (2019).
  15. Al-Rikabi, A. H. A., Riches-Suman, K., Tobin, D. J., Thornton, M. J. A proinflammatory environment induces changes in the diabetic phenotype of human dermal fibroblasts derived from diabetic and nondiabetic donors: Implications for wound healing. Scientific Reports. , (2020).
  16. Chen, A., et al. Towards single-cell ionomics: a novel micro-scaled method for multi-element analysis of nanogram-sized biological samples. Plant Methods. 16, 31(2020).
  17. Lutz, B. M., Peng, J. Deep profiling of the aggregated proteome in Alzheimer's Disease: from pathology to disease mechanisms. Proteomes. 6 (4), 46(2018).
  18. Rinschen, M. M. Single glomerular proteomics: A novel tool for translational glomerular cell biology. Methods in Cell Biology. 154, 1-14 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ex Vivo
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים