שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון קיצור סרקומר באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים עם חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קיצור סרקומר של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים (PSC-CMs) יכולים להיות מיוצרים הן מתאי גזע עובריים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים (ES/iPS). תאים אלה מספקים מקורות מבטיחים למידול מחלות לב. עבור קרדיומיופתיות, קיצור sarcomere היא אחת ההערכות הפיזיולוגיות הסטנדרטיות המשמשות עם קרדיומיוציטים למבוגרים כדי לבחון את פנוטיפים המחלה שלהם. עם זאת, השיטות הזמינות אינן מתאימות להערכת התכווצות של PSC-CMs, שכן לתאים אלה יש סרקומרים לא מפותחים שאינם נראים תחת מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. כדי לטפל בבעיה זו ולבצע קיצור סרקומר עם PSC-CMs, נעשה שימוש בחלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים והדמיה חיה פלואורסצנטית. קווי Z דקים וקו M שוכנים בשני הקצוות ובמרכז סרקומר, בהתאמה. חלבוני קו Z - α-Actinin (ACTN2), טלתונין (TCAP) וחלבון LIM הקשור לאקטין (PDLIM3) - וחלבון קו M אחד - מיומיסין-2 (Myom2) - תויגו בחלבונים פלואורסצנטיים. חלבונים מתויגים אלה יכולים לבוא לידי ביטוי מאללים אנדוגניים כמו דפיקות או מווירוסים הקשורים אדנו (AAVs). כאן, אנו מציגים את השיטות להבדיל בין תאי גזע של עכברים ופלוריפוטנטים אנושיים לקרדיומיוציטים, לייצר AAVs, ולבצע ולנתח הדמיה חיה. אנו מתארים גם את השיטות לייצור חותמות פולידימתילסילוקסן (PDMS) עבור תרבות בדוגמת PSC-CMs, המאפשרת ניתוח של קיצור סרקומר עם חלבונים מתויגים פלואורסצנטית. כדי להעריך קיצור של sarcomere, תמונות זמן לשגות של התאים הפועמים נרשמו בקצב מסגרת גבוה (50-100 פריימים לשנייה) תחת גירוי חשמלי (0.5-1 הרץ). כדי לנתח את אורך הסרקום במהלך התכווצות התא, התמונות המוקלטות של זמן לשגות היו כפופות ל- SarcOptiM, תוסף ל- ImageJ / פיג'י. האסטרטגיה שלנו מספקת פלטפורמה פשוטה לחקירת פנוטיפים של מחלות לב ב- PSC-CMs.
מבוא
מחלות לב וכלי דם הן הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם1 וקרדיומיופתיה מייצגת את הגורם השלישי למוות הקשור לב2. קרדיומיופתיה היא קבוצה קולקטיבית של מחלות המשפיעות על שרירי הלב. ההתפתחויות האחרונות של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPS) וההבחנה המוכוונת של תאי IPS כלפי קרדיומיוציטים (PSC-CMs) פתחו את הדלת לחקר קרדיומיוציטים עם גנום המטופל כמודל במבחנה של קרדיומיופתיה. תאים אלה יכולים לשמש כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות לב, כדי לרהור המנגנונים המולקולריים שלהם, ולבדוק מועמדים טיפוליים שונים3. יש כמות עצומה של עניין, ולכן, תאי iPS שמקורם בחולה נוצרו (למשל, קרדיומיופתיה היפרטרופית [HCM]
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטים של עכבר
- תחזוקה של תאי ES של עכבר
- אמצעי תחזוקה: יש לערבב 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 5 מ"ל של L-אלנין-L-גלוטמין, 5 מ"ל של חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 5 מ"ל של 100 מ"ל נתרן פירובט, ו-909 מיקרול של 55 מ"מ 2-מרקפטואתנול עם 450 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי בגלזגו (GMEM). תוספת גורם מעכב לוקמיה (LIF), CHIR-99021, ו PD0325901 בריכוז סופי של 1000 U/mL, 1 μM, ו 3 מיקרומטר, בהתאמה. לחטא את המדיום באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- בינוני FBS: לערבב 55 מ"ל של FBS, 5.5 מ"ל של L-אלנין-L-גלוטמין, 5.5 מ"ל של נתרן פירובט, ו 5.5 מ"ל של NEAA עד 500 מ"ל של בינוני נשר שונה של DULBECCO (DMEM) גלוקוז גבוה. מסננים את המדיום באמצעות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מדידת קיצור סרקומר באמצעות שורות כתב PSC-CMs. PSC-CMs שכותרתו Sarcomere שימשו למדידת קיצור סרקומר. הקווים מבטאים את Myom2-RFP ו ACTN2-mCherry מלוצי אנדוגני. TagRFP הוכנס ל Myom2, קידוד M-חלבונים כי לוקליזציה לקו M, בעוד mCherry היה דפק ב ל ACTN2, קידוד α-Actinin, אשר לוקליזציה לקו Z18,25. תמונות של זמן לשגות הושגו ושימשו לקביעת קיצור סרקומר כפי שמוצג באיורים 1 ו-2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
PSC-CMs יש פוטנציאל גדול להיות מנוצל כפלטפורמת מביהה כדי מודל מחלות לב ולבדוק את ההשפעות של תרופות. עם זאת, יש לקבוע תחילה שיטה מדויקת ומאוחדת להערכת פונקציות PSC-CMs. רוב הבדיקות התפקודיות עובדות עם PSC-CMs, למשל, אלקטרופיזיולוגיה, סידן ארעי, ומטבוליזם26, ואחד המחקרים הראשונים שמקורם בחולה PSC-CM היה על תסמונת QT ארוכה27. עם זאת, התכווצות, אחד התפקידים החשובים ביותר של cardiomyocyte, עדיין קשה להעריך. עם קרדיומיוציטים למבוגרים, קיצור sarcomere נמצא בשימוש נרחב. לע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
H.U. הגיש פטנט הקשור לכתב יד זה.
תודות
ברצוננו להודות לכל חברי המעבדה באגף לרפואה רגנרטיבית באוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י על הדיון המועיל והסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי המענקים של הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED; JP18bm0704012 ו JP20bm0804018), האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS; JP19KK0219), וחברת התפוצה היפנית (המענק למחקר בסיסי) ל- H.U.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1-תיוגליצרול | סיגמא-אולדריץ' | M6145-25 | |
| 2-מרקפטואתנול (55 מ"מ) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) פולימר, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| צלחת הדמיה 35 מ"מ עם כיסוי פולימרי (µ-צלחת 35 מ"מ, גבוהה) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (וקטורים; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) | Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | הכנסנו קסטה עמידה ל-IRES-puromycin ל-3' UTR של לוקוס TNNT2 ו-mCherry סביב קודון העצירה של ACTN2 בקו 610B1 hiPSC, בהתאם לשיטה שתוארה במקום אחר (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| תוסף B-27 (50X), תוסף | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| , מינוס אינסולין | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| תוסף B27 (50X), מינוס ויטמין A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µ L) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S הידרוכלוריד | פוג'יפילם | 029-18701 | |
| BMP-4, אנושי, רקומביננטי, | מו"פ & די סיסטמס, בע"מ | 314-BP-010 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא-אולדריץ' | A4503-100g | |
| C59, אנטגוניסט Wnt (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| תוכנת ציור CAD, | רוברט מקניל ושות', וושינגטון, ארה"ב | Rhinoceros 6.0 | |
| יחידת אולטרה-סינון צנטריפוגלית (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| תחריט כרום | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., יפן | N14B | |
| מסכת כרום מצופה AZP1350 | Clean Surface Technology Co., יפן | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE נושא משקעים (20 מ"ג/מ"ל גליקוגן, 3 מ' נתרן אצטט (pH 5.2))Takara | 9094 | ||
| Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM) - סוכר גבוה | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM) - גלוקוז גבוה, ללא נתרן פירובט | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| אתנול (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| סרום בקר עוברי | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, אנושי, רקומביננטי, | R& די סיסטמס, בע"מ | 345-FG-025 | |
| גורם גדילה פיברובלסטי (בסיסי), אנושי, רקומביננטי | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| ג'לטין מאבקת עור חזיר | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| גלזגו מדיום חיוני מינימלי (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| צלחות תרבית תחתונות זכוכית | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| חזיר& rsquo; s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Dulbecco's Modified Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (תוסף GlutaMAX, 200 מ"מ) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-חומצה אסקורבית מלח נתרן | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 שבר ( LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| מסכת יישור | Optical Co., Ltd., יפן | PEM-800 | |
| כלי ליתוגרפיה ללא מסכה | NanoSystem Solutions, Inc., יפן | D-Light DL-1000 | |
| MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV יחידת מסנן מזרק, 0.45 ומיקרו; m, PVDF (0.45-ומיקרו; מסנן m) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | פותח במאמר הקודם שלנו (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 מצלמת CMOS דיגיטלית | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| פטרי צלחת | Sansei רפואי ושות' בע"מ | 01-004 | |
| פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| אלסטומר פולידימתילסילוקסן (PDMS) | Dow Corning Corp., MI, ארה"ב סילפוט | 184 | |
| פוליאתילנימין MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| מפתח פוטו-רזיסט חיובי | טוקיו Ohka Kogyo Co. בע"מ, יפן | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR ירוק מאסטר מיקס | תרמו פישר מדעי | A25742 | |
| פרוטאינאז K | Takara | 9034 | |
| פורומיצין דיהידרוכלוריד | פוג'יפילם וואקו | 166-23153 | |
| רקומביננטי אדם/עכבר/חולדה אקטיבין A חלבון | R& די סיסטמס, בע"מ | 338-AC-050 | |
| פרוטאז רקומביננטי דמוי טריפסין (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 | בינוני תרמו פישר סיינטיפיק | 11875-119 | |
| פרוסת סיליקון | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., יפן | NA | |
| נתרן פירובט (100 מ"מ) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., יפן | MS-A100 | |
| Spininng מיקרוסקופיה קונפוקלית | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, עכבר, רקומביננטי, תמיסה (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, ארה"ב | SU-8 3010 | |
| SU-8 מפתח | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, ארה"ב | מפתח | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| גורם גדילה אנדותל כלי דם-A165(VEGF), אנושי, רקומביננטי | Fujifilm wako | 226-01781 |
מקורות
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
