שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

צמחים אינם יכולים לברוח מלחצים ביוטיים, למשל, חרקים הניזונים מהם, ולכן הם פיתחו חישת מתח מתוחכמת ומערכות העברת אותות כדי לזהות ואז להגן על עצמם מפני אתגרים כגון אוכלי עשב¹. עם פציעה או התקפת אוכלי עשב, צמחים ליזום תגובות הגנה מהירה כולל הצטברות של חומצה ג'אסמונית phytohormone (JA) לא רק באתר הפצוע, אלא גם באיברים דיסטליים ניזוק². JA זה אז הן מפעילה תגובות הגנה ברקמות שנפגעו ישירות וגורם מראש הגנות בחלקים ניזוקו של הצמח. ב Arabidopsis, הצטברות של JA הנגרמת על ידי פציעה זוהתה עלים דיסטליים, שלמים בתוך דקות ספורות של נזק במקומות אחרים במפעל מציע כי אות מהיר למרחקים ארוכים מועבר מן העלה הפצוע³. מספר מועמדים, כגון Ca^{2 +}, מינים חמצן תגובתי (ROS), ואותות חשמליים, הוצעו לשמש אותם פצע למרחקים ארוכים אלה בצמחים^4,5.

Ca²⁺ הוא אחד האלמנטים המגוונים ביותר בכל מקום שליח שני באורגניזמים אוקריוטיים. בצמחים, לעיסת זחל ופציעה מכנית גורמים לעלייה דרסטית בריכוז ציטוזולי Ca²⁺ ([Ca²⁺]_ציט)הן בעל הפצוע והן בעלים מרוחקים לא מבוססים^6,7. אות Ca²⁺ מערכתי זה מתקבל על ידי חלבונים תאיים Ca²⁺חישה, אשר מובילים להפעלת מסלולי איתות הגנה במורד הזרם, כולל JA biosynthesis^8,9. למרות דיווחים רבים כאלה התומכים בחשיבות של Ca^{2 +} אותות בתגובות פצע הצמח, מידע על המאפיינים המרחביים והטמפורליים של Ca^{2 +} אותות הנגרמים על ידי פציעה מוגבל.

הדמיה בזמן אמת באמצעות מחווני Ca²⁺ מקודדים גנטית היא כלי רב עוצמה לניטור וכימות הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של אותות Ca²⁺ . עד כה פותחו גרסאות של חיישנים כאלה המאפשרות הדמיה של אותות Ca²⁺ ברמה של תא יחיד, לרקמות, איברים ואפילו צמחים שלמים¹⁰. הביוסנסור הראשון המקודד גנטית עבור Ca²⁺ המשמש בצמחים היה אקוורין החלבון הביולומינסנטי המופק ממדוזה Aequorea victoria¹¹. למרות חלבון chemiluminescent זה שימש כדי לזהות Ca^{2 +} שינויים בתגובה לחצים שונים בצמחים^{12,13,14,15,16,17,18}, זה לא מתאים היטב עבור הדמיה בזמן אמת בשל אות זוהר נמוך מאוד שהיא מייצרת. Förster תהודה העברת אנרגיה (FRET)מבוסס Ca^{2 +} אינדיקטורים, כגון הגמלים הצהובים, שימשו גם בהצלחה כדי לחקור את הדינמיקה של מגוון של Ca^{2 +} אירועי איתות במפעלים^{19,20,21,22,23,24}. חיישנים אלה תואמים לגישות הדמיה ובדרך כלל מורכבים מ- Ca^{2 +} חלבון מחייב calmodulin (CaM) ופפטיד מחייב CaM (M13) מתוך קינאז שרשרת אור מיוסין, כל התמזגו בין שני חלבוני פלואורופור, בדרך כלל חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וגרסה חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)¹⁰. Ca²⁺ מחייב CaM מקדם את האינטראקציה בין CaM ו M13 המוביל לשינוי קונפורמציה של החיישן. שינוי זה מקדם העברת אנרגיה בין CFP ו- YFP, אשר מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות של YFP תוך הפחתת פליטת הפלואורסצנטיות מן CFP. ניטור מעבר זה מ- CFP לפלואורסצנטיות YFP מספק מדד לעלייה ברמת Ca²⁺ . בנוסף לחיישני FRET אלה, חלבון פלואורסצנטי יחיד (FP)מבוסס Ca²⁺ biosensors, כגון GCaMP ו- R-GECO, תואמים גם הם לגישות הדמיה צמחית ומשמשים באופן נרחב לחקר [Ca²⁺] שינויים_בציט בשל הרגישות הגבוהה שלהם וקלות השימוש^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs מכילים GFP יחיד שעבר מוטציה מעגלית (cp), שוב התמזגו עם CaM ופפטיד M13. האינטראקציה התלויה ב- Ca²⁺בין CaM ל- M13 גורמת לשינוי קונפורמי בחיישן המקדם שינוי במצב הפרוטונציה של cpGFP, ומשפר את אות הפלואורסצנטי שלו. לכן, כמו Ca^{2 +} רמות עלייה, אות cpGFP עולה.

כדי לחקור את הדינמיקה של Ca^{2 +} אותות שנוצרו בתגובה לפצעים מכניים או האכלת אוכלי עשב, השתמשנו בצמחי תלתנא ערבידופסיס מהונדסים המבטאים גרסה GCaMP, GCaMP3, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב⁶. גישה זו הצליחה לדמיין העברה מהירה של אות Ca²⁺ למרחקים ארוכים מאתר הפצע על עלה לצמח כולו. לכן, עלייה [Ca²⁺]_ציט זוהה מיד באתר הפצע אבל זה Ca^{2 +} אות הופץ אז לעלים השכנים דרך כלי הדם בתוך כמה דקות של פציעה. יתר על כן, מצאנו כי העברת אות הפצע המערכתי המהיר הזה מבוטלת בצמחי Arabidopsis עם מוטציות בשני גנים דמויי קולטן גלוטמט, קולטן גלוטמט כמו (GLR), GLR3.3, ו GLR3.6⁶. GLRs מופיעים לתפקד כמו חומצת אמינו מגודר Ca^{2 +} ערוצי מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים מגוונים, כולל תגובת פצע³, צמיחת צינור אבקה³¹, פיתוח שורש³², תגובה קרה³³, וחסינות מולדת³⁴. למרות פונקציה פיזיולוגית רחבה ומובנה זו של GLRs, מידע על המאפיינים הפונקציונליים שלהם, כגון הספציפיות שלהם ליגנד, סלקטיביות היונים, לוקליזציה תת תאית, מוגבלים³⁵. עם זאת, מחקרים אחרונים דיווחו כי GLR3.3 ו GLR3.6 הם מקומיים פלום ו xylem, בהתאמה. ל- GLRs של צמחים יש קווי דמיון לקולטני גלוטמט יונוטרופיים (iGluRs)³⁶ ביונקים, המופעלים על ידי חומצות אמינו, כגון גלוטמט, גליצין ו- D-serine במערכת העצבים של היונקים³⁷. אכן, הוכחנו כי היישום של גלוטמט 100 מ"מ, אבל לא חומצות אמינו אחרות, באתר הפצע גורם מהיר, למרחקים ארוכים Ca^{2 +} אות Arabidopsis, המציין כי גלוטמט חוץ תאיים סביר פועל כאות פצע בצמחים⁶. תגובה זו מבוטלת glr3.3/glr3.6 מוטנט מציע כי גלוטמט עשוי לפעול דרך אחד או שניהם של ערוצים אלה דמויי קולטן ואכן, AtGLR3.6 הוכח לאחרונה להיות מגודר על ידי רמות אלה של גלוטמט³⁸.

בצמחים, בנוסף לתפקידו כחומצת אמינו מבנית, גלוטמט הוצע גם כרגולטור התפתחותי מרכזי³⁹; עם זאת, הדינמיקה המרחבית והטמפורלית שלו מובנת היטב. בדיוק כמו Ca^{2 +}, מספר אינדיקטורים מקודדים גנטית גלוטמט פותחו כדי לפקח על הדינמיקה של חומצת אמינו זו בתאים^{חיים 40,41}. iGluSnFR הוא ביו-סנסור גלוטמט יחיד מבוסס GFP המורכב מ- cpGFP וחלבון מחייב גלוטמט (GltI) מ Escherichia coli^42,43. השינוי הקונפורמי של iGluSnFR, המושרה על ידי גלוטמט מחייב GltI, תוצאות פליטת פלואורסצנטיות GFP משופרת. כדי לחקור אם גלוטמט חוץ-תאי פועל כמולקולה איתות בתגובת פצע הצמח, חיברנו את רצף iGluSnFR עם רצף הפרשת פפטיד אות chitinase בסיסי (CHIB-iGluSnFR) כדי להתאים את biosensor זה בחלל האפופלסטיק⁶. גישה זו אפשרה הדמיה של כל שינוי בריכוז הגלוטמט האפופלוסי ([Glu]_apo) באמצעות צמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חיישן זה. גילינו עליות מהירות באות iGluSnFR באתר הפציעה. נתונים אלה תומכים ברעיון כי גלוטמט דולף מתוך התאים הפגועים / רקמות כדי apoplast על הפציעה ופועל כאות נזק הפעלת GLRs ומוביל למרחקים ארוכים Ca^{2 +} אות בצמחים⁶.

כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת באמצעות biosensors מקודדים גנטית כדי לפקח ולנתח את הדינמיקה של Ca²⁺ למרחקים ארוכים אותות גלוטמט חוץ תאיים בתגובה לפציעה⁶. הזמינות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה וצמחים מהונדסים המבטאים ביו-סנסורים מקודדים גנטית מספקת גישה רבת עוצמה אך מיושמת בקלות לזיהוי אותות למרחקים ארוכים המועברים במהירות, כגון גלי Ca²⁺ .

1. הכנת חומר צמחי

1. במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל, פני השטח מעקרים את הזרעים של הצמח Arabidopsis thaliana (הצטרפות קול-0) המבטאים GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR על ידי טלטול עם 20% (v /v) NaClO במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף 5 פעמים עם מים מזוקקים סטריליים.
   הערה: הקווים המהונדסים של Arabidopsis המבטא GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR תוארו בעבר⁶.
2. במכסה המנוע סטרילי, לזרוע 13 משטח מעוקר זרעים על צלחת פטרי פלסטיק 10 ס"מ מרובע מלא 30 מ"ל סטרילי (autoclaved) Murashige ו Skoog (MS) בינוני [1x MS מלחים, 1% (w/v) סוכרוז, 0.01% (w/v) מיונוציטול, 0.05% (w/v) MES ו-0.5% (w/v) מסטיק גלן; pH 5.7 מותאם עם 1N KOH]. החלף את המכסה ולעטוף עם קלטת כירורגית.
3. לאחר הדגירה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 ימים, למקם את הצלחות אופקית ב 22 מעלות צלזיוס בתא צמיחה תחת אור רציף (90-100 מיקרומול m^-2 s^-1) במשך כ 2 שבועות לפני השימוש. לאחר שבועיים, לספור את מספר העלים Arabidopsis מן הבכור לצעיר⁴⁴ (איור 1). תגובות הפצע מעדיפות לעבור מהעלה הפגום (n) לעלים ממוספרים n ± 3 ו- n ± 5⁶.
   הערה: בפרוטוקול זה, צלחת פטרי תיפתח להדמיית הפצע ואפקטי גלוטמט תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן, השלבים הבאים בניסוי זה צריכים להתבצע בתנאי חדר מבוקר טמפרטורה ולחות. הסיבה לכך היא כי Ca^{2 +} אותות הם גם עוררו על ידי שינויים בתנאים סביבתיים אלה. ידוע גם כי האור הכחול, הנפלט מהמיקרוסקופ במהלך ההקלטה לצורך עירור הפלואורסצנטיות של חלבון הביוסנסור, עשוי לגרום לעלייה של ריכוז Ca²⁺ ציטוזולי⁴⁵ ולכן יש להסתגל להקרנת האור הכחול במשך מספר דקות לפני תחילת הניסוי.

2. הכנה כימית

1. המסת L-גלוטמט במדיום צמיחה נוזלי [1/2x MS מלחים, 1% (w / v) סוכרוז ו 0.05% (w / v) MES; pH 5.1 מותאם עם 1N KOH] כדי להפוך פתרון עבודה 100 מ"מ.
   הערה: יש להימנע משימוש במלחי גלוטמט כגון נתרן גלוטמט למניעת השפעות אפשריות הקשורות לקטיון על הדינמיקה של Ca²⁺ .

3. הגדרת מיקרוסקופ וביצוע הדמיה בזמן אמת

1. הפעל את סטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי הממונע המצויד בעדשה אובייקטיבית 1x (NA = 0.156) ומצלמת sCMOS (איור 2)וקבע את תצורת הגדרות ההתקן להקרין עם אור עירור של 470/40 ננומטר ולרכוש אור פליטה העובר דרך מסנן 535/50 ננומטר.
   הערה: כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיש ל- GFP יכול לשמש לגילוי אותות GCaMP3 ו- iGluSnFR בזמן אמת, אך עדשה אובייקטיבית בהספק נמוך ומצלמה רגישה מאוד עם שבב SCMOS רחב מומלץ לרכוש אותות מהמפעל כולו. מטרת ההספק הנמוך מאפשרת הדמיה של תגובת מפעל ערבידופסיס שלם ושימוש במצלמה רגישה ביותר מאפשר רכישת נתונים מהירה הדרושה כדי ללכוד את מהלך הזמן המהיר של גל Ca²⁺ המופעל על ידי פצעים. עבור מיקרוסקופ הפלואורסצנטי המשמש במחקר זה, הערכים המרביים של שדה הראייה והרזולוציה הזמנית הם 3 ס"מ x 3 ס"מ ו- 30 מסגרות לשנייה (fps), בהתאמה.
2. מוציאים את המכסה ומניחים את המנה מתחת לעדשה האובייקטיבית.
3. בדוק את אות הפלואורסצנטיות מהצמח ולאחר מכן המתן כ-30 דקות בחושך עד שהצמחים יתאימו את עצמם לתנאים הסביבתיים החדשים. שלב הסתגלות זה נדרש מכיוון ששינויים בלחות מעוררים [Ca²⁺] העלאת_ציט בצמחים שעלולים להפריע לכל אירוע הקשור לפצע.
4. התאם את המיקוד וההגדלה כדי לראות את הצמח כולו בשדה הראייה. בפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בהגדלה של 0.63x.
5. לפני שתתחיל בהדמיה בזמן אמת, הגדר את פרמטרי הרכישה כדי לזהות את אותות הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנת הדמיה של מיקרוסקופ. ההגדרות עבור דימות בפרוטוקול הנוכחי הן: זמני חשיפה ומרווח מוגדרים ל- 1.8 שניות ו- 2 שניות (כלומר, 0.5 fps), בהתאמה. הגדר את זמן ההקלטה ל- 11 דקות.
6. תמונה במשך 5 דקות לפני תחילת הניסוי כדי להסתגל הצמח להקרין אור כחול מן המיקרוסקופ, ואז להתחיל להקליט על ידי לחיצה על הפעל עכשיו, או הפקודה המקבילה בתוכנת מיקרוסקופ בשימוש. כדי לקבוע את הפלואורסצנטיות הבסיסית הממוצעת, רשום לפחות 10 מסגרות (כלומר, לפחות 20 שניות בפרוטוקול הנוכחי) לפני יישום פציעה או גלוטמט (ראה סעיף 4).
   1. להדמיה בזמן אמת של שינויים באפו [Ca^{2+ ]}ו-[Glu],_חתכו את הפטיולה או את האזור האמצעי של עלה L1 במספריים(איור 3 ואיור 4).
   2. להדמיה בזמן אמת של שינויים_בציט [Ca^{2+ ]}המופעלים על-ידי גלוטמט, חותכים את הקצה (כ-1 מ"מ מקצה) של עלה 1 על פני הווריד הראשי עם מספריים. לאחר תקופת החלמה של 20 דקות לפחות, יש למרוח 10 μL של 100 מ"מ גלוטמט על פני השטח החתוכים של העלה (איור 5).
      הערה: חיתוך מראש זה היה הכרחי כדי לאפשר גישה גלוטמט apoplast העלה על מנת לעורר תגובות. בנוסף, החלת טיפת מים מזוקקים על פני השטח החתוכים של עלה L1 נמצאה קריטית כדי למנוע מהדגימות להתייבש במהלך ההתאוששות לפני החלת גלוטמט.
7. לאחר סיום ההקלטה של 11 דקות, שמור את הנתונים.

4. ניתוח נתונים

1. לניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן, הגדירו אזור עניין (ROI) במקום שבו יש לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות (איור 6 ואיור 7). לחישוב המהירות של גל Ca²⁺ , הגדר 2 החזרי ROIs (ROI1 ו- ROI2) לניתוח. בתוכנת ההדמיה, לחץ על מדידת זמן | הגדרת | מעגל , עיגול. למדוד את המרחק בין ROI1 ו ROI2 על ידי לחיצה על ביאורים ומדידה | | אורך קו פשוט (איור 6).
2. מדוד את ערכי הפלואורסצנטיות הגולמיים (F) בכל החזר על ההשקעה לאורך זמן על-ידי לחיצה על מדידה. יצא נתונים גולמיים לתוכנת גיליון אלקטרוני כדי להמיר את אות הפלואורסצנטי למספרים בכל נקודת זמן על-ידי לחיצה על הכל ל- Excel | יצא.
3. קבע את ערך הפלואורסצנטיות הבסיסי, המוגדר כ- F₀, על-ידי חישוב הממוצע של F מעל 10 המסגרות הראשונות (כלומר, לפני הטיפול) בנתונים המוקלטים.
4. נרמל את נתוני F (על-ידי חישוב ΔF/F) באמצעות המשוואה ΔF/F = (F-F₀)/F₀, כאשר ΔF הוא השינוי תלוי הזמן בפלואורסצנטיות.
5. עבור ניתוח גל מהירות גל Ca²⁺ , הגדר נקודת עליית אות משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש כמייצג זיהוי של עלייה של Ca²⁺ בכל החזר השקעה (t₁ ו- t₂) באמצעות הקריטריון של עלייה ל- 2× סטיית התקן (2x SD) המחושבת מנתוני F₀ באמצעות תוכנה סטטיסטית. 95% מנתוני_{ה-F 0} נופלים בטווח של 2x SD מהממוצע, מה שמצביע על כך שעליית האות מעל רמה זו במקרה היא ≤5%. חשב את הפרש הזמן של עליית Ca^{2+ בין} החזר על ההשקעה ל- ROI2 [t₂- t₁ השהיית זמן (Δt)]ומדוד את המרחק בין החזר על ההשקעה ל- ROI2 ולאחר מכן קבע את המהירות של כל גל Ca²⁺ .

הפצת אותות של [Ca2+]ct ו- [Glu]apo בתגובה לפציעה מוצגת באיור 3, איור 4, סרט S1וסרט S2. חיתוך פטיולה של העלה 1 בצמחים המבטאים GCaMP3 (ב 0 s) הוביל לעלייה משמעותית [Ca2+]ציט כי היה במהירות המושרה באופן מקומי דרך כלי הדם (ב 40 s)(איור 3 ו סרט S1). לאחר מכן, האות הופץ במהירות לעלים שכנים (דף 3 ו-6) תוך דקות ספורות (ב-80 שניות)(איור 3 וסרט S1).

עם חיתוך עלה 1 בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR, עלייה מהירה [גלו]apo נצפתה סביב האזור לחתוך (ב 2 s). אות זה הופץ דרך כלי הדם באופן מקומי תוך דקות ספורות (ב-160 שניות), אך לא נצפה בעלים מערכתיים(איור 4 וסרט S2).

להדמיה בזמן אמת של הפצת אותות Ca2+ המופעלת על ידי יישום גלוטמט, הקצה (כ -1 מ"מ מקצה) של עלה 1 בצמחים המבטאים GCaMP3 נחתך כפי שמוצג באיור 5A ובסרט S3. חיתוך קצה של דף 1 גרם לעלייה מקומית [Ca2+]cyt (ב 40 s) אבל אות זה נעלם בתוך כמה דקות (ב 124 s). לאחר המתנה של כ 10 דקות עבור הצמח להתאושש, 10 μL של 100 מ"מ גלוטמט הוחל על משטח לחתוך של עלה 1, אשר גרם לעלייה מהירה, משמעותית של [Ca2 +]ציט מקומי (ב 56 s) ו התפשטות אות עלים דיסטליים (ב 104 s) (איור 5B וסרט S4).

כדי למדוד את השינויים ב-[Ca2+]cyt הנגרמים על ידי פציעה בעלה המערכתי, נקבעו שני ROIs (ROI1 ו- ROI2) באזור הבסיס ובקצה העלה 6 בצמחים המבטאים GCaMP3 כפי שמוצג באיור 6A. שינוי מסלול הזמן של עוצמת האות GCaMP3 ב-ROI1 וב-ROI2 עם חיתוך הפטיול של דף 1 נמדד (איור 6B). עלייה משמעותית של [Ca2+]cyt ב ROI1 זוהה מוקדם יותר מזה של ROI2 (איור 6B). [Ca2+] ה-cyt הגיע לשיא של כ-100 שניות לאחר פציעה, נמשך יותר מ-10 דקות והציג שני שלבים (איור 6B).

כדי לקבוע את המהירות של גל Ca2+ על פצעים מכניים, נקודת הזמן של עליית אות משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש ב- ROI1 ו- ROI2 נקבעה (השהיית זמן; ראה סעיף 4) (איור 6C). מכיוון שהמרחק בין ROI1 ל-ROI2 היה 2.7 מ"מ במקרה זה (איור 6A),מהירות האות Ca2+ בעלה 6 חושבה כ- 0.15 מ"מ/s. כדי למדוד את שינוייהאפו [Glu] בתגובה לנזק המכני, ROI1 נקבע בקרבת אתר החיתוך של העלה המסומן כ- L1 כפי שמוצג באיור 7A. [גלו] חתימת אפו ב-ROI1 הציגה שיא בודד של כ-100 שניות עם פציעתה (איור 7B).

איור 1: מספור עלי רוזט ערבידופסיס. עלי Arabidopsis ממוספרים מהמבוגר לצעיר ביותר (פאנל שמאלי). דיאגרמה סכמטית של מיקום העלים מצוינת בלוח הימני. L: עלה, ג: קוטילדון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מיקרוסקופ פלואורסצנטי המשמש במחקר זה. [Ca2+]ציט ודינמיקתאפו [גלו] צולמו עם סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. R: שלט רחוק, O: 1x עדשה אובייקטיבית, C: מצלמת sCMOS, T: צינור הטיה Trinocular, S: שלב, P: חומר צמחי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שידור אותות Ca2+ למרחקים ארוכים הנגרמים על-ידי פצעים. חיתוך פטיול (חץ לבן, 0 s) של עלה 1 (L1) במפעל המבטא GCaMP3 עורר עלייה מקומית [Ca2+]cyt (חץ אדום, 40 s) שהועבר עלים מערכתיים [עלה 3 (L3) ועלה 6 (L6)] (חצים כתומים, 80 s). סרגל קנה מידה, 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: העלאתאפו המופעלת על-ידי פצעים. חיתוך העלה 1 (L1) (חץ לבן, 0 s) בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR גרם לעלייה מהירה שלאפו [גלו] (חץ אדום, 80 s) שהתפשט דרך כלי הדם (חץ כתום, 160 s). סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: שידור אותות Ca2+ למרחקים ארוכים המופעל על-ידי גלוטמט. (A) חיתוך הקצה (כ- 1 מ"מ מקצה) של עלה 1 (L1) בצמחים המבטאים GCaMP3 (חץ לבן, 0 ים) גרם לעלייה [Ca2+]ציט (חץ אדום, 40 שניות). (B)יישום של 100 מ"מ גלוטמט למשטח לחתוך של L1 (חץ לבן, 0 s) גרם מקומי [Ca2+] עלייתציט (חץ אדום, 56 s) כי הופץ במהירות עלים דיסטליים [למשל, עלה 3 (L3), עלה 4 (L4), ועלה 6 (L6)] (חצים כתומים, 104 s). סרגלי קנה מידה, 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: [Ca2+] חתימתציט בעלים מערכתיים בתגובה לפציעה מכנית. (A) תמונה מורחבת של דף 6 (L6) בצמחים המבטאים GCaMP3 מוצגת באיור 3. ROI1 (עיגול כחול) ו ROI2 (עיגול ורוד) נקבעו באזור הבסיס והקצה, בהתאמה. חץ לבן מציין את האתר החתוך של פטיולה של עלה 1 (L1). במקרה זה, המרחק בין ROI1 ו ROI2 היה 2.7 מ"מ. (B)כימות של [Ca2 +] חתימותcyt ב ROI1 ו ROI2. שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות נותחו באמצעות תוכנת הדמיה. (ג)מעקב מורחב אחר נתונים ב- (B) בין 0 s ל- 80 s. נקודות איתור של עלייה של Ca2+ ב- ROI1 ו- ROI2 הוגדרו כ- t1 ו- t2, בהתאמה, תוך שימוש כקריטריון עלייה עד פי 2 סטיית התקן של ערכי prestimulation (2x SD, קו מנוקד). הערך של t2 - t1 הוגדר כהשהיית זמן (Δt) בפרוטוקול הנוכחי. החץ השחור מציין את זמן החיתוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: חתימתאפו [Glu] בתגובה לפציעה מכנית. (A) תמונה מורחבת של דף 1 (L1) בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR מוצגת באיור 4. ROI1 נקבע בקרבת אתר הקיצוץ. חץ לבן מציין את האזור שנחתך. (B)כמות חתימתאפו [Glu] ב- ROI1 מנוטרת באמצעות תוכנת דימות. החץ השחור מציין את זמן החיתוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט S1: למרחקים ארוכים Ca2 + שידור לאחר פציעה מכנית. פצעים מכניים בפטיולה של עלה 1 (L1) גרמו לעלייה [Ca2+]ציט המועברת לעלים דיסטליים [למשל, דף 3 (L3) ועלה 6 (L6)]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S2: העלאת רמות גלוטמט אפופלסטי בתגובה לחיתוך. פציעה מכנית של העלה 1 (L1) גרמה לעלייהמיידית באפו[גלו] . אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S3: העלאת [Ca2+]רמותציט בתגובה לחיתוך. פציעה מכנית בקצה עלה 1 (L1) גרמה לגובהציט מיידי, מקומי [Ca2+]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S4: יישום של גלוטמט מפעיל מערכתית [Ca2+]ציט מגביר. יישום גלוטמט של 100 מ"מ הפעיל שידור Ca2+ לעלים מערכתיים [למשל, דף 3 (L3), עלה 4 (L4) ועלה 6 (L6)]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים.