אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

Summary

הביקוש הגובר לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים דורש שגרת רכישת תמונות בתפוקה גבוהה. מתואר כאן פרוטוקול המיישם את ההתפתחויות האחרונות של אסטרטגיות רכישה מתקדמות שמטרתן למקסם את יעילות הזמן והתפוקה של איסוף נתונים טומוגרפיים.

Abstract

טומוגרפיה של אלקטרונים קריוגניים (cryoET) היא שיטה רבת עוצמה לחקר המבנה התלת-ממדי של דגימות ביולוגיות במצב קרוב לילידים. CryoET החדיש הנוכחי בשילוב עם ניתוח ממוצע תת-מערכת מאפשר קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של מתחמי מאקרומולקולריים הנמצאים בעותקים מרובים בתוך שחזורים טומוגרפיים. ניסויים טומוגרפיים דורשים בדרך כלל כמות עצומה של סדרות הטיה כדי להירכש באמצעות מיקרוסקופים אלקטרונים שידור גבוה עם עלויות תפעוליות חשובות. למרות שהתפוקה והאמינות של שגרות רכישת נתונים אוטומטיות השתפרו כל הזמן בשנים האחרונות, תהליך בחירת אזורי העניין שבהם תירכש סדרת הטיה לא ניתן לאוטומטיות בקלות והיא עדיין מסתמכת על הקלט הידני של המשתמש. לכן, ההגדרה של הפעלת איסוף נתונים בקנה מידה גדול היא הליך שגוזל זמן רב שיכול להפחית במידה ניכרת את זמן המיקרוסקופ הנותר הזמין לרכישת סדרת הטיה. כאן, הפרוטוקול מתאר את היישומים שפותחו לאחרונה בהתבסס על חבילת SerialEM ותוכנת PyEM שמשפרת באופן משמעותי את יעילות הזמן של סינון רשת ואיסוף נתונים של סדרות הטיה בקנה מידה גדול. הפרוטוקול המוצג ממחיש כיצד להשתמש בפונקציות Scripting של SerialEM כדי להפוך באופן אוטומטי מיפוי רשת, מיפוי ריבוע רשת ורכישת סידרות הטיה. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר כיצד להשתמש ב- PyEM כדי לבחור יעדי רכישה נוספים במצב לא מקוון לאחר אתחול איסוף נתונים אוטומטי. כדי להמחיש פרוטוקול זה, היישום שלה בהקשר של איסוף נתונים מתקדמים של סדרת הטיה Sars-Cov-2 מתואר. הצינור המוצג מתאים במיוחד למקסם את יעילות הזמן של ניסויי טומוגרפיה הדורשים מבחר זהיר של יעדי רכישה ובמקביל כמות גדולה של סדרות הטיה שיש לאסוף.

Introduction

שיטות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגניות (cryoEM) מבוססות על הדמיה של דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) לאחר התחדשותם המהירה, תהליך הכנת מדגם המשמר את המבנים המולקולריים והתאים של דגימות במצב קרוב לילידי^{ולחות 1,2}. בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים (cryoET) מושג מודל תלת-ממדי של המדגם המהולל על ידי רכישת מספר תמונות של אותו אזור עניין מכיוונים שונים, מה שמכונה סדרת הטיה, ואחריו שחזור חישובי של כרך טומוגרפי³. טכניקת הדמיה מתקדמת זו התבגרה לשיטה רבת עוצמה לחקירה מבנית של תהליכים ביולוגיים בהקשר של סביבות התא הטבעיות שלהם^4,5,6.

בנוסף לניתוח אולטרה-מבני של המדגם המהולל, ניתן להשיג שחזורים ברזולוציה גבוהה של מתחמי מאקרומולקולריים הנמצאים בעותקים מרובים בתוך הכרך הטומוגרפי על ידי החלת תת-אוטומוגרמה ממוצעת^{של 5}. גישת שחזור זו מבוססת על היישור האיטרטיבי ועל ממוצע של תתי-נפחים המכילים את מבנה העניין והיא נועדה להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של השחזור הסופי^7,8. תת-מערכת בממוצע מסתמכת על איסוף ועיבוד של כמות גדולה של נתונים הדורשת לעתים קרובות רכישה של מאות סדרות הטיה באמצעות TEMs יוקרתיים עם עלויות תפעוליות מכבידות.

נכון לעכשיו ההתקנה של הפעלות cryoET אוטומטיות כאלה היא תהליך גוזל זמן, כי בדרך כלל מסתמך על קלט ידני של המשתמש^9,10,11. בדרך כלל, יעדים מזוהים על-ידי בדיקה חזותית של הרשת הממופה ולאחר מכן מוגדרים לאיסוף נתונים אוטומטי. היעילות של המשתמש בזיהוי נקודות רכישה מושפעת לעתים קרובות מאופי המדגם, הופכת למאתגרת במיוחד בעת ניתוח מקרומולקולים מטוהרים עם ריכוז תת-אופטימלי או במקרה של אירועים נדירים בסביבות תאיות צפופות, מה שמרמז על השימוש בגישות קורלטיביות¹². יתר על כן, זרימות העבודה הנוכחיות דורשות רכישת תמונות במהלך ההגדלה בהגדלות שונות שישמשו מאוחר יותר לוקליזציה מדויקת וריכוז היעד במהלך רכישה אוטומטית^11,13,14. שלבי יישור מחדש מדויקים אלה חיוניים עבור יישומים ברזולוציה גבוהה, הדורשים לבצע את ההדמיה בהגדלה גבוהה ודורשים צעדי מיקוד מדויקים לשמירה על אזור העניין בתוך שדה הראייה הקטן שנוצר. בסך הכל, מספר שעות של כל הפעלת איסוף נתונים מתבצעות עבור הליך ארוך זה שבמהלכו TEM אינו עוסק ברכישת סדרת הטיה. לכן, בהתאם לכמות סדרת הטיה הנדרשת, זיהוי ותפאורה של נקודות רכישה יכולים להשפיע באופן ניכר על זמן המיקרוסקופ הזמין לאיסוף נתונים במהלך הפעלת cryoET.

המתואר כאן הוא פרוטוקול ממוטב המבוסס על חבילת התוכנה SerialEM¹⁵ והגירסה העדכנית ביותר תוכנת PyEM¹⁶ כדי למפות רשתות, למפות ריבועי רשת, לבחור יעדים ולהגדיר רכישת נתונים אוטומטית עבור איסוף סדרות הטיה בקנה מידה גדול. הרעיון המרכזי של גישה זו הוא לספק ל- SerialEM תמונות שנוצרו באופן חישובי על-ידי PyEM עבור כל פריט רכישה, המכונה מפות וירטואליות, עבור לוקליזציה מדויקת וריכוז היעד. כדי להשיג זמן רכישה בפועל, בחירת היעדים כמו גם יצירת המפות הווירטואליות מבוצעות באופן לא מקוון באמצעות מופע דמה שני של SerialEM, ניתוק תהליך הבחירה של יעדי רכישה מפעולות TEM. אמנם לא מתייחס כיצד להגדיל את איכות הנתונים^13,17 או את המהירות של רכישת סדרת הטיה^18,19, פרוטוקול זה מתמקד בעיקר באסטרטגיות כדי לייעל את יעילות הזמן של הגדרת הפעלות cryoET אוטומטי בקנה מידה גדול. לכן, יישום הפרוטוקול המוצג מיועד לאותם מדענים המקימים זרימות עבודה לאיסוף נתונים של CryoET המעוניינות למקסם את התשואה של רכישת נתונים אוטומטית על ידי הגדלת זמן המיקרוסקופ הזמין לרכישת סדרת הטיה.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן הוא חלק ממסמך מקיף יותר המיוצר על ידי פלטפורמת השירות EMBL CryoEM הכולל הוראות וצילומי מסך יסודיים הממחישים את כל ההליך של הפעלת cryoET טיפוסית, כולל טעינת דגימה, מיפוי רשת, כוונון מיקרוסקופ, הגדרת נקודות רכישה ואיסוף נתונים אוטומטי. ניתן להוריד את הפרוטוקול המלא בקישור הבא: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. תנאים מוקדמים

1. התקן את SerialEM גירסה 3.8 והגדר כדי לשלוט במיקרוסקופ ובגלאי (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
2. התקן מופע דמה של SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
3. התקן את PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. מיפוי רשת

1. טען קלטת עם רשתות לתוך הטוען האוטומטי של המיקרוסקופ.
2. הגדר תנאי הדמיה המתאימים למיפוי הרשת כולה. בצע זאת בהגדלה הנמוכה ביותר האפשרית תוך התחשבות בשדה הראייה של הגלאי בו נעשה שימוש (EFTEM SA 2250x). שמור את תנאי ההדמיה כמצב הדמיה של SerialEM כדי להפוך את הדברים לנוחים לשימוש מאוחר יותר.
3. הגדרת מונטאז' מלא
   1. פתח את תפריט נווט טוריEM.
   2. בחר מונטיוג ורשתות.
   3. בחר הגדר מונטאז' מלא.
4. הפעל את Grid_Mappingקובץ ה- Script . אפשר לקובץ ה- Script להמתין עד שהמטען האוטומטי יתקרר; בצע מלאי ולאחר מכן מפה כל רשת שמצאה שגרת המלאי. הזן הודעת דואר אלקטרוני באמצעות תפריט סדרת הטיה כדי לאפשר לקובץ ה- Script לשלוח הודעת דואר אלקטרוני בנוחות בסיום.
5. שמור את הנווט.
6. בדוק את כל מפות הרשת מנווט SerialEM ובחר איזו רשת למפות עוד יותר בהגדלה גבוהה יותר.
   הערה: TEMs רבים המצוידים במערכת טעינה אוטומטית יציגו סיבוב של הרשת בעת טעינה מחדש. עדיף למפות מחדש כל רשת לאחר טעינה מחדש. מערכות חלופיות סובלות בדרך כלל רק ממשמרות מסוימות, שניתן לתקן ב- SerialEM באמצעות הליך Shift To Marker.

3. הגדרת המינון הנמוך של SerialEM

1. הגדר את ההגדלה של מצבי תצוגה ותצוגה מקדימה במינון נמוך של SerialEM (הדבר נדרש עבור שלב 6).
2. השג תמונת תצוגה ושמור אותה כמפה בנווט.
3. השג תמונת תצוגה מקדימה ושמור אותה כמפה בנווט.
   1. הגדר את שני המצבים לאותה binning (מומלץ binning 4). הדבר מאפשר לשמור את שתי המפות בערימת תמונות אחת.
   2. בחלון נווט SerialEM, שנה את התווית של מפת התצוגה לתצוגה ואת התווית של מפת התצוגה המקדימה לתצוגה מקדימה.
   3. שמור וסגור את קובץ הנווט.
      הערה: אין צורך ביעד עבור תמונות התצוגה והתצוגה המקדימה הראשוניות, PyEM ישתמש בהגדרות ההדמיה שלהן בלבד.

4. מיפוי ריבועי רשת

1. הגדר את תנאי ההדמיה למיפוי ריבועי רשת. יש חשיבות רבה להיות מסוגל לראות את המדגם של עניין ואת התפלגות חרוזים fiducial. כדי להבטיח ניגודיות מיטבית עבור מפות מרובעות של רשת, בצע את השלבים הבאים.
   1. הוסף צמצם אובייקטיבי.
   2. אם ישים, הכנס את חריץ מסנן האנרגיה.
   3. השתמש בפירוק של -100 מיקרומטר.
2. מסך לריבועי רשת טובים המתאימים למיפוי נוסף. לאחר בדיקה חזותית של הריבועים ממפת הרשת, קח תמונות בדיקה של הריבוע עם תנאי ההדמיה שישמשו למפות ריבועיות רשת.
3. כאשר מזוהה ריבוע טוב, סמן את המרכז שלו בתמונת מפת הרשת באמצעות התכונה הוספת נקודות של נווט SerialEM.
4. לאחר הוספת כל הנקודות, בנווט הטורי- ים הקש Shift + A בנקודה הראשונה ולאחר מכן הקש Shift + A בנקודה האחרונה.
   הערה: כל הנקודות שנוספו מסומנות כעת על-ידי A, כלומר כולן נקודות רכישה.
5. הקש Shift + N (צור קובץ חדש בפריט) בנקודה הראשונה ולאחר מכן שוב בנקודה האחרונה. בתיבת הדו-שיח שעולה, בחרו 'תמונות מונטג'ד'.
6. כאשר תיבת הדו-שיח של מונטאז' מוקפצת, הגדר גודל מונטאז' המכסה ריבוע רשת אחד. הדבר תלוי בהגדלה ובגודל רשת הרשתות המשמשות ובדרך כלל דורש 2 x 2 עד 4 x 4 מונטאז'ים. תן לו שם עם מספר (למשל, squaremap_01.mrc) כדי לאפשר ל- SerialEM למספר באופן אוטומטי בנוחות את כל הקבצים לריבוע רשת.
7. התחל את מיפוי הרשת על-ידי פתיחת תפריט נווט SerialEM ולחץ על רכוש בפריטים.
8. בתפריט הנפתח, בחר באפשרויות הבאות.
   1. בחר יוסנטריות גסה.
   2. בחר באפשרות 'השג תמונת מפה' .
   3. בחר סגור שסתומי עמודה בסוף.
   4. בחר שלח דואר אלקטרוני בסוף.

5. בחירת המטרות

1. פתח מופע SerialEM דמה. ניתן להגדיר זאת במחשב SerialEM השולט במיקרוסקופ או במחשב אחר (תמיכה) אם שני המחשבים חולקים חיבור רשת.
2. לאחר מיפוי ריבוע הרשת הראשון, השתמש באפשרות התפריט נווט טורים טורי אם מזג כדי לראות את המונטאז' במופע SerialEM הדמה.
3. לחץ פעמיים על חלון הנווט כדי לפתוח מפה מרובעת של רשת.
4. חפש במפה והשתמש באפשרות נווט טוריEM דמה הוסף נקודות כדי להוסיף נקודות רכישת תמונה ביעד העניין.
5. לאחר מיפוי הריבועים החדשים, שמור את קובץ הנווט ומזג שוב את הנווט; המשך עד למיפוי כל ריבועי הרשת.

6. יצירת מפות וירטואליות

1. שוב, מזג את קובץ הנווט עם מופע SerialEM הדמה.
2. הפעל את קובץ ה- Script של מפות וירטואליות של PyEM מתפריט SerialEM דמה, כלים ובחר מפות עוגן וירטואליות. פעולה זו עשויה להימשך זמן מה בהתאם לגודל ולכמות של מפות ריבוע הרשת וההרחבה של מפות התצוגה והתצוגה המקדימה.
   הערה: PyEM מפעיל חלון פקודה שנסגר באופן אוטומטי בסיום, ולאחר מכן ניתן לפתוח את קובץ הנווט החדש. לפי מפה מונטג'ית המכילה נקודות נבחרות, PyEM כותב מפה ממוזגת אחת ואת כל מפות התצוגה והתצוגה המקדימה שלה. לבסוף, הוא כותב קובץ נווט חדש בשם <navigatorfilename>_automaps.nav.

7. כוונון מיקרוסקופ

1. תבדוק את כוונון המיקרוסקופ. כדי להבטיח ביצועי מיקרוסקופ נאותים, השתמש באותה הגדלה ובהגדרת גודל קרן לרכישת נתונים, בסדר הבא.
   1. הפעל את היישור נטול התרדמת של SeriaLEM על ידי CTF (Tableau זמלין).
   2. הכנס ומרכז צמצם אובייקטיבי.
   3. הפעל אסטיגמציה נכונה SerialEM על ידי CTF (סטיגמה אוטומטית).
   4. הפעל GIF כוונון מהיר (כלומר, רק לחתוך פוקוס).
      הערה: כשלבים 7.1.1, 7.1.3 ו- 7.1.4 עשויים לדרוש שיעור מינון גבוה יותר, רק יש לשנות את גודל הספוט; אין לשנות את גודל הקרן מכיוון שהדבר גורם להטיית קרן, מה שהופך את הכוונונים ללא נכונים. שלבים 7.1.1, 7.1.2 ו- 7.1.3 הם אוטומטיים למחצה בקובץ Script זמין לציבור זה (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. הגדרת נווט

1. ב- SerialEM, פתח את קובץ הנווט החדש בשם _automaps.nav.
   הערה: V_yyyy הן מפות התצוגה P_yyyy הן מפות התצוגה המקדימה. מפות התצוגה המקדימה מוגדרות כנקודות רכישה.
2. בחלון נווט SerialEM, בטלו את הבחירה בכל נקודות A, בחרו את המפה V_yyyy הראשונה, בחרו 'כיווץ', לחצו על A פעמיים וביטול הבחירה באפשרות 'כיווץ'.
3. בחר את מיקום V_yyyy הראשון, הקש Shift + Tולאחר מכן בחר את המיקום V_yyyy האחרון והקש Shift + T שוב.
4. בחרו 'תמונות מסגרת בודדת' במאפייני הקובץ לפתיחה של תיבת הדו-שיח.
5. בתיבת הדו-שיח הבאה מאפייני קובץ, בחר את הפרמטרים הרצויים בהתאם לצרכי ההדמיה והגדרת המכשיר.
6. כאשר תתבקש, תן שם עם מספר (למשל, TS_001.mrc) ולחץ על שמור.
   הערה: SerialEM יספור אוטומטית את שמות הקבצים עבור כל סדרות הטיה.
7. הגדר את בקר סדרת הטיה עבור מיקום TS הראשון. בסיום, לחץ על אישור כדי להגדיר פרמטרים אלה עבור כל סדרות הטיה לאחר פריט רכישה זה. כל מפות התצוגה המקדימה נבחרות כעת כ- TS (סדרת הטיה) עם שם קובץ ממוספר TS_xxx.mrc.
   הערה: ניתן לשנות את הפרמטרים באופן ידני מאוחר יותר באמצעות התכונה Navigator TSparams; שינויים יחולו עבור כל הפריטים כלפי מטה ברשימה. למשתמש יש אפשרות להפעיל קובץ Script מותאם אישית במקום את סדרת הטיה.

9. הגדר את עמדות המיקוד/המסלול

1. הגדר את מרחק המיקוד/הרצועה עבור כל יעד במידת הצורך (ודא כי SerialEM מינון נמוך מופעל).
2. לחץ פעמיים על מפת התצוגה כדי לטעון אותה.
3. בחר את מפת התצוגה המקדימה ברשימה נווט.
4. בחר ערוך מוקד בחלון הנווט.
5. בחלונית 'בקרה במינון נמוך', בטלו את הבחירה באפשרות 'סובב ציר בין אזורים' כדי למקם את הניסיון ואת הפוקוס לאורך ציר הטיית הבמה.
6. לחץ על האזור הרצוי במפת התצוגה שנטענה כדי להגדיר את מיקום המוקד/גירסת הניסיון עבור סדרת הטיה זו.
7. ודא שלפריט הנווט יש TSP מוגדר כעת; חזור על ההליך עבור כל הפריטים.
   הערה: מיקומי מיקוד/מעקב מועתקים באופן אוטומטי כלפי מטה בנווט. לכן, אם מיקום המיקוד/הרצועה עבור הפריט הקודם בצד הנכון והמרחק הנכון, אין צורך לשנות אותו עבור הפריט הנוכחי.

10. הגדרת סקריפטים נוספים

1. שני סקריפטים מטפלים בטווח המיקוד: פרטומו ו- במהלך . התסריט של Pretomo פועל לפני כל סדרת הטיה וקובץ Script במהלך כל הטיה.
2. ערוך את טווח המוקד ב- pretomoשל קובץ ה- Script .
3. בתפריט סידרת הטיה של SerialEM, סמן את הפעל Script ב- TS ובחר את מספר ה- Script של קובץ ה- Script במהלך.

11. לרוץ

1. בדוק את רמת מיכל החנקן.
2. בדוק אם נבחר טורבו אוטומטי.
3. בדוק את השטח הפנוי לאחסון נתונים.
4. בתפריט קובץ SerialEM, בטל את הבחירה בשמירה רציפה עבור קובץ יומן הרישום וסגור קובץ יומן רישום הפתוח כעת. כל סדרת הטיה תקבל קובץ יומן רישום משלה.
5. בתפריט נווט, לחץ על רכוש בפריטים.
6. הפעל את התסריט PreTomo.
7. בחר פעילות ראשית השג סידרת הטיה.
8. בחר הפעל קובץ Script לאחר פוסט-טומו.
9. בחר סגור שסתומי עמודה בסוף.
10. בחר שלח דואר אלקטרוני בסוף.
11. לחץ על GO.
    הערה: SerialEM תשלח דואר אלקטרוני לכל סדרת הטיה, מוצלחת או שגיאה; עם זאת, ניתן גם שמשמעותה היא שלא הושג טווח הטיה מלא.

Results

הליך זה שימש לרכישת סדרת הטיית Sars-Cov-2 המתוארת בטורונובה ואח' 2020²⁰; ערכת הנתונים כולה הופקה באמצעות שלוש רשתות נפרדות על פני שלושה מפגשי מיקרוסקופיה ב- EMBL היידלברג. המחקר הנוכחי יתמקד ויתאר את המפגש הראשון בן 3 הימים (~72 שעות) עם הרשת הראשונה.

לאחר שהרשת כולה מופתה בהגדלה נמוכה (כ-10 דקות, ראו שלב 2), נבחרו 71 ריבועים מתאימים במפת הרשת, ומפות הגדלהבינוניות (מפות מרובעות)נרכשו עם הגדרות (הגדלה, חשיפה, נטרול) המאפשרות הדמיה ישירה וזיהוי של מדגם העניין, נגיפי קורונה במקרה זה (ראה שלב4) (איור 1A). זמן הרכישה היה ~ 3 דקות לריבוע, 3 שעות 45 דקות בסך הכל.

ברגע שהמפה המרובעת הראשונה נוצרה, מופע SerialEM דמה (ללא כל שליטה במצלמה או במיקרוסקופ) נפתח במחשב נפרד כדי לדמיין את המפה הריבועית ולהוסיף נקודות על יעדים המתאימים לרכישת סדרת הטיה (ראה שלב 5) (איור 1B). מפות מרובעות שנרכשו לאחרונה אוחזרו על-ידי מיזוג נווט ה- SerialEM הדמה הנוכחי עם הנווט ממופע SerialEM המתקדם. לאחר ~ 2 h של רכישת ריבוע רשת ובחירה, ניתן לזהות 50 מטרות ראשוניות.

לאחר סיום רכישות המפה המרובעת, SerialEM במינון נמוך הוגדרה ותמונות תצוגה ותצוגה מקדימה של הפניה נלקחו ונשמרו כמפות (ראה שלב 3). לאחר מכן ניתן להשתמש במפות האחרונות באופן מיידי במופע SerialEM הדמה כדי ליצור, מתמונות המפה הריבועית המתאימות, את המפות תצוגה וירטואלית (איור 1C) ותצוגה מקדימה וירטואלית (איור 1D) של 50 היעדים שנבחרו עם חבילת התוכנה PyEM, לזמן עיבוד של ~ 30 דקות (ראה שלב 6). זמן עיבוד זה על מושב SerialEM הדמה שימש לביצוע הכנות סופיות של המיקרוסקופ לרכישה: כוונון מסנן אנרגיה, רכישת תמונה הפניה למצלמה חדשה, יישור אסטיגמציה וללא תרדמת של העדשה האובייקטיבית.

לאחר השלמת כוונון המיקרוסקופ ומפות וירטואליות מ- 50 היעדים הראשוניים שנוצרו, הנווט בפועל של SerialEM שישמש לרכישה (ראה שלב 8), נקבעו עמדות מיקוד ומעקב (שלב 9) וניתן היה להתחיל ברכישת סדרת הטיה (ראה שלבים 10 ו- 11). מפות התצוגה הווירטואלית (איור 1C) שימשו לריכוז ראשוני של היעד ( איור1E) ואחריו ריכוז סופי שבוצע בהגדלת הרכישה בפועל של סדרת הטיה (איור 1F) באמצעות מפת התצוגה המקדימה הווירטואלית ( איור1D).

החל ממיפוי רשת בשעה 9:30 בבוקר, רכישת סדרת ההטיה עבור 50 היעדים הראשוניים החלה בערך בשעה 15:00. עם ההגדרות המשמשות לרכישה טומוגרפית (ראה התייחסות לפרטים), סדרת הטיה לקח ~ 20 דקות לרכוש, עם מספיק מטרות אז לרוץ לאורך כל הלילה. בזמן שהרכישה פעלה, ניתן היה לבדוק את שאר המפות המרובצות ולתוספות יעדים נוספים, עדיין כבויים באמצעות מופע SerialEM הדמה. 121 יעדים נוספים נבחרו בין המפות המרובעת הנותרות ונוספו לנווט SerialEM הרכישה לאחר שנוצרו מפות וירטואליות עבור יעדים חדשים אלה, מספיק כדי לפעול עד להשלמת הפעלת 72 שעות.

הליך זה (המסוכם באיור 2) אפשר, ביום עבודה אחד, להגדיר 171 יעדים לרכישות טומוגרפיות אוטומטיות עבור הפעלת מיקרוסקופ של 72 שעות (3 ימים).

איור 1: דוגמה למפה מרובעת עם מפות וירטואליות מייצגות ורכישות מתאימות לאחר ריכוז. (A)מפה מרובעת מייצגת של רשת קריום Sars-Cov-2 המשמשת בטורונובה ואח '²⁰. ארבעה אזורים מעניינים מסומנים בצלב אדום. הגדלת מיקרוסקופ היא פי 2,250. (B)חתוך מהמפה המרובעת המדגישה את האזורים ששימשו ליצירת המפות תצוגה וירטואלית (כתומה) ותצוגה מקדימה וירטואלית (צהובה) עבור מפת התצוגה הווירטואלית של היעד שנבחר (צלב אדום) (C). (D)מפת תצוגה מקדימה וירטואלית. (ה)רכישה בפועל של תצוגה לאחר מרכוז באמצעות מפת התצוגה הווירטואלית כהפניה. הגדלת מיקרוסקופ היא פי 11,500. (F)0° הטיה רכישה מסדרת הטיה לאחר ריכוז באמצעות מפת תצוגה מקדימה וירטואלית כהפניה. הגדלת מיקרוסקופ היא פי 64,000. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זרימת עבודה שלהפעלת CryoET באמצעות SerialEM עם כלי PyEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מטכניקת נישה, cryoET התבגרה כעת לשיטה נפוצה לביצוע מחקרים מבניים ברמה התאית והמולקולרית ברזולוציה חסרת תקדים^21,22. הביקוש ההולך וגדל להדמיית cryoEM הכביד על המשאבים המוגבלים הזמינים לגישה לטכנולוגיה זו. למרות פתיחתם של מספר מתקני cryoEM לאומיים ומאמציהם של מכונים מדעיים להגדיל את יכולת TEM שלהם כדי לתמוך בצרכי הקהילה ברחבי העולם, הגישה למכשירי cryoEM עדיין מוגבלת ולכן יש להשתמש ביעילות בזמן הזמין לאיסוף נתונים על ידי המשתמשים כדי למקסם את התפוקה של כל מפגש מיקרוסקופיה. הצורך לרכוש מאות סדרות הטיה בשילוב עם הזמן המוגבל הזמין לאיסוף נתונים קרא לשגרת רכישת תמונות חדשנית כדי להשיג תפוקה טובה יותר מבלי להתפשר על איכות הנתונים. ההתפתחויות האחרונות בתהליכי עבודה של חומרה והדמיה הגבירו במידה ניכרת את מהירות רכישת סדרת הטיה^18,19, וכתוצאה מכך שינוי דרמטי של היחס בין הזמן שהושקע כדי להגדיר נקודת רכישה וזמן הדרוש לרכישת סדרת הטיה בפועל. בסך הכל, ההליך להקמת נקודות רכישה הופך לאחד צווארי הבקבוק העיקריים לתפוקה ברת השגה של מפגשי cryoET.

הפרוטוקול הממוטב שהוצג כאן איפשר לנו להגדיר, במצב לא מקוון, 171 עמדות לרכישה טומוגרפית אוטומטית ביום הראשון של הפעלת cryoET בזמן שהמיקרוסקופ היה מעורב באופן פעיל בפעולות אחרות (למשל, מיפוי ריבועי, כוונון ורכישת סדרת הטיה אוטומטית), ובכך מבלי להשפיע על זמן המיקרוסקופ הזמין לאיסוף נתונים. בנוסף למקסם את התפוקה של הפעלת cryoET, צינור זה מקטין באופן דרסטי את משך הזמן המושקע על ידי המשתמש בשלב ההכנה של הפעלת איסוף נתונים אוטומטית. בפרוטוקול המתואר, המשתמש מתבקש לעיין בריבועי הרשת הממופים כדי לזהות אזורים מתאימים של עניין ולהוסיף אותם לנווט EM טורי כנקודות רכישה. לאחר מכן, כל היעדים יעובדו באופן אוטומטי באצווה בתוך SerialEM על-ידי הכלי PyEM לייצור המפות הווירטואליות¹⁶. לפיכך, הגישה החישובית המוצגת מהירה בהרבה מרכישת מפות עיגון אמיתיות על-ידי ביטול תקופות ההמתנה הקשורות לתנועת הבמה, רכישת תמונות, שינוי תנאי ההדמיה בין תצוגה לתצוגה מקדימה, ועל-ידי חזרה על שלבים אלה תוך התמקדות בהגדלה גבוהה. בנוסף, כמו כל תמונה שנרכשה מובילה הצטברות של מינון אלקטרונים על אובייקט עניין²³, השימוש במפות וירטואליות עבור יישוב מחדש מדויק של המטרות מפחית את נזקי הקרינה שהוצגו בשלב ההכנה של מפגש cryoET לפני רכישת סדרת הטיה בפועל. הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש במפות וירטואליות ביניים וגבוהות (תצוגה מקדימה ותצוגה, בהתאמה) לכיוון מחדש של היעד לפני רכישת סדרת הטיה. הליך זה יכול להשתנות בקלות רק כדי להשתמש רק בהגדלת ביניים הצג תמונה כאשר דיוק היישור הוא בעל חשיבות פחותה, למשל, במקרה של מבנים גדולים שבהם דיוק היעד האולטימטיבי הוא פחות^{דאגה 10} או עבור דגימות ניתוח חלקיקים בודדים כי הם מפוזרים בצורה גרועה על רשת ההקפאה הדורשת את הבחירה הידנית של המשתמש של כל נקודת רכישה^{24, 25.} לבסוף, גישה המבוססת על שימוש לא מקוון של מופע SerialEM דמה גם מקלה על הגדרת נקודות רכישה באמצעות חיבור מרחוק על ידי מזעור הצורך בנוכחות הפיזית של המשתמש במיקרוסקופ, ובכך מאפשרת גמישות רבה יותר מבחינת הארגון התפעולי של המתקן.

ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה ובשיטות עבור cryoET שיפרו באופן דרסטי את המהירות והאמינות של הפעלות איסוף נתונים אוטומטיות. עם זאת, נדרשות התפתחויות נוספות כדי לטפל בשלבים הנותרים של הגבלת התעריפים בשיטה זו. בעיקר, השלב הראשוני של מיפוי רשת וגלבוע הופך כעת לאחד צווארי הבקבוק העיקריים של הגדרת ההפעלה, ובכך יוצר את הצורך בשיפורי חומרה שמטרתם להגביר את המהירות של תנועות שלב מיקרוסקופ ורכישת תמונה על ידי גלאי אלקטרונים ישירים. בנוסף, פיתוח גישות למידת מכונה לאוטומטיות מלאה של תהליך זיהוי היעד יהיה קריטי כדי למנוע את הצורך של הבדיקה החזותית של המשתמשים לבחירת אזורי העניין, הליך שגוזל זמן רב המסתמך על המומחיות של המשתמשים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוסקופ			הפרוטוקול שלנו מבוסס רק על זרימות עבודה חישוביות. המשתמש יזדקק רק לגישה ל-TEM מכל סוג שהוא