Method Article

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הליך לבטא ולטהר מיוסין 5a ואחריו דיון על אפיון שלה, באמצעות הרכב ומולקולה אחת במבחנה מיקרואורסצנטיות מבוססות בדיקות, וכיצד שיטות אלה ניתן לשנות עבור אפיון של מיוסין nonmuscle 2b.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני מיוסין לאגד אינטראקציה עם אקטין חוטי (F-actin) ונמצאים אורגניזמים על פני העץ phylogenetic. המבנה שלהם ואת המאפיינים אנזימטיים מותאמים לתפקוד מסוים שהם מבצעים בתאים. מיוסין 5a הולך תהליכית על F-actin כדי להעביר מלנוזומים ושלשלות בתאים. לעומת זאת, מיוסין 2b לא-מולקולרי פועל כחם דו קוטבי המכיל כ-30 מולקולות. הוא מזיז F-actin של קוטביות הפוכה לכיוון מרכז חוט, שבו מולקולות המיוסין פועלות באופן אסינכרוני כדי לקשור actin, להקנות שבץ כוח, ולנתק לפני חוזר על המחזור. מיוסין לא-נוסוס 2b, יחד עם המיוסין 2 איזופורמים אחרים שלה, יש תפקידים הכוללים הידבקות תא, ציטוקינזיס, ותחזוקת מתח. המכנוכימיה של מיוסין ניתן ללמוד על ידי ביצוע במבחנה תנועתיות ישבן באמצעות חלבונים מטוהרים. בפעולת ההזזה, המיוסין קשורים למשטח מיקרוסקופ המכסה את פני השטח ואת הפלואורסצנטיות שכותרתו F-actin, אשר ניתן לעקוב. עם זאת, במולקולה/אנסמבל התנועתיות, נצפתה F-actin קשורה לכיסוי ותנועה של מולקולות מיוסין שכותרתן פלואורסצנטית על F-actin נצפתה. בדו"ח זה, טיהור של מיוסין רקומביננטי 5a מתאי Sf9 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה הוא מתואר. לאחר מכן, אנו מתארים שתי בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית: בדיקת חוטי אקטן הזזה ובוחן תנועתיות הפוכה. מבדים אלה, ניתן לחלץ פרמטרים כגון מהירויות טרנסלוקציה actin ואורכי ריצה של מולקולה אחת ומהירויות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. טכניקות אלה ניתן ליישם גם כדי ללמוד את התנועה של חוטים בודדים של מיוסין לאmuscle 2 איזופורמים, נדון כאן בהקשר של מיוסין לאmuscle 2b. זרימת עבודה זו מייצגת פרוטוקול וסדרת כלים כמותיים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את דינמיקת המולקולה וההרכב הבודדת של מיוסין לא-מולקולריים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיוסינוס הם חלבונים מוטוריים המפעילים כוח על חוטי אקטין באמצעות האנרגיה המופקת מאדנוסין טריפוספט (ATP) הידרוליזה1. מיוסין מכילים תחום ראש, צוואר וזנב. התחום הראשי מכיל את אזור איגוד actin, כמו גם את האתר של כריכת ATP הידרוליזה. תחומי הצוואר מורכבים מוטיבים IQ, אשר נקשרים שרשראות אור, calmodulin, או חלבונים דמויי calmodulin2,3. לאזור הזנב יש מספר פונקציות ספציפיות לכל סוג של מיוסין, כולל אך לא רק עמעום של שתי שרשראות כבדות, כריכה של מולקולות מטען, ורגולציה של המיוסין באמצעות אינטראקציות autoinhibitory עם תחומי הראש1.

המאפיינים הרוטאליים של מיוסין משתנים מאוד בין השיעורים. חלק ממאפיינים אלה כוללים יחס חובה (השבר של המחזור המכני של מיוסין שבו myosin מחויב לפעול) ועיבוד (היכולת של מנוע לעשות צעדים מרובים על המסלול שלה לפני ניתוק)4. מעל 40 הכיתות של מיוסין נקבעו על סמך ניתוחירצף 5,6,7,8. מיוסין בכיתה 2 מסווגים "קונבנציונאלי" מאז הם היו הראשונים ללמוד; כל המעמדות האחרים של המיוסין מסווגים, אם כן, כ"לא שגרתיים".

מיוסין 5a (M5a) הוא מיוסין בכיתה 5 והוא מנוע תהליכי, כלומר הוא יכול לקחת צעדים מרובים לאורך actin לפני ניתוק. יש לו יחס חובה גבוה, המציין כי הוא מבלה חלק גדול מהמחזור המכני שלו מחויב לפעול9,10,11,12,13,14. במשותף עם מיוזינים אחרים, השרשרת הכבדה מכילה תחום מנוע N-terminal הכולל הן אקטין מחייב ואתר הידרוליזה ATP ואחריו אזור צוואר המשמש זרוע ידית, עם שישה מוטיבים IQ להיקשר שרשראות אור חיוניות (ELC) ו calmodulin (CaM)15. אזור הזנב מכיל סלילים מסלילים α-סליליים סליליים, אשר עמעמים את המולקולה, ואחריו אזור זנב כדורי למטען מחייב. הקינטיקה שלה משקפת את מעורבותה בהובלת מלנוזומים במלנוציטים ובריטיקולום אנדופלסמי בנוירונים פורקיניה16,17. M5a נחשב מנוע הובלת מטענים טיפוסי18.

מיוזינים מסוג 2, או מיוזינים קונבנציונליים, כוללים את המאוזינים המעצימים התכווצות של שלד, לב ושריר חלק בנוסף לאיזוסין לא-מומסקל 2 (NM2) איזופורמים, NM2a, 2b ו- 2c19. איזופורמים NM2 נמצאים ציטופלסמה של כל התאים ויש להם תפקידים משותפים ציטוקינזה, הידבקות, מורפוגנזה רקמות, ונדידת תאים19,20,21,22. מאמר זה דן פרוטוקולי מיוסין קונבנציונליים בהקשר של מיוסין לא 1000 (NM2b)23. NM2b, בהשוואה ל- M5a, יש יחס חובה נמוך והוא איטי יותר אנזימטית עםV מקסימום של 0.2 s-123 לעומתV max של M5a של ≈18 s-124. ראוי לציין, מבנים NM2b חתוכים עם שני ראשים אינם נעים בקלות על actin; במקום זאת, כל מפגש עם actin תוצאות שבץ כוח ואחריו דיסוציאציה של המולקולה25.

NM2b מכיל שתי שרשראות כבדות מיוסין, כל אחת עם דומיין ראש כדורי אחד, זרוע ידית אחת (עם ELC אחד ושרשרת אור רגולטורית אחת (RLC)), וגזע מוט סליל סליל / זנב סליל α סלילי, באורך של כ -1,100 חומצות אמינו, המבליט את שתי השרשראות הכבדות הללו. הפעילות אנזימטית ומצב מבני של NM2b מוסדרים על ידי זרחן של RLC23. NM2b לא מפוזר, בנוכחות ATP וכוחות יוניים פיזיולוגיים (כ 150 מ"מ מלח), מאמץ קונפורמציה קומפקטית שבה שני הראשים להשתתף באינטראקציה אסימטרית והזנב מתקפל בחזרה מעל הראשים בשני מקומות23. במצב זה, myosin אינו אינטראקציה חזקה עם actin ויש לו פעילות אנזימטית נמוכה מאוד. על זרחן RLC על ידי קטיעת שרשרת אור מיוסין תלוי מיוסין (MLCK) או קינאז חלבון הקשורים לרו, המולקולה משתרעת ומתחברת למיוזינים אחרים דרך אזור הזנב כדי ליצור חוטים דו קוטביים של כ -30 מולקולות מיוסין23. הזרחן הנ"ל של RLC מוביל גם לפעילות ATPase מוגברת המופעלת על ידי actin של NM2b על ידי כארבע פעמים26,27,28. סידור חוט דו קוטבי זה, הכולל מנועי מיוסין רבים בכל קצה, מותאם לתפקידים בתחזוקת התכווצות ומתח, שם ניתן להזיז חוטי אקטין עם קוטביות מנוגדת ביחס זה לזה23,29. בהתאם, NM2b הוכח לפעול כהרכב של מנועים בעת אינטראקציה עם actin. המספר הגדול של מנועים בתוך חוט זה מאפשרים חוטי NM2b לנוע באופן תהליכי על חוטי actin, מה שהופך את עיבוד חוטי הפריה ישון אפשרי לאפיין29.

בעוד התקדמות נעשתה בהבנת התפקיד של מיוסין בתא, יש צורך להבין את המאפיינים האישיים שלהם ברמת החלבון. כדי להבין אינטראקציות actomyosin ברמת אינטראקציה חלבון-חלבון פשוט, ולא בתוך תא, אנו יכולים לבטא ולטהר מיוסין רקומביננטי לשימוש במחקרים במבחנה. התוצאות של מחקרים כאלה אז ליידע mechanobiologists על המאפיינים הביופיסיים של מיוסין ספציפי כי בסופו של דבר לנהוג תהליכים תאיים מורכבים12,13,14,25,29. בדרך כלל, זה מושג על ידי הוספת תג זיקה למבנה מיוסין באורך מלא או חתוך וטיהור באמצעות כרומטוגרפיהזיקה 29,30,31. בנוסף, ניתן להנדס את המבנה כך שיכלול פלואורופור שניתן להקפיץ גנטית או תג לתיוג חלבונים עם פלואורופור סינתטי. על ידי הוספת תווית פלואורסצנטית כזו, ניתן לבצע מחקרי הדמיה של מולקולה אחת כדי להתבונן במכניקת מיוסין וקינטיקה.

לאחר הטיהור, המיוסין יכול להיות מאופיין במספר דרכים. פעילות ATPase יכולה להימדד בשיטות צבעוניות, המספקות תובנה לגבי צריכת האנרגיה הכוללת וזיקה לפעולה של המנוע בתנאים שונים32. כדי ללמוד על המכנוכימיה של תנועתיותה, נדרשים ניסויים נוספים. מאמר זה מפרט שתי שיטות מבוססות מיקרוסקופיה במבחנה, שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין את המאפיינים הססנים של חלבון מיוסין מטוהר.

הראשון של שיטות אלה הוא בדיקת חוט אקטן הזזה, אשר ניתן להשתמש בו כדי ללמוד כמותית את תכונות ההרכב של מנועי מיוסין, כמו גם ללמוד באופן איכותי את האיכות של אצווה של חלבון מטוהר33. למרות מאמר זה דן בשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) לבדיקה זו, ניסויים אלה יכולים להתבצע ביעילות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה המצויד במצלמה דיגיטלית, שנמצאת בדרך כלל במעבדות רבות34. בבחינה זו, שכבה רוויה של מנועי מיוסין מחוברת לכיסוי. זה יכול להתבצע באמצעות ניטרוצלולוז, נוגדנים, ממברנות, SiO2- משטחים נגזרים (כגון trimethylchlorosilane), בין היתר29,33,35,36,37,38. חוטי אקטין המסומנים בפלואורסצנטית מועברים דרך תא כיסויי השער, שעליו האקטין נקשר למיוסיפן המחובר לפני השטח. עם תוספת של ATP (וקינאזים בחקר NM2), התא הוא התמונה כדי לצפות טרנסלוקציה של חוטי actin על ידי מיוזינים כבול פני השטח. תוכנת מעקב יכולה לשמש כדי לתאם את המהירות והאורך של כל חוט אקטאין הזזה. תוכנת ניתוח יכולה גם לספק מידה של מספר חוטי actin נעים ונייחים, אשר יכול להיות שימושי כדי לקבוע את האיכות של הכנת מיוסין נתון. חלקם של חוטים תקועים יכול גם להיות מווסת בכוונה על ידי קשירת פני השטח של actin חלבונים אחרים ונמדד כדי לקבוע את התלות בעומס של מיוסין39. מכיוון שכל חוט אקטין יכול להיות מונע על ידי מספר רב של מנועים זמינים, בדיקה זו ניתנת לשחזור רב, כאשר המהירות הנמדדת הסופית חזקה להסתבכויות כגון שינויים בריכוז המיוסין ההתחלתי או נוכחות של גורמים נוספים בפתרון. משמעות הדבר היא שניתן לשנות אותו בקלות כדי ללמוד פעילות מיוסין בתנאים שונים, כגון זרחן שונה, טמפרטורה, כוח יוני, צמיגות פתרון, ואת ההשפעות של עומס המושרה על ידי צמיגי פני השטח. למרות גורמים כגון מיוסין חזק מחייב "ראשים מתים" מסוגל הידרוליזה ATP יכול לגרום חוטי actin תקוע, שיטות מרובות קיימות כדי למתן בעיות כאלה ולאפשר מדידות מדויקות. המאפיינים הקינטיים של מיוסין משתנים מאוד בין הכיתות, ובהתאם למיוסין הספציפי המשמש, מהירות גלישת חוטי האקטין בבדיקה זו יכולה להשתנות מתחת ל-20 ננומטר/שניה (מיוסין 9)40,41,ועד 60,000 ננומטר/שניה(Characean myosin 11)42.

הבחינה השנייה הפוך את הגיאומטריה של חוט ההזזה12. כאן, חוטי actin מחוברים משטח כיסוי ואת התנועה של מולקולות בודדות של M5a או של חוטים דו קוטביים בודדים של NM2b הם חזותיים. בדיקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את אורכי הריצה והמהירויות של מולקולות מיוסין יחיד או חוטים על actin. כיסוי מצופה בתרכובת כימית שחוסמת כריכה לא ספציפית ובמקביל מתפקדת את פני השטח, כגון ביוטין-פוליאתילן גליקול (ביוטין-PEG). התוספת של נגזרות אבידין מותאמות לאחר מכן ראשוניים את פני השטח ו actin biotinylated מועבר דרך התא, וכתוצאה מכך שכבה של F-actin קשור ביציבות לתחתית התא. לבסוף, מופעל ופלואורסצנטית שכותרתו מיוסין (בדרך כלל 1-100 ננומטר) זורם דרך התא, אשר לאחר מכן הוא התמונה להתבונן תנועת מיוסין מעל חוטי actin נייח.

שיטות אלה מייצגות שיטות מהירות וניתן לשחזור שניתן להשתמש בהן כדי לבחון את הדינמיקה של מיוסין לא-נואזמי ושרירים כאחד. דו"ח זה מתאר את הנהלים לטהר ולאפיין הן M5a והן NM2b, המייצגים מיוסין לא קונבנציונאלי וקונבנציונלי, בהתאמה. לאחר מכן דיון על כמה עיבודים ספציפיים myosin, אשר ניתן לבצע כדי להשיג לכידה מוצלחת של תנועה בשני סוגי הבחינה.

ביטוי וביולוגיה מולקולרית
יש לשכפל את ה- cDNA עבור המיוסין של העניין בווקטור pFastBac1 שונה המקודד עבור תג דגל מסוף C (DYKDDDDDK) אם הוא מבטא M5a-HMM, או תג דגל N-terminal אם הוא מבטא את המולקולה באורך מלא של NM2b23,43,44,45,46. תגי דגל מסוף C ב- NM2b גורמים לזיקה מוחלשת של החלבון לעמודת זיקת הדגל. לעומת זאת, החלבון המתויג על ידי דגל N בדרך כלל נקשר היטב לעמודת זיקת הדגל23. החלבון המתויג ב- N-סופני שומר על פעילות אנזימטית, פעילות מכנית ותקנה תלוית זרחן23.

במאמר זה, עכבר קטוע M5a כבד meromyosin (הממ) כמו מבנה עם GFP בין תג דגל ואת C-terminus של שרשרת כבד מיוסין שימש. שים לב שבניגוד ל- NM2b, ניתן לתייג ולטהר בהצלחה את M5a-HMM באמצעות תגי דגל N או C-terminal ובשני המקרים המבנה המתקבל יהיה פעיל. השרשרת הכבדה M5a נחתכה בחומצת אמינו 1090 ומכילה מקשר שלוש חומצות אמינו (GCG) בין GFP לאזור הסליל המפותל של M5a47. לא נוסף מקשר נוסף בין ה- GFP לתג FLAG. M5a-HMM בא לידי ביטוי בקלמודולין. מבנה NM2b האנושי באורך מלא בא לידי ביטוי בשיתוף עם ELC ו- RLC. N-termini של RLC הותך עם GFP באמצעות מקשר של חמש חומצות אמינו (SGLRS). מצורף ישירות לתג הדגל היה HaloTag. בין HaloTag ואת N-טרמינל של שרשרת כבד מיוסין היה מקשר עשוי שתי חומצות אמינו (AS).

שתי תכשירי המיוסין טוהרו מליטר אחד של תרבית תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס בצפיפות של כ 2 x 106 תאים / מ"ל. נפחי הבאקולווירוס עבור כל תת-ארון היו תלויים בריבוי הזיהום של הנגיף כפי שנקבע בהוראות היצרן. במקרה של M5a, תאים נדבקו במשותף עם שני baculoviruses שונים - אחד עבור calmodulin, ואחד עבור שרשרת כבדה M5a. במקרה של NM2b, תאים נדבקו במשותף עם שלושה וירוסים שונים - אחד עבור ELC, אחד עבור RLC, ואחד עבור שרשרת כבדה NM2b. עבור מעבדות העובדות עם מגוון של מיוסין (או חלבונים רב-קומתיים אחרים), גישה זו יעילה שכן היא מאפשרת שילובים רבים של שרשראות כבדות וקלות ושרשראות אור נפוצות כגון calmodulin ניתן לבצע שיתוף פעולה עם שרשראות כבדות מיוסין רבות ושונות. כל עבודת התא הושלמה בארון בטיחות ביולוגית עם טכניקה סטרילית נכונה כדי למנוע זיהום.

עבור הביטוי של M5a ו- NM2b, תאי Sf9 המייצרים את המיוסינוסים רקומביננטיים נאספו 2-3 ימים לאחר ההדבקה, באמצעות צנטריפוגה, ואוחסנו ב -80 °C (80 °F). כדורי תאים הושגו על ידי צנטריפוגה של תאי Sf9 נגועים במשותף ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות ב 2,800 x g. תהליך טיהור החלבון מפורט להלן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טיהור חלבונים

  1. תמה של תאים ומיצוי חלבונים
    1. הכן מאגר חילוץ 1.5x המבוסס על טבלה 1. סנן ואחסן ב- 4 °C (7°F).
    2. תתחיל להפשיר את כדורי התא על קרח. בעוד הכדורים מפשירים, תוספת 100 מ"ל של חוצץ החילוץ עם 1.2 mM dithiothreitol (DTT), 5 מיקרוגרם / mL leupeptin, 0.5 μM פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF) ושתי טבליות מעכב פרוטאז. שמור על קרח.
    3. לאחר הכדור הפשיר, להוסיף 1 מ"ל של מאגר החילוץ הנוסף לכל 10 מ"ל של תרבית התא. לדוגמה, אם כדורי התא נוצרו מ 500 מ"ל של תרבית התא, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל של מאגר החילוץ הנוסף לכדור.
    4. Sonicate כדורי התא תוך שמירה אותם על קרח. עבור כל גלולה, השתמש בתנאים הבאים: 5 s ON, 5 s OFF, משך של 5 דקות, כוח 4-5.
    5. לאסוף את כל ליסאט הומוגני לתוך ולהוסיף ATP (פתרון מלאי 0.1 M; pH 7.0) כך הריכוז הסופי של ATP הוא 1 mM. מערבבים במשך 15 דקות בחדר קר. ה- ATP מנתק מיוסין פעיל מ actin, ומאפשר לו להיות מופרד בשלב צנטריפוגה הבא. לכן, חיוני להמשיך לשלב הבא באופן מיידי כדי למזער את האפשרות לדלדול ATP ואיחוד מחדש לפעול.
    6. צנטריפוגות lysates ב 48,000 x גרם עבור 1 שעה ב 4 °C (70 °F). בזמן שזה קורה, להתחיל לשטוף 1-5 מ"ל של 50% רפש של שרף זיקה אנטי-דגל (עבור גלולה שנוצרה מ 1 ליטר של תאים) עם 100 מ"ל תמיסת מלח פוספט-חוצץ (PBS), על פי הוראות היצרן. לדוגמה, עבור 5 מ"ל של שרף, לשטוף 10 מ"ל של 50% רפש. בשלב הכביסה הסופי, resuspend את השרף עם 1-5 מ"ל של PBS עם מספיק נפח כדי ליצור תרחיף 50%.
    7. לאחר צנטריפוגה ליסאט, לשלב את supernatant עם שרף שטף slurry וסלע בעדינות בחדר הקר במשך 1-4 שעות. בזמן ההמתנה, הפוך את המאגרים המתוארים בטבלה 1 ולשמור אותם על קרח.
  2. הכנת טיהור זיקה דגל
    1. צנטריפוגות הפתרון בשלב 1.7 ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (7). השרף יהיה ארוז בתחתית הצינור. מבלי להפריע לשרף, הסר את הסופר-טבעי.
    2. Resuspend את השרף ב 50 מ"ל של חוצץ A כמפורט בטבלה 1 צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). מבלי להפריע לשרף, הסר את הסופר-טבעי.
    3. Resuspend את השרף ב 50 מ"ל של חוצץ B כמפורט בטבלה 1 צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). חזור על שלב זה פעם נוספת וחזק מחדש את השרף ב- 20 מ"ל של מאגר B. לאחר מכן, מערבבים את השרף ואת המאגר ביסודיות על ידי היפוך עדין של הצינור ביד כ 10 פעמים.
  3. אילוטציה וריכוז חלבונים
    1. הפוך 30 מ"ל של חוצץ Elution כמתואר בטבלה 1 ולתת לו לצנן על קרח.
    2. תציב את עמוד ההתחמקות בחדר קר. יוצקים בעדינות את שרף השרף לתוך העמוד. לשטוף את העמודה עם 1-2 אמצעי אחסון של מאגר B כמו שרף חבילות בתחתית, להבטיח כי השרף לא להתייבש.
    3. לזרום 1 מ"ל של מאגר Elution דרך השרף ולאסוף את הזרימה דרך בצינור 1.5 מ"ל. חזור על כך 12, 1 mL שברים נאספים.
    4. בשלב זה, לבצע מבחן ברדפורד גס על השברים כדי לקבוע באופן איכותי אילו שברים הם48המרוכז ביותר . בשורה אחת של צלחת 96-באר, פיפטה 60 μL 1x ברדפורד ריאגנט. כמו שברים נאספים, לערבב 20 μL של כל שבר לכל באר. צבע כחול כהה יותר מציין את השברים המרוכזים יותר.
    5. בצינור 50 מ"ל, לאסוף את החלבון הנותר על ידי בעדינות pipetting מאגר Elution הנותרים דרך העמודה, כדי לשחרר כל מיוסין שנותר קשור שרף בזרימה בעמודה. זרימה זו תרוכז בשלב הבא. ודא כי השרף הוא מחדש לאחר מכן לשימוש חוזר ומאוחסן בהתאם להוראות היצרן.
    6. איחד את שלושת השברים המרוכזים ביותר ורכז עוד יותר את הזרימה בצינור 50 מ"ל, כמו גם את שברי 1 מ"ל הנותרים באמצעות צינור ריכוז 100,000 MWCO. טען את הדגימה במאגר על הצינור המתרכז וצנטריפוגה ב 750 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (7 °F) ולחזור עד כל חלבון eluted כבר מרוכז לנפח סופי של כ 0.5-1 מ"ל.
      הערה: גודל נקבובית זה מאפשר שימור של מולקולות מיוסין, אשר יש מסות כמה פעמים את הניתוק במשקל המולקולרי. שרשראות האור נשארות קשורות קשר הדוק לתחומים המוטוריים במהלך תקופה זו של ריכוז, כפי שאומת על ידי ביצוע אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE במוצר הסופי.
  4. דיאליזה והקפאת הבזק
    1. הפוך 2 L של מאגר דיאליזה, כמתואר בטבלה 1. טען את הדגימה בשקית דיאליזה או בתא ודיאליזה לילה בחדר הקר. שים לב כי הרכב מאגרי הדיאליזה שונה עבור NM2b ו- M5a.
      הערה: במקרה של NM2b, המטרה של שלב דיאליזה זה היא ליצור חוטי מיוסין במאגר כוח יוני נמוך. משקעים של חוטים אלה לאחר מכן מספק שלב טיהור נוסף ומאפשר את הריכוז של המדגם. יהיה, אם כן, משקעים לבנים גלויים בתא הדיאליזה למחרת. סיבים אלה ייאספו על ידי צנטריפוגה ו depolymerized בשלב 5.1. במקרה של M5a-HMM, לאחר הדיאליזה הלילית, החלבון יהיה טהור מספיק לשימוש בבדיקות הבאות. ניתן לבצע שלבי טיהור נוספים כגון סינון ג'ל או כרומטוגרפיה של חילופי יונית, במידת הצורך. עבור שחזור M5a לאחר דיאליזה, עבור לשלב 5.2.
  5. שחזור מיוסין לאחר דיאליזה
    1. עבור NM2b, לפרוק בזהירות את כל המדגם משקית הדיאליזה או התא וצנטריפוגה ב 4 °C (75 °F) במשך 15 דקות ב 49,000 x g כדי לאסוף את חוטי המיוסין. השלך את supernatant ולהוסיף בהדרגה את מאגר האחסון לכדור כמתואר בטבלה 1 עד שהוא נמס. צנרת עדינה למעלה ולמטה מסייעת לתדלק את הכדור. בדרך כלל, זה לא דורש יותר מ 500 μL לכל צינור. לאחר שהבטיח כי הכדור מומס לחלוטין במאגר אחסון חוזק יוני גבוה, שלב צנטריפוגה נוסף (15 דקות ב 49,000 x g) ניתן לבצע כדי להסיר אגרגטים לא רצויים במידת הצורך, שכן המיוסין יהיה עכשיו לא פולימרי ויישאר supernatant.
    2. עבור M5a-HMM, בזהירות לאסוף את המדגם כולו מתא הדיאליזה צנטריפוגה ב 4 °C (5 °F) במשך 15 דקות ב 49,000 x g במקרה כל אגרגטים לא רצויים נוכחים. קח את הסופר-טבעי.
  6. קביעת ריכוז והקפאת הבזק
    1. כדי לקבוע את ריכוז המוצר, למדוד את הספיגה באמצעות ספקטרופוטומטר באורכי גל 260, 280, 290, ו 320 ננומטר. חשב את הריכוז mg/mL (cmg/mL) עם משוואה 1, שבו A280 מייצג את הספיגה ב 280 ננומטר ו A320 מייצג את הספיגה ב 320 ננומטר. הריכוז המתקבל mg / mL ניתן להמיר μM של מולקולות מיוסין עם משוואה 2, שם M הוא המשקל המולקולרי של החלבון כולו (כולל שרשראות כבדות, שרשראות אור, פלואורופורים, וכל התגים).
      cמ"ג/מ"ל = (A280 - A320) / ε (1)
      מולקולות מיקרומטר = 1000c מ"ג / מ"ל/M (2)
      הערה: אם דילול יש צורך, אז זה חייב להיעשות במאגר חוזק יוני גבוה. מקדם ההכחדה (ε) יכול להיקבע על ידי ייבוא רצף חומצות האמינו של החלבון לתוכנית כגון ExPASy. תשואה אופיינית עבור M5a-HMM הוא כ 0.5-1 מ"ל של 1-5 מ"ג / מ"ל חלבון עבור NM2b באורך מלא הוא 0.5-1 מ"ל של 0.5-2 מ"ג / מ"ל. מקדם ההכחדה של M5a-HMM המשמש במאמר זה היה 0.671. מקדם ההכחדה של NM2b המשמש במאמר זה היה 0.611.
    2. לאחסן את המיוסין המטוהר באחת משתי הדרכים. Aliquot בין 10-20 μL לתוך צינור דק קיר, כגון צינור תגובת שרשרת פילמור, ושחרר את הצינור לתוך מיכל של חנקן נוזלי להקפאת הבזק. לחלופין, ישירות pipette בין 20-25 μL של מיוסין לתוך חנקן נוזלי ולאחסן את החרוזים הקפואים של חלבון בצינורות קריוגניים סטריליים. בכל מקרה, הצינורות המתקבלים ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) או חנקן נוזלי לשימוש עתידי.
      הערה: מאחר ששתי התקפות תנועתיות המתוארות להלן דורשות כמויות קטנות מאוד של חלבון, אחסון ב aliquots קטן, כמתואר, הוא חסכוני.

2. גלישה actin חוט אסאי

  1. הכנת כיסוי
    1. הפוך פתרון חנקן 1% אצטט עמיל.
    2. להשיג צלחת תרבית רקמות (150 x 25 מ"מ) ולהוסיף נייר מסנן עגול (קוטר 125 מ"מ) לתחתית המנה.
    3. טען שמונה עובי מס ' 1.5 כיסויים מרובעים 22 מ"מ על מתלה ולשטוף עם כ 2-5 מ"ל של אתנול 200 הוכחה ואחריו 2-5 מ"ל של מים מזוקקים (dH2O). חזור על שלב הכביסה הזה, המסתיים במים. לאחר מכן, יבש את כיסויים לחלוטין באמצעות קו אוויר מסונן או N2-line.
    4. קח כיסוי אחד לאט pipette 10 μL של פתרון 1% ניטרוצלולוז לאורך קצה אחד של להחליק. לאחר מכן, בתנועה חלקה אחת, למרוח אותו על פני שאר כיסוי באמצעות הצד של חלקה 200 μL פיפטה קצה. מניחים את כיסוי זה על צלחת תרבית הרקמות עם הצד הניטרוצלולוז למעלה. חוזרים על הפעולה לקבלת כיסויים הנותרים ומאפשרים להם להתייבש בזמן הכנת ריאגנטים הנותרים ולהשתמש כיסויים בתוך 24 שעות לאחר הציפוי.
  2. הכנה קאמרית
    1. נגב שקופית מיקרוסקופ עם נייר עדשה אופטי לניקוי פסולת גדולה. חותכים שתי חתיכות של סרט דו-צדדי, באורך של כ-2 ס"מ.
    2. מקם חתיכה אחת לאורך אמצע הקצה הארוך של שקופית המיקרוסקופ. ודא שקצה הקלטת מתיישר עם קצה השקופית. מניחים את פיסת הסרט השנייה בערך 2 מ"מ מתחת לפיסת הסרט הראשונה כך שהשניים מקבילים ומיושרים. פעולה זו יוצרת תא זרימה שיכול להכיל כ- 10 מיקרו-אל של פתרון (ראו איור 1).
    3. קח את אחד מהכיסויים מצופים הניטרוצלולוז מחלק 1. יש לתקוע בזהירות את כיסוי הכיסוי על הקלטת כך שהצד מצופה בניטרוסלולוז יוצר קשר ישיר עם הקלטת (ראו איור 1). בעזרת קצה pipette, לחץ בעדינות על ממשק סרט השקופיות כדי לוודא שהכיסוי נדבק כראוי בשקופית. חותכים את הקלטת העודפת התלויה על קצה המגלשה עם סכין גילוח.
  3. הכנת אקטין
    1. הפוך 20 μM F-actin על ידי פילמור אקטין גלובולרי (G-actin) במאגר פילמור (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7.0)) ב 4 °C (4 °F) לילה.
    2. לדלל F-actin ל 5 μM במאגר תנועתיות (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)). תווית עם עודף 1.2x לפחות של רודמין-פאלואידין. להשאיר (מכוסה בנייר אלומיניום) לפחות 2 שעות על קרח. זה יכול לשמש עד 1-2 חודשים, מאוחסן על קרח.
  4. ביצוע myosin 5a גלישה אקטין חוטים
    הערה: בסעיף זה, הפרטים של מיוסין 5a (הממ) גלישה אסאי מסופקים.
    1. הכן את הפתרונות למיוסין 5a המתוארים בטבלה 2 ולשמור אותם על קרח.
    2. לזרום 10 μL של myosin 5a (50-100 ננומטר) דרך תא הזרימה ולחכות 1 דקות.
    3. זרימה ב 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב 50 mM MB עם 1 mM DTT ("מלח נמוך" חוצץ). חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולחכות 1 דקות לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ על ידי הצבה עדינה של פינת הנייר ביציאה תא הזרימה.
    4. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    5. זרימה ב 10 μL של פתרון actin שחור (5 μM F-actin, 1 μM calmodulin, ו 1 mM ATP ב 50 mM MB עם 1 mM DTT) כדי לחסל "ראשים מתים", כפי שנדון בסעיף דיון.
      1. Pipette הפתרון עם מזרק 1 מ"ל ו 27 G מחט כדי לגטות את חוטי actin לפני הצגת הפתרון לתא. חזור על שלב זה פעמיים נוספות והמתן דקה אחת לאחר הפעם השלישית. כ-20 אירועי צנרת מספיקים.
      2. כדי לבצע את ספין "ראש מת", להוסיף כמות סטואישיומטרית של F-actin למיוסין בנוכחות 1 mM ATP ו 1 mM MgCl2 בריכוז מלח של 500 mM. לאחר מכן אולטרה צנטריפוגה ב 480,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). מיוסין המת יהיה בכדור.
    6. זרימה ב 50 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT ו 1 mM ATP כדי לרוקן את החדר של חוטי אקטין חינם.
    7. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות כדי לרוקן את התא של כל ATP.
    8. זרימה ב 10 μL של 20 nM רודמין actin (Rh-Actin) פתרון המכיל 1 mM DTT ב 50 mM MB ולחכות 1 דקות כדי לאפשר קשירת קפדנית של חוטי actin למיוסין 5a מחובר לפני השטח של כיסוי.
    9. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT לשטוף חוטי Rh-Actin לא קשור אל פני השטח. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    10. זרימה ב- 30 μL של המאגר הסופי.
    11. הקלט תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות אורך גל עירור של 561 ננומטר כדי לדמיין את Rh-Actin. זמן חשיפה מתאים הוא 200 אלפיות שני בהספק לייזר של 1.4 מגה-ואט למשך הרכש הכולל של 0.5-1 דקות.
      הערה: ודא שקצב הרכישה משתנה בהתאם למהירות הסיבים הנעים. שיקול חשוב לפני איסוף נתונים לשימוש עם תוכניות מעקב הוא קצב הפריימים של הרכישה. תנועות תת-פיקסל בין מסגרות יביאו להערכת יתר של המהירות, ותנועות של כמה מאות ננומטרים נדרשות כדי להשיג ערכים מדויקים. קצב רכישה אופטימלי כולל גלישת אקטין למרחק פיקסל אחד לפחות בין מסגרות. במקרה של מיקרוסקופ TIRF המשמש להדמיה כאן, סף זה מתורגם ל- 130 ננומטר; לכן, מיוסין צפוי לנסוע 1 מיקרומטר/s חייב להיות בתמונה בקצב של 5 מסגרות / s (מרווח של 0.2 שניות) כדי להשיג 200 ננומטר של תנועה בעוד מיוסין צפוי לנסוע 10 ננומטר / s דורש 0.05 מסגרות / s (מרווחי 20 s). לפיכך, ניתן לצמצם את דגימת הנתונים בשלב זה במידת הצורך (ראה דיון לקבלת פרטים נוספים).
  5. ביצוע מיוסין לא-1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
    הערה: בסעיף זה, הפרטים של מיוסין באורך מלא לא 1000 2b גלישה אסאי מסופקים. מיוסין 2b הזזה לא-1b actin filament פרוטוקול בדיקה שונה מפרוטוקול myosin 5a בשלבים מסוימים. ודא שהמאגרים הנכונים משמשים עבור כל אחד מהצעדים הללו. לדוגמה, בדיקה NM2b דורש חיבור של מיוסין כיסוי במאגר מלח גבוה בעוד M5a יכול להיות מחובר כיסוי במאגרי מלח גבוהים או נמוכים. בנוסף, M5a גלישה אקטין חוט asslament בדיקה משתמש בריכוז נמוך יותר של מיוסין כדי למתן את התדירות של חוטי actin מתפרקים במהלך הרכישה.
    1. הכן את הפתרונות עבור NM2b כמתואר בטבלה 2 ולשמור אותם על קרח.
    2. זרימה ב 10 μL של מיוסין לאmuscle 2b (0.2 μM) ב 500 mM חוצץ תנועתיות (MB) ("מלח גבוה" חוצץ) ו 1 mM dithiothreitol (DTT) דרך תא הזרימה ולחכות 1 דקות.
      הערה: מאגרי המלח הגבוהים לניתוק חוטי מיוסין ולאפשר התקשרות של מולקולות מיוסין יחיד אל פני השטח, כמו מיוסין לאmuscle 2b יכול פולימר לתוך חוטים בריכוז יוני <150 mM.
    3. זרימה ב 10 μL של 1 mg / mL סרום בקר אלבומין (BSA) ב 500 mM MB עם 1 mM DTT ("מלח גבוה" חוצץ) כמתואר בטבלה 2. חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולחכות 1 דקות לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ.
    4. לשטוף עם 10 μL של 500 mM MB עם 1 mM DTT כמתואר בטבלה 2. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    5. לזרום ב 10 μL של פתרון actin שחור כמתואר בטבלה 2 כדי לחסל "ראשים מתים", כפי שנדון עוד בסעיף דיון. פתרון המעשין השחור מכיל 5 מיקרומטר של F-actin ללא תווית, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0.2 מ"מ CaCl2, 1 μM CaM, ו 1 mM DTT ב 50 mM NaCl חוצץ תנועתיות כדי זרחן מיוסין nonmuscle 2b על פני השטח של התא.
      1. Pipette הפתרון עם מזרק 1 מ"ל ו 27 G מחט כדי לגטות את חוטי actin לפני הצגת הפתרון לתא. חזור על שלב זה פעמיים נוספות והמתן דקה אחת לאחר הפעם השלישית. כ- 20 אירועי צנרת מספיקים.
    6. זרימה ב 50 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT ו 1 mM ATP כדי לרוקן את החדר של חוטי אקטין חינם.
    7. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות כדי לרוקן את התא של כל ATP.
    8. זרימה ב 10 μL של 20 nM Rh-Actin פתרון המכיל 1 mM DTT ב 50 mM MB ולחכות 1 דקות כדי לאפשר קשירת קפדניה של סיבי actin למיוסין 2b לא מושמש מחובר לפני השטח של כיסוי.
    9. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT לשטוף חוטי Rh-Actin לא קשור אל פני השטח. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    10. זרימה ב- 30 μL של המאגר הסופי. עבור מיוסין 2b הזזה לא-מוסוקית, החיץ הסופי כולל גם calmodulin, CaCl2, ושרשרת אור מיוסין kinase כדי לספק זרחן מלא של מיוסין 2b nonmuscle במהלך הדמיית וידאו. 0.7% מתילסלולוז יכול להיכלל גם במאגר הסופי אם חוטי actin מאוגדים רק באופן רופף או אינם קשורים לפני השטח. הדבר נדון בהמשך בסעיף הדיון.
    11. הקלט תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות אורך גל עירור של 561 ננומטר. זמן חשיפה מתאים הוא 200 אלפיות שני בהספק לייזר של 1.4 מגה-ואט למשך רכישה כולל של 0.5 -3 דקות.
      הערה: ודא שקצב הרכישה משתנה בהתאם למהירות הסיבים הנעים. שיקול חשוב לפני איסוף נתונים לשימוש עם תוכניות מעקב הוא קצב הפריימים של הרכישה. תנועות תת-פיקסל בין מסגרות יביאו להערכת יתר של המהירות, ותנועות של כמה מאות ננומטרים נדרשות כדי להשיג ערכים מדויקים. קצב רכישה אופטימלי כולל גלישת אקטין למרחק פיקסל אחד לפחות בין מסגרות. במקרה של מיקרוסקופ TIRF המשמש להדמיה כאן, סף זה מתורגם ל- 130 ננומטר; לכן, מיוסין צפוי לנסוע 1 מיקרומטר/s חייב להיות בתמונה בקצב של 5 מסגרות / s (מרווח של 0.2 שניות) כדי להשיג 200 ננומטר של תנועה בעוד מיוסין צפוי לנסוע 10 ננומטר / s דורש 0.05 מסגרות / s (מרווחי 20 s). לפיכך, ניתן לדגום נתונים בשלב זה, במידת הצורך (ראה דיון לקבלת פרטים נוספים).

3. מולקולה בודדת TIRF מראייה

  1. הכנת כיסוי
    1. מחלקים את אבקת המניות ל-10 מ"ג עליקוט (בצינורות של 1.5 מ"ל) של מתוקסי-פג-סילאן (mPEG) ו-10 עליקוטים מ"ג של ביוטין-פג-סילאן (bPEG). יש לאחסן ב-20 °C במיכל אטום וללא לחות ולהשתמש תוך 6 חודשים.
    2. טען שמונה עובי מס ' 1.5H (דיוק גבוה) כיסויים מרובעים 22 מ"מ על מתלה ולשטוף עם 2-5 מ"ל של אתנול 200 הוכחה ואחריו 2-5 מ"ל של מים מזוקקים. חזור על שלב הכביסה הזה, המסתיים במים. לאחר מכן, יבש את כיסויים לחלוטין באמצעות קו אוויר או N2 ופלזמה נקי עם ארגון במשך 3 דקות.
    3. מניחים את כיסויי הניקוי על נייר סינון (90 מ"מ) בצלחת תרבית רקמות (100 x 20 מ"מ) ודגרה בתנור 70 מעלות צלזיוס תוך ביצוע השלבים הבאים.
      הערה: ניקוי פלזמה ניתן להחליף בשיטות ניקוי כימיות אחרות49.
    4. הכן 80% פתרון אתנול עם dH2O ולהתאים את ה- pH ל 2.0 באמצעות HCl. להוסיף 1 מ"ל של זה 10 aliquot מ ג של mPEG ו 1 מ"ל כדי 10 aliquot מ"ג של bPEG. מערבולת להתמוסס, אשר לא צריך לקחת יותר מ 30 s.
    5. קח 100 μL של פתרון bPEG ולהוסיף 900 μL של 80% אתנול (pH 2.0). פתרון זה הוא 1 מ"ג / מ"ל bPEG. לאחר מכן, לעשות פתרון של שני PEGs כדלקמן, ערבוב ביסודיות.
      1. 200 μL של 10 מ"ג / מ"ל mPEG (ריכוז סופי: 2 מ"ג / מ"ל).
      2. 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל bPEG (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מ"ל).
      3. 790 μL של פתרון 80% אתנול (pH 2.0).
    6. מוציאים את הכיסויים מהתנור. יש לחלק בזהירות 100 מיקרו-אל של תמיסה PEG למרכז כל כיסוי, ומבטיח שרק המשטח העליון רטוב. לאחר מכן, מניחים את החלקות בחזרה בתנור ודגרה במשך 20 עד 30 דקות.
    7. כאשר כיסויים מתחילים לקחת על מראה חורי, עם עיגולים קטנים גלויים על פני השטח, להסיר אותם מהתנור.
    8. לשטוף כל כיסוי עם 100% אתנול, יבש עם קו אוויר, ומניחים בחזרה בתנור. דגירה רק לזמן הנדרש ליצירת תאים בשלב 2.
  2. הכנה קאמרית
    1. נקה שקופית מיקרוסקופ לשימוש בהכנת התא. חותכים שתי חתיכות של סרט דו-צדדי, באורך של כ-2 ס"מ.
    2. מקם חתיכה אחת לאורך אמצע הקצה הארוך של שקופית המיקרוסקופ. ודא שקצה הקלטת מתיישר עם קצה השקופית. מניחים את פיסת הסרט השנייה בערך 2 מ"מ מתחת לפיסת הסרט הראשונה כך שהשניים מקבילים ומיושרים.
    3. לוקחים את אחד הכיסויים הפונקציונליים מהתנור (נוצר ב-3.1). יש להקפיד על כיסויי הציפוי לקלטת, כך שהצד המצפוף ב-PEG יהיה עם הפנים כלפי מטה וייצור קשר ישיר עם הקלטת, כפי שמוצג באיור 1. בעזרת קצה pipette, לחץ בעדינות על ממשק סרט השקופיות כדי לוודא שהכיסוי נדבק כראוי בשקופית.
    4. חותכים את הקלטת העודפת התלויה מעל המגלשה עם סכין גילוח. תאים אלה ניתן להשתמש מיד או להציב pairwise לתוך צינור 50 מ"ל ומאוחסן במקפיא -80 °C לשימוש עתידי. חשוב לאחסן מיד או פני השטח יתפרקו.
  3. ביצוע מיוסין 5a TIRF מיקרוסקופיה בדיקה
    1. הכן את הפתרונות לבדיקת תנועתיות הפוכה myosin 5a המתוארת בטבלה 3 ולשמור אותם על קרח.
    2. לשטוף את התא עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT.
    3. זרימה ב 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולחכות 1 דקות לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ.
    4. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    5. זרימה ב 10 μL של פתרון NeutrAvidin ב 50 mM MB עם 1 mM DTT ולחכות 1 דקות.
    6. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    7. זרימה ב 10 μL של אקטין רודמין ביוטינילציה (bRh-Actin) המכיל 1 mM DTT ב 50 mM MB ולחכות 1 דקות. בשלב זה, השתמש בקצה פיפטה משועמם גדול והימנע מצינורות למעלה ולמטה כדי למזער את הגיסה של חוטי actin פלואורסצנטיים כדי להבטיח כי חוטי אקטין ארוכים ניתן לחבר לפני השטח (20-30 מיקרומטר או יותר). חלופה יעילה היא חיתוך החרוט של קצה פיפטה סטנדרטי (עם פתיחה של ≈1-1.5 מ"מ).
    8. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    9. זרימה ב 30 μL של המאגר הסופי עם 10 ננומטרמטר מיוסין 5a הוסיף, ולאחר מכן מיד לטעון על מיקרוסקופ TIRF ולרשום לאחר מציאת המוקד האופטימלי עבור שיטת הדמיה TIRF. זמני החשיפה בין 100-200 ms מתאימים בהספק לייזר של 1.4 מגה-ואט עבור האקטין והמיוסיפן בעל התווית GFP. זמן רכישה מתאים לניתוח מהירות הוא 3 דקות.
  4. ביצוע מיוסין לא-1000000000000000000000000000000000000000000000000000000
    הערה: בסעיף זה, הפרטים של מיוסין לא 1000 2b TIRF בדיקה באמצעות חוטים פולימריים זרחן מסופקים. פרוטוקול מפורט (סעיפים 4.1-4.3) עבור זרחן ופולימר מיוסין-2b לא מושתן בצינור כלול.
    1. כדי זרחן NM2b מטוהר, לעשות 10x קינאז לערבב עם התנאים הבאים: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK, ו 0.1 mM ATP. זה יכול להיות הביא לנפח עם 500 mM MB עם 10 mM DTT. מוסיפים את תערובת הקינאז 10x למיוסין ביחס נפחי של 1:10 ומאפשרים לזה לדגור במשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר. בדרך כלל, ריכוז מיוסין עבור שלב זה הוא 1 μM.
    2. כדי פולימר מיוסין זרחן לתוך חוטים, להוריד את ריכוז המלח של NM2b ל 150 mM NaCl. כדי לעשות זאת, לעשות חוצץ תנועתיות 1x (1x MB) ללא מלח על ידי דילול 4x MB ארבע פעמים ב dH2O. זה 1x MB יכול לשמש כדי להוריד את ריכוז המלח כי NM2b הוקפא במאגר מלח 500 mM.
    3. על כל 3 μL של מלאי NM2b, להוסיף 7 μL של 1x MB כדי להוריד את ריכוז המלח ל 150 mM NaCl ודגרה על קרח במשך 20-30 דקות כדי ליצור חוטי NM2b.
      הערה: הסדר בסעיפים 4.1-4.3 אינו קריטי כל עוד NM2b הוא זרחן וריכוז המלח הסופי הוא 150 מ"ר. דגירה בסדר גודל של 30 דקות-1 שעות מאפשרת מספיק זמן לזרחן מלא ופילינג.
    4. הכן את הפתרונות עבור myosin 2b הפוך תנועתיות מתואר בטבלה 3 ולשמור אותם על קרח.
    5. לשטוף את התא עם 10 μL של 150 mM MB עם 1 mM DTT.
    6. זרימה ב 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב 150 mM MB עם 1 mM DTT חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולחכות 1 דקות לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ.
    7. לשטוף עם 10 μL של 150 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    8. זרימה ב 10 μL של פתרון NeutrAvidin ב 150 mM MB עם 1 mM DTT ולחכות 1 דקות.
    9. לשטוף עם 10 μL של 150 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    10. לזרום 10 μL של bRh-Actin ולחכות 1 דקות. בשלב זה, השתמש בקצה פיפטה משועמם גדול והימנע מצינורות למעלה ולמטה כדי למזער את הגיזה של חוטי אקטין פלואורסצנטיים, כדי להבטיח כי חוטי אקטין ארוכים יכולים להיות מחוברים לפני השטח (20-30 מיקרומטר או יותר). חלופה יעילה היא חיתוך החרוט של קצה פיפטה סטנדרטי.
    11. לשטוף עם 10 μL של 150 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    12. לזרום ב 10 μL של פתרון מיוסין 2b לאmuscle (כ 30 ננומטר) ולחכות 1 דקות.
    13. לשטוף עם 10 μL של 150 MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    14. זרימה ב 30 μL של המאגר הסופי, ולאחר מכן מיד לטעון על מיקרוסקופ TIRF ולרשום לאחר מציאת המוקד האופטימלי עבור שיטות הדמיה TIRF. זמני החשיפה בין 100-200 ms מתאימים בהספק לייזר של 1.4 מגה-ואט עבור האקטין והמיוסיפן בעל התווית GFP. זמן רכישה מתאים לניתוח מהירות הוא 3 דקות.

4. ניתוח תמונה

  1. ניתוח תמונה עבור גלישה actin חוט assay
    הערה: ניתן לנתח את התמונות באמצעות התוכנה והמדריכים המקושרים ברשימת החומרים. חשוב לציין כי התוכנית המתוארת כאן דורשת TIFF-ערימות לניתוח. התהליך לניתוח בדיקת חוטי ההזזה הוא כדלקמן50.
    1. העלה ערימות סרטים גולמיים למבנה תיקיות שצוין והזן את הספריה העליונה ביותר של תיקיות הסרטים לתוכנית.
      הערה: התוכנית מנתחת את הקבצים לאורך ספריה זו וספריות משנה אלה, ומתייחסת לספריות ברמה הנמוכה ביותר כאל שכפולים. סטטיסטיקה ממוצעת עבור כל קבוצה של עותקים משוכפלים תופק. במקרה זה, סרט אחד שימש עבור כל מיוסין. כאשר מאפיינים מיוסין רומן או לחקור מצב ניסיוני חדש, מומלץ לנתח סרטים משלושה שדות של צפיות (FOV) לכל תא עבור סך של שלושה חדרים ולחזור על זרימת עבודה זו במשך שלוש הכנות של המיוסין הנחקר.
    2. השתמש בקובץ ה- Script "stack2tifs" בשילוב עם קצב הפריימים שהוזן על-ידי המשתמש כדי להמיר כל מחסנית TIFF לתיקיה המכילה סידרה של קבצי TIFF בודדים וקובץ מטא-נתונים.txt מתאים המכיל את שעת ההתחלה של כל מסגרת. עבור נתונים שאינם בתבנית מחסנית TIFF, יש להחיל תחילה המרה באמצעות תוכנה כגון אלה המפורטות בטבלת החומרים.
      הערה: קובץ Script זה הוא החלק בחבילת התוכנה. המידע של התסריט ניתן למצוא כאן: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. השתמש בפרמטר -px, שהוא גודל הפיקסלים (ב- nm) במהלך הרכישה. במקרה זה, גודל הפיקסלים הוא 130 ננומטר. השתמש בפרמטרים -xmax ו- -ymax לשינוי קנה המידה של הצירים עבור יציאות התוויית הפיזור. אלה תואמים את אורך הסיב המותווה הארוך ביותר ואת המהירות המותווה המרבית (ב- nm/ s).
      הערה: אלה הם ערכים משוערים וניתן להגדיר אותם לערכים גבוהים מהצפוי כדי להבטיח שהנתונים כלולים בהתוויה. לאחר ניתוח, ניתן לייצא את הנתונים הגולמיים גם לשימוש בתוכנות סטטיסטיות או גרפיות אחרות להצגה וניתוח.
    4. השתמש בפרמטר -minv, שהוא פרמטר ניתוק מהירות מינימלי, כדי להגדיר את הסיבים שאינם נעים, ולכן ניתן לא לכלול אותו בניתוח. עבור מיוסין איטי כגון NM2b, פרמטר זה חייב להיות נמוך (בדוגמה זו, 5 ננומטר/s) כדי למנוע חיתוך תנועות גלישה אמיתיות. עבור מיוסין מהיר כגון M5a, פרמטר זה יכול להיות גבוה יותר (בדוגמה זו, 100 ננומטר/s) כדי להחיל מסנן מחמיר יותר, תוך שמירה על התפלגות מהירות הגלישה האמיתית.
    5. השתמש בפרמטר הניתוק -pt כדי לזהות תנועה חלקה. עבור כל חלון דגימה, ערך מחושב שווה ערך ל- 100 x סטיית תקן מהירות/מהירות ממוצעת. מסלולים עם ערכים גבוהים יותר מהניתוק, כוללים מהירויות משתנות יותר והם אינם נכללים בניתוח נוסף. בדוגמה זו, נעשה שימוש בערך ניתוק של 33. מסלולים בעלי ערכים גבוהים יותר כוללים מהירויות משתנות יותר והם אינם נכללים בניתוח נוסף.
    6. השתמש ב- -maxd כדי להגדיר מרחק הצמדה מרבי המותר בין מסגרות. זהו מרחק מחושב של מסגרת למסגרת המוזז על-ידי המרכז של הסיב ביחידות של nm. זה יכול להיות שימושי עבור אי הכללת תנועות ספורדיות או חיבור שגוי בין סיבים. בדוגמאות כאן, הפרמטר נותר על ערך ברירת המחדל של 2,000 ננומטר.
  2. ניתוח תמונה לבדיקת מיקרוסקופיה TIRF
    הערה: התהליך לניתוח המולקולה היחידה TIRF בבדיקה על תוכנת ההדמיה המפורטת במיוחד ב רשימת חומרים הוא כדלקמן29.
    1. לחץ וגרור את הווידאו המיקרוסקופי המוקלט לסביבת העבודה של התוכנה כדי לפתוח אותו51. לאחר מכן, לפצל את ערוצי הרכישה. לחץ על תמונה > צבע > פיצול ערוצים.
      הערה: במקרה של הסחף שלב ניכר במהלך הרכישה, יש לייצב את התמונות כדי לתקן את הסחף האינסטרומנטלי במישור ההדמיה. במקרה זה, לא נעשה שימוש בפיצוי על סחיפה בציר Z שכן המיקרוסקופ המשמש להשגת נתונים אלה מייצב את הבאר Z-focus. כדי לייצב את התמונה בתוכנית ניתוח התמונה, התקן את יישום ה- Plug-in המתאים לייצב המקושר ברשימת החומרים. מייצב התמונה מניח מיקומים קבועים עבור האובייקטים בתמונה ומשתמש בממוצע מתגלגל של המסגרות הקודמות כהפניה. ההליך המומלץ הוא אפוא להתחיל עם הערוץ המכיל תמונות של actin שכותרתו, שכן זה נמצא במצב קבוע.
    2. לחץ על תוספיםולאחר מכן מצא מייצב תמונה; ודא שהתרגום נבחר ושמור על הגדרות ברירת המחדל. סמן את התיבה לצד יומן רישום של מקדמי המרה. החלת שלב יומן רישום זה מאפשרת להחיל את פרמטרי המשמרת המחושב על הערוץ השני בשלב הבא. אפשר להשלים את התהליך.
    3. לאחר מכן, פתח את הערוץ עם מיוסין שכותרתו ולהחיל את הייצוב על ידי לחיצה על תוספים > מייצב תמונה יומן Applier. אם לא ניתן לרכוש תמונות של אקטין במהלך אותה רכישה עקב דרישה להדמיה בקצב גבוה יותר בערוץ יחיד, להיסחף לייצב את ערימת התמונות על ידי בחירת אזור המכיל אובייקטים סטטיים כגון סמן פיודואלי ביו-טיניל או פלואורופורים הקשורים באופן ספציפי למשטח הביוטין-PEG. ניתן לחתוך אזור זה מהערימה המקורית ולייצב אותו, ולאחר מכן את היישום של ערכי ההזזה המתקבלים למחסנית המקורית.
      הערה: בפועל, הסחף שנצפו בניסויי תנועתיות יהיה זניח ביחס לתנועה של מיוסין אשר נעים בכמה מאות ננומטר / s, אבל עבור myosins האיטי ביותר זה הופך להיות שיקול חשוב.
    4. לאחר מכן, פתח את TrackMate, לחץ על תוספים; לאחר מכן, בתפריט הנפתח שלה לחץ על מעקב ולבסוף על TrackMate. בשלב זה, ניתוח התמונה כפוף לאופטימיזציה בהתבסס על הפרמטרים של תנאי הפלורופור והבוחן. עם זאת, הפרמטרים ההתחלתיים האידיאליים הם כדלקמן.
      1. הגדרות כיול: שמור את כל ערכי ברירת המחדל.
      2. גלאי: גלאי LoG.
      3. קוטר בועה משוער: 0.5-1.0 מיקרון.
      4. סף: 25-200. (ניתן לקבוע זאת על-ידי לחיצה על תצוגה מקדימה לאחר בחירת מספר כדי לראות אם המקומות שזוהו תואמים לסרט ומתאימים כראוי.)
      5. סף ראשוני: לא מוגדר.
      6. תצוגה: מציג היפר-תערועל.
      7. הגדר מסננים על כתמים: לא להגדיר.
      8. גשש: גשש פשוט LAP.
        הערה: אלה תלויים בקצב הפריימים ובמהירות מיוסין וחייבים להיות גדולים מספיק כדי לחבר את המיקומים הבאים תוך אי הכללת קשרים לא רצויים בין חלקיקים שונים.
      9. קישור מרחק מרבי: 1.0 מיקרון.
      10. מרחק מרבי של סגירת פער: 1.0 מיקרון.
      11. פער מסגרת מרבי סוגר פערים: 1.
      12. הגדרת מסננים על רצועות: מעקב אחר תזוזה (>0.39-כדי לכלול רק כתמים הנעים יותר מ-3 פיקסלים), כתמים ברצועות (>3-כדי לכלול רק רצועות עם 3 נקודות לפחות). מסננים אחרים כגון מהירות מינימלית עשויים להיות מוצגים כדי לא לכלול כתמים המעכבים במשך תקופות ארוכות. יש לבדוק את תוצאות הסינון על ידי בדיקה חזותית של מסלולים כדי להבטיח כי מסלולים מזויפים (כלומר, תנועת מיוסין ברקע שאינו לאורך מסלול actin) יוסרו תוך שמירה על הרצועות המשויכות actin.
    5. לאחר שהמסך 'אפשרויות תצוגה' עולה, לחץ על 'ניתוח' עבור הפלטים הרלוונטיים. שמור את שלוש הטבלאות שהופקו (מעקב אחר סטטיסטיקה, קישורים בסטטיסטיקת מעקב ונקודות בסטטיסטיקת מעקב). הטבלה Track Statistics תכיל את נתוני המהירות וההעתקה שניתן לנתח לאחר מכן כדי לאפיין חלבון חדשני או את ההשפעות של מצב ניסיוני מסוים, למשל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להעריך את טיהור המיוסין על ידי ביצוע הפחתת נתרן דודסיל סולפט-פוליאקרילמיד (SDS-PAGE) ג'ל-אלקטרופורזה כפי שמוצג באיור 2. בעוד נתון זה מייצג את המיוסין הסופי, לאחר הדיאליזה, SDS-PAGE יכול להתבצע על aliquots מהשלבים השונים של הליך הטיהור כדי לזהות את כל המוצרים שאבדו supernatant. Myosin 5a הממ יש להקה בטווח 120-130 kDa ואת מיוסין 2b לא באורך מלא יש להקה בטווח 200-230 kDa, המקביל לרשתות כבדות29,44. למיוסין 5a יש גם להקה ליד הסימן 17...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הוא זרימת עבודה עבור טיהור ואפיון במבחנה של מיוסין 5a ומיוסין לא 100b. קבוצה זו של ניסויים שימושית לכימות התכונות המכנוכימיות של מבנים מיוסין מטוהרים באופן מהיר ושחזורי. למרות שני המיוסין המוצגים כאן הם רק שתי דוגמאות ספציפיות מתוך האפשרויות הרבות, ניתן ליישם את התנאים והטכניקות, עם קצת תפירה, לרוב המיוסין ולחלבונים מוטוריים רבים אחרים.

הפרוטוקולים הנדונים כאן כפופים לשינויים בהתאם לצרכים האישיים של המעבדה והניסויים. לדוגמה, כפי שנדון בסעיף ביטוי וביולוגיה מולקולרית, החלבונים המשמשים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר פאנג ג'אנג על הסיוע הטכני בהכנת ריאגנטים המשמשים לאיסוף נתונים אלה. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-רחמית NHLBI/NIH מממנת את HL001786 ל- J.R.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>1 מ"ל מזרקBD309628
<חזק>2 M CaCl<תת>2 פתרוןVWR10128-558
<חזק>2 M MgCl<תת>2 פתרוןVWR10128-298
<חזק>27 מד מחטבקטון דיקינסון309623
<חזק>5 מ' NaCl SolutionKD רפואיRGE-3270
<חומצה אצטית>חזקהThermoFisher Scientific984303
<חזק>אמיל אצטטLadd Research Industries10825
<חזק>Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
Biotinylated G-ActinCytoskeleton, Inc.AB07
בקר סרום אלבומיןMillipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatalaseMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) ב-SF-900 II SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
נייר סינון עגול - בדיקת החלקהMillipore SigmaWHA1001125
נייר סינון עגול - בדיקה הפוכהMillipore SigmaWHA1001090
<חזק>cOmplete, טבליות מעכב פרוטאז ללא EDTAMillipore Sigma5056489001יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש בטבליות ישירות או להרכיב אותן מחדש כתמיסת מלאי פי 25 על ידי המסת טבליה אחת ב-2 מ"ל מים מזוקקים. ניתן לאחסן את הפתרון המתקבל בטמפרטורה של 4 מעלות; C למשך 1-2 שבועות או לפחות 12 שבועות ב-20 מעלות צלזיוס.
<שפופרות >מרוכזות חזקות (100,000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024ה-MWCO של הצינור אינו בהכרח "מידה אחת מתאימה לכולם", כל עוד ה-MWCO נמוך מהמשקל המולקולרי הכולל של החלבון המטוהר. ה-NM2b כאן רוכז בצינור של 100,000 MWCO וה-M5a מרוכז בצינור של 30,000 MWCO.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament AssayVWR International48366-227
Coverslips: בדיקת תנועתיות הפוכה Azer ScientificES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5Aקוטר צינור הדיאליזה יכול להשתנות, אך ה-MWCO צריך להיות זהה. ה-NM2b המשמש כאן עבר דיאליזה בצינור דיאליזה 18 מ"מ. ניתן לאחסן את הצינורות בתמיסת אלכוהול של 20% בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
סרט דו-צדדיOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586ניתן להמיס את זה במאגר המכיל 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, ו-10 mM MOPS (pH 7.2) לריכוז סופי של 50 מ"ג/מ"ל. ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות; C כ-300 ומיקרו; L aliquots. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550ניתן לעשות בהם שימוש חוזר. לניקוי, יש לשטוף את העמוד עם 2-3 נפחי עמודות של PBS ומים מזוקקים. צננו את הטור ב-4 מעלות; C לפני השימוש.
<חזק>אתנולFischer ScientificA4094
G-actinPMID: ניתןלאחסן 4254541 מלאי G-actin ב-200 μ M בנוזל N2.
<חזק>גלוקוזMillipore סיגמאG8270
<חזק>גלוקוז אוקסידאזMillipore SigmaG2133
<חזק>תמיסת חיץ גליצין, 100 מ"מ, pH 2-2.5, 1 ליטרסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-295018
<חזק>HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Large-Orifice Pipet TipsFischer Scientific02-707-134
מעכב פרוטאז לופפטיןThermoFisher Scientific78435
<חזק>Mark12 סולם סטנדרטי לא מוכתםThermoFisher ScientificLC5677
<חזק>מתנולMillipore SigmaMX0482
<חזק>מתיל צלולוזMillipore SigmaM0512
<שקופיות מיקרוסקופ חזקות>חזקותפישר סיינטיפיק12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100<
strong>mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: ניתן לטהר אתMLCK המתויג 23148220-FLAG באותו אופן שבו טוהר המיוזין המתויג ב-FLAG כאן. 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelluloseLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 עד 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-wellThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Phosphate-Buffered Sa, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
<חזק>PMSFMillipore Sigma78830ניתן לייצר PMSF כתמיסת מלאי של 0.1 M באיזופרופנול ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס. תוספת איזופרופנול גורמת למשקעי גבישים, אותם ניתן להמיס על ידי ערבוב בטמפרטורת החדר. מיד לפני השימוש, ניתן להוסיף PMSF טיפתית לתמיסה מערבבת במהירות לריכוז סופי של 0.1 מ"מ.
<חזק>סכיני גילוחאופיס דיפו397492
<חזק>רודמין-פלואידיןThermoFisher ScientificR415ב-100% מתנול לריכוז סופי של 200 μM.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027יש לאחסן את זה בטמפרטורה של 4& מעלות צלזיוס. חיי המדף שלו הם 18 חודשים מיום הייצור.
<צלחת תרבית רקמות חזקה>חזקה - בדיקת גלישהקורנינג353025כל צלחת תרבית רקמה יכולה להכיל כתשע כיסויים.
<צלחת תרבית >רקמות חזקה - בדיקה הפוכהקורנינג353003כל צלחת תרבית רקמה יכולה להכיל כארבע כיסויים.
<חזק>צדדים חלקים 200 ומיקרו; L טיפים לפיפטהתומאס סיינטיפיק1158U38
<חזק>ציוד
<חזק>צנטריפוגהThermoFisher Scientific75006590
<חזק>מיקרוסקופדגם ניקון: Eclipse Ti עם מערכת H-TIRF עם 100x TIRF Objective (NA 1.49)
<חזקה>מיקרוסקופ מצלמהאנדורדגם: iXon DU888 EMCCD מצלמה (1024 x 1024 פורמט חיישן)
<חזק>מיקרוסקופ תיבת בקרה סביבתיתTokai HITמותאמת אישית תרמובוקס
<חזקה>מיקרוסקופ יחידת לייזרNikonLU-n4 ארבע יחידות לייזר עם לייזרים במצב מוצק עבור 405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו-640 ננומטר
<צנטריפוגת ספסל חזקה>בינוניתדגם מדעי של ThermoFisher: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-XP Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener אלקטרוני GmbH + Co. מערכת KG סוג: Zepto
Sonicator Probe (3.2 מ"מ)Qsonica4418
<חזק>חממה סטנדרטיתקלסרדגם: 56
<חזק>Waverly מיקסר צינורותWaverlyTR6E
<חזק>תוכנה
<חזק> ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (גרסה 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST זמין עבור מערכות מבוססות Mac OSX ו-Linux.
<תוסף חזק>מייצב תמונהhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate<
strong>Imaging SoftwareNIS Elements (חבילת AR)http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
ניתן לדלל את מלאי File:TrackMate-manual.pdf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myosin Motility AssaysFluorescence MicroscopyGliding Actin FilamentInverted Motility AssayNonmuscle Myosin 2bMyosin 5a PurificationActin Filament TrackingSingle Molecule DynamicsTotal Internal ReflectionAffinity Chromatography

Related Articles