מאמר שיטה

הדמיה תלת מימדית של אוכלוסיות תאי חיסון ברקמות נגועות ב- HIV באמצעות ניקוי, צביעה חיסונית, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות בהירות

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62441

⸱

6 במאי 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Medicine, University of California San Diego

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ניקוי רקמות, בשילוב עם מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, מאפשר הדמיה מרחבית וכימות של אוכלוסיות תאי חיסון וחלבוני נגיף בתוך רקמות שלמות. חתך אופטי של רקמות מנוקות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי ויריעות קלות יכול ליצור מודלים תלת מימדיים של סביבות רקמות מורכבות ולחשוף הטרוגניות מרחבית המוצגת במהלך זיהום HIV.

תקציר

נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV), הגורם לתסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס), הוא בעיה בריאותית עולמית גדולה עם כמעט 40 מיליון אנשים שנדבקו ברחבי העולם ואין תרופה נגישה באופן נרחב. למרות מאמצים אינטנסיביים, הבנה מפורטת של אינטראקציות הנגיף ותאי המארח ברקמות במהלך ההדבקה ובתגובה לטיפול נותרה חלקית. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, טכניקות ניקוי רקמות על בסיס מים CUBIC (קוקטיילים ברורים, ללא הפרעה של הדמיית מוח/גוף וניתוח חישובי) ו-CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel) מיושמות כדי להמחיש אינטראקציות מורכבות של תא מארח וירוס ברקמות נגועות ב-HIV ממודלים של בעלי חיים ובני אדם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית ויריעות אור. חתך אופטי של רקמות שלמות וניתוח תמונה מאפשר שחזור מהיר של מידע מרחבי הכלול ברקמות שלמות וכימות אוכלוסיות תאי חיסון במהלך זיהום. שיטות אלו ישימות לרוב מקורות הרקמה ולשאלות ביולוגיות מגוונות, כולל מחלות זיהומיות וסרטן.

מבוא

הצורך הגובר בהדמיה כמותית של רקמות מרחביות במחקר ביולוגי הוביל לאחרונה להופעתן של טכניקות ניקוי רקמות ליצירת תמונות בנפח גדול יותר (מ"מ3 ס"מ3) של רקמות שלמות ברזולוציה של תא בודד. רקמות כוללות ארגונים מורכבים של ביומולקולות עם מבנים, הרכבים ופונקציות מוגדרים באופן ייחודי. למרבה הצער, ביומולקולות רבות הקיימות ברקמות (למשל, ליפידים וכרומופורים) מפזרות, סופגות או פולטות אור בעת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור, מה שמקשה על הדמיה בנפח גדול. יתר על כן, רקמות מציגות לעתים קרובות מקדם שבירה שאינו תואם לתמיסות הדמיה סטנדרטיות ועדשות אופטיות, וכתוצאה מכך עיוותים אופטיים במהלך ההדמיה. גישה אופטימלית להדמיית כמויות גדולות של רקמות במיקרוסקופ אור צריכה לכלול התאמת מקדם השבירה של רקמות, פתרונות הדמיה ומטרות, תוך מתן אפשרות לחדירת אור לעומק הרקמה מבלי לשבש את התכונות הביולוגיות של רקמות שלמות במהלך העיבוד. ניסיונות ראשוניים להפחית את ההבדלים במקדם השבירה בין רקמות לתמיסות הדמיה באמצעות ניקוי דגימות רקמה אטומות בוצעו על ידי האנטומיסט הגרמני ורנר שפלטהולץ בסוף המאה ה-19. טכניקת ניקוי רקמות זו כללה ממיסים כימיים קשים, שעלולים לפגוע בדגימות רקמות, אך בכל זאת ייצגה את ההדמיה הראשונה שדווחה בנפח גדול יותר של רקמות שלמות. שיטות מיקרוסקופ אור מודרניות, בשילוב עם כוח מחשוב ללכידת וניתוח תמונה, הביאו לאחרונה את ניקוי הרקמות לאופנה שוב כשיטה להדמיית דגימות רקמה גדולות ושלמות ברזולוציה של תא בודד. במהלך שני העשורים האחרונים הופיעו עשרות טכניקות מתקדמות לניקוי רקמות, כולל אורגניות ומבוססות מים, כל אחת עם חוזקות וחולשות ליישומים ספציפיים.

הדמיית רקמות תלת מימדית יכולה לחקור אינטראקציות ביולוגיות מורכבות יותר שלא ניתן לשחזר בתרבית תאים. לדוגמה, דפוסי איתות תאים2, התפלגויות מרחביות של סוגי תאים מובחנים3 וקישוריות מוחית4 מופו בעבר בצורה כמותית באמצעות שיטות הדמיה של רקמות/איברים שלמים. מתואר כאן יישום של פרוטוקולי ניקוי רקמות על בסיס מים כדי לנקות, לצבוע חיסון ולדמיין אוכלוסיות תאי מטרה מובחנות של HIV בתוך רקמות לימפה נגועות ב-HIV שלמות במהלך זיהום פעיל. בתוך הגוף, HIV מדביק בעיקר תאי CD4+ T ומשלב עותק של הגנום שלו בגנום של תאי מארח נגועים. לאחר מכן הנגיף חוטף את מנגנון התא המארח הנגוע כדי לשכפל את עצמו, וכתוצאה מכך הפצת הנגיף, הרג תאי מארח, תפקוד לקוי של מערכת החיסון והתקדמות ארוכת טווח לעבר איידס. חשוב לציין כי ההתנהגויות של תאי T נגועים ברקמות ובתרבית תאים שונות באופן בולט. תאי CD4+ T מתורבתים שהודגרו עם HIV יכולים לייצר סינסיטיה מסיבית הנגרמת על ידי HIV שעשויה לכלול עשרות גרעינים5, בעוד שניסויים דומים עם תאי T ראשוניים CD4+ שגודלו בהידרוג'לים של מטריצה חוץ-תאית תלת מימדית (ECM) או דגימות רקמה מעכברים אנושיים נגועים ב-HIV (hu-mo-mome) מניבים בדרך כלל סינסיטיה עם 2-5 גרעינים6. הבנת העברה מקומית מתא לתא והפצה מערכתית של הנגיף בקרב אנשים נגועים ב-HIV היא ככל הנראה מסובכת עוד יותר, וכוללת הובלה של הנגיף על ידי סוגי תאים נגועים מרובים מרקמות לכלי דם לרקמות חדשות, שם נגיפים חופשיים ותאים המייצרים וירוסים יכולים לגשת למספר רב של לימפוציטים רגישים7. תרחישים אלה אינם ניתנים כיום לסיכום במערכות תרבית תאים, ורקמות ממודלים של בעלי חיים ובני אדם נותרו משאב חשוב להבנת פתוגנזה של נגיף בהקשר של אורגניזם מורכב עם מערכת חיסון מתפקדת.

הטיפולים האנטי-רטרו-ויראליים הנוכחיים (ARTs) מגדילים מאוד את תוחלת החיים והאיכות של אנשים עם HIV (PWH) על ידי עיכוב שכפול HIV ועצירת התקדמות המחלה לכיוון איידס. לרוע המזל, ART אינו מסלק תאים חיסוניים נגועים סמויים המכילים החדרה של הגנום הרטרו-ויראלי שהם שקטים ואינם מייצרים וירוס באופן פעיל. למרות שהנגיף אינו ניתן לזיהוי בדמם של רוב האנשים המטופלים ב-ART, עומסי הנגיף מתאוששים במהירות לאחר הפסקת ART והתקדמות המחלהממשיכה 8. האופי המתמשך של זיהום HIV הנגרם על ידי המאגר הסמוי של תאים נגועים מהווה מכשול עצום לביסוס תרופה ל-HIV. מאגרי רקמות של HIV נותרו לא מובנים היטב, וחיוני לבסס הבנה מעמיקה יותר של מאגרים אלה ברקמות הלימפה לפני, במהלך ואחרי ART, כדי לאפיין לחלוטין את הפתוגנזה של הנגיף ולהעריך טיפולים חדשים המחסלים ביעילות תאים נגועים סמויים שאינם מייצרים נגיף באופן פעיל.

כאן, CUBIC3 ו-CLARITY9, שני פרוטוקולים לניקוי רקמות על בסיס מים שהותאמו בעבר, יושמו כדי לדמות אוכלוסיות של תאים חיסוניים בתוך רקמות לימפה שלמות רבות מעכברים נגועים ב-HIV עם מערכת חיסון אנושית (hu-momase), פרימטים לא אנושיים נגועים ב-SIV/SHIV (NHP) ובני אדם נגועים ב-HIV. פרוטוקולים אלה ניתנים להתאמה הן למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית והן למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות קלות בהתאם למטרות ההדמיה (רזולוציה גבוהה יותר לעומת נפח גדול יותר) והמכשור הזמין. למרות שמיקרוסקופ אור אינו יכול לפתור נגיפים בודדים, השימוש באימונופלואורסצנציה יכול לזהות אזורים ברקמה המכילים וירוסים ותאים מייצרי וירוסים שניתן לנתח עוד יותר בשיטות ברזולוציה גבוהה יותר. ניתן להתאים את השיטות המוצגות כאן כדי לדמיין כמעט כל רקמה בגוף ברזולוציה של תא בודד על מנת לכמת את היחסים המרחביים בין סוגי תאים ספציפיים בתנאים שונים במהלך ההדבקה וניתנות לתרגום בקלות לדגימות חולים אנושיות רלוונטיות ביותר לחקר מחלות זיהומיות או סרטן.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים מוסדיים מאושרים לטיפול בבעלי חיים. כל הרקמות האנושיות נרכשו על פי הנחיות אתיקה מוסדיות מאושרות של מחקר אנושי.

1. קציר רקמות וקיבוע (זהה ל-CUBIC ו-CLARITY)

  1. זהה ונתח את רקמות הלימפה כפי שתואר קודם לכן10.
  2. כרתו את רקמות הלימפה בעזרת מספריים ופינצטה תוך דקות לאחר המוות, כאשר הדבר אפשרי בבטחה.
  3. הנח דגימות רקמה במאגר קיבוע טרי וקר כקרח המכיל 8% פרפורמלדהיד (PFA), 5% סוכרוז ב-0.1 M נתרן קקודילאט טריהידרט כדי לשמר כראוי את דגימות הרקמה למיקרוסקופ אור (LM), מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) או אימונו-EM. לחלופין, תקן את הדגימות עבור LM עם 4% PFA ב-0.1 M PBS. תקן את הדגימות למשך הלילה לפני תחילת תהליך הניקוי כדי להבטיח השבתה מלאה של הנגיף.
    זהירות: פרפורמלדהיד רעיל במגע עור ובשאיפה והוא גם מוצק דליק; יש לטפל בזהירות ולאחסן בארון אחסון דליק. נתרן קקודילאט טריהידרט רעיל בבליעה או בשאיפה.
  4. צלם תמונת ייחוס של הרקמה לפני תחילת תהליך הניקוי.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות LM לפחות שנה אחת בתנאים אלה. כדי לעבוד עם דגימות המבטאות חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגניים, שמור תמיד את הדגימות בחושך בשלבים הבאים.

2. ניקוי רקמות מעוקב

  1. שטפו את דגימות רקמת הלימפה ב-0.1 M PBS סטרילי שלוש פעמים עם ניעור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי להבטיח הסרת PFA במהלך כל החלפת חיץ.
    הערה: השלך את הנוזלים המכילים PFA בהתאם להנחיות המוסד.
  2. טבלו את דגימת רקמת הלימפה ב-CUBIC Reagent-1 (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים עם ניעור עדין. צלם תמונות ייחוס רגילות כדי לעקוב אחר תהליך הסרת הצבע לאורך זמן.
  3. החלף את המגיב -1 למשך 3-4 ימים נוספים של טבילה, או עד להשלמת הסרת צבע הרקמה. הזמן הנדרש לניקוי תלוי הן בנפח והן בסוג הרקמה. כדי להאיץ את תהליך הסרת צבע הרקמות, רענן את המגיב CUBIC -1 מדי יום והשתמש בנפחים גדולים יותר.
  4. שטפו את דגימות רקמת הלימפה שלוש פעמים עם 0.1 M PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.
  5. טבלו את דגימות רקמת הלימפה ב-CUBIC Reagent-2 (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך 2-7 ימים או עד להשגת שקיפות מלאה. אם הדגימות אינן משיגות שקיפות מלאה, חזור על שלבים 2.2-2.5 עד שהניקוי לא מתקדם יותר. צלם תמונות ייחוס קבועות כדי לעקוב אחר תהליך הסליקה לאורך זמן.
  6. שטפו את דגימות רקמת הלימפה שלוש פעמים עם 0.1 M PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.
  7. אחסן את הדגימות ב-CUBIC Reagent-2 עם 0.01% נפח/נפח (V/V) נתרן אזיד בחושך (ראה טבלת חומרים).
    הערה: ניתן לאחסן את הדגימות לפחות 6 חודשים בשיטה זו.
    זהירות: נתרן אזיד רעיל מאוד ומהווה סכנת שאיפה חמורה. מומלץ לרכוש תמיסות מדוללות של 5% נתרן אזיד או פחות.

3. חסימה וצביעה חיסונית של דגימות מעוקבות

  1. שטפו את דגימות רקמת הלימפה שלוש פעמים עם 0.1 M PBS למשך 30 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.
  2. כדי לצלם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, חותכים את הרקמה לפרוסות בעובי ~0.5-1 מ"מ באמצעות מטריצת פורס רקמות. כדי לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור (LSFM), חסום את כל אזור הרקמה.
  3. חסום את הדגימות עם 5 מ"ל של תמיסת חסימת CUBIC למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם טלטול (ראה טבלת חומרים). בעת עבודה עם NHP או דגימות אנושיות, השתמש ב-FcR אנטי-אנושי. בעת עבודה עם דגימות עכבר, השתמש ב-FcR נגד עכבר בפתרון החסימה.
  4. לצבוע את הדגימות ב-5 מ"ל של נוגדנים ראשוניים (ראה טבלת חומרים) בתמיסת חסימה (ללא FcR ספציפי למין) למשך 3 ימים בטמפרטורת החדר עם ניעור (אופציונלי: צנטריפוגה של מלאי הנוגדנים המרוכז ב-2,300 x גרם למשך 5 דקות לפני השימוש, כדי להפחית את הוספת הנוגדנים המצטברים).
  5. שטפו את הדגימה המוכתמת בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך פרק זמן מינימלי של 5 שעות בסך הכל עם לפחות חמש החלפות של מאגר תמיסת כביסה (ראה טבלת חומרים).
  6. יש לצבוע את הדגימות בנוגדנים משניים (ראה טבלת חומרים) בתמיסת חסימה (ללא FcR ספציפי למין) למשך 3 ימים בטמפרטורת החדר עם ניעור (אופציונלי: צנטריפוגה של הנוגדנים ב-2,300 x גרם למשך 5 דקות לפני השימוש כדי למזער את צבירת הנוגדנים).
  7. שטפו את הדגימה המוכתמת חמש פעמים בתמיסת כביסה בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך 5 שעות לפחות בסך הכל.
  8. צבעו את הדגימות ב-5 מ"ל של תמיסת צביעה DAPI (ראה טבלת חומרים) לכל דגימת רקמה ודגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אפשר לדגימות להישאר בתמיסת הכתמים DAPI בחושך ב-4 מעלות צלזיוס להדמיה מאוחר יותר.
  9. שטפו את דגימות רקמת הלימפה בתמיסת כביסה שלוש פעמים בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך 30 דקות כל אחת.
  10. טבלו את הדגימה המוכתמת ב-CUBIC Reagent-2 למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך לפני הרכבת הדגימה.

4. ניקוי רקמות בהירות

  1. שטפו את דגימות רקמת הלימפה ב-0.1 M PBS סטרילי שלוש פעמים עם ניעור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כל אחת כדי להסיר PFA.
  2. מניחים את דגימות הרקמה ב-15 מ"ל של תמיסת אקרילאמיד טרייה ודוגרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם תסיסה עדינה (ראה טבלת חומרים).
    אזהרה: אקרילאמיד לא מפולימר הוא רעלן עצבי רב עוצמה הנספג בקלות דרך העור. יש להימנע מכל מגע עם העור ולשטוף מיד אם נוצר מגע.
  3. אפשר לדגימות הרקמה להתחמם לטמפרטורת החדר.
  4. אופציונלי: הסר את דגימות הרקמה על ידי בעבוע חנקן לתמיסת האקרילאמיד למשך דקה אחת. הקפד להשתמש בקצב זרימה נמוך המונע התזת אקרילאמיד רעיל לא פולימרי (~1-2 בועות/שניות).
  5. מניחים את דגימות הרקמה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות לפילמור, והופכים כל 15 דקות. הסר את הדגימות ברגע שמתגלה פילמור מורגש, כפי שמצוין על ידי נוזל צמיג, הופעת קווי שלרן בזמן הערבוב, או היווצרות קפסולה שקופה סביב הרקמה.
    הערה: אם מתרחשת פילמור מלא של תמיסת האקרילאמיד, חתוך את עודפי ההידרוג'ל מהדגימה והמשך בפרוטוקול.
  6. שטפו את דגימות הרקמה עם 0.1 M PBS סטרילי שלוש פעמים למשך 30 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין להסרת תמיסת אקרילאמיד.
  7. הנח את דגימות הרקמה לתוך 15 מ"ל של 8% SDS ב-0.1 M PBS ב-37 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין למשך 2-5+ ימים כדי לאפשר ניקוי. רענן מעת לעת את תמיסת ה-SDS של 8% והשתמש בעד 50 מ"ל של התמיסה כדי להאיץ את הניקוי, במידת הצורך. הפסק את תהליך הסליקה כאשר הדגימות שקופות מבחינה ויזואלית או שאינן מתקדמות עוד. צלם תמונות ייחוס קבועות כדי לעקוב אחר תהליך הסליקה לאורך זמן.
  8. שטפו את דגימות הרקמה עם 0.1 M PBS סטרילי חמש פעמים במשך יום אחד בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.
  9. שמור את הדגימות באופן זמני ב-0.1 M PBS (בתוספת 0.01% נפח/נפח (v/v) NaN3 לאחסון לטווח ארוך יותר) בחושך עד שיהיו מוכנים לצלם פלואורסצנטיות אנדוגנית.
  10. הנח את הרקמה לתוך 5 מ"ל של אמצעי הדמיה RI-2 (ראה טבלת חומרים). דגירה למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך כדי לוודא את שלמות תהליך הפינוי לפני צביעה חיסונית. צלם תמונות התייחסות כדי לנטר את שקיפות הרקמות.

5. חסימה וצביעה חיסונית של דגימות CLARITY

הערה: שלבים אלה דומים לחסימה וצביעה חיסונית של רקמות מנוקות CUBIC אך משתמשים בתכשירים שונים לחסימה, שטיפה וצביעה.

  1. שטפו את דגימות רקמת הלימפה שלוש פעמים עם 0.1 M PBS למשך 30 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.
  2. כדי לצלם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, חותכים את הרקמה לפרוסות בעובי ~0.5-1 מ"מ באמצעות פורס רקמות ומטריצה של 0.5 מ"מ. כדי לבצע LSFM, חסום את כל דגימת הרקמה.
  3. חסום את הדגימות עם 5 מ"ל של תמיסת חסימת CLARITY (ראה טבלת חומרים) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם ניעור.
  4. יש לצבוע את הדגימות ב-5 מ"ל של נוגדנים ראשוניים (ראה טבלת חומרים) בתמיסת חסימה (ללא FcR ספציפי למין) למשך 3 ימים בטמפרטורת החדר עם ניעור (אופציונלי: צנטריפוגה של הנוגדנים ב-2,300 x גרם למשך 5 דקות לפני השימוש כדי למזער את צבירת הנוגדנים).
  5. שטפו את הדגימה המוכתמת חמש פעמים עם תמיסת הכביסה בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך 5 שעות לפחות בסך הכל (ראה טבלת חומרים).
  6. צבעו את הדגימות ב-5 מ"ל של נוגדנים משניים (ראה טבלת חומרים) בתמיסת חסימה (ללא FcR ספציפי למין) למשך 3 ימים בטמפרטורת החדר עם ניעור (אופציונלי: צנטריפוגה של הנוגדנים ב-2,300 x גרם למשך 5 דקות לפני השימוש כדי למזער את צבירת הנוגדנים). כדי לקצר את אורך הפרוטוקול הכולל, השתמש בנוגדנים ראשוניים מצומדים עם פלואורופורים כדי לבטל את הצורך בדגירה עם נוגדנים משניים.
  7. שטפו את הדגימה המוכתמת חמש פעמים עם תמיסת הכביסה בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך 5 שעות לפחות בסך הכל.
  8. צבעו את הדגימות ב-5 מ"ל של תמיסת צביעה DAPI (ראה טבלת חומרים) לכל דגימת רקמה ודגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אפשר לדגימות להישאר ב-4 מעלות צלזיוס בחושך בתמיסת כתמי DAPI להדמיה מאוחר יותר.
  9. שטפו את דגימות רקמת הלימפה בתמיסת הכביסה שלוש פעמים בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך 30 דקות בכל פעם.
  10. הנח את הרקמה ב-5 מ"ל של אמצעי הדמיה RI-2 (R.I. = 1.46) ודגר למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך לפני הרכבת הדגימה (ראה פרוטוקול שלב 6 ו-7).

6. הרכבה והדמיה של דגימות רקמה שנוקו למיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. קלף צד אחד של שכבת המגן של מבודד סיליקון דביק.
  2. הדביקו זכוכית כיסוי מיקרוסקופ (22 מ"מ x 40 מ"מ, עובי 0.25 מ"מ) לצד הקלוף של מבודד הסיליקון כדי ליצור חלל חסין נוזלים לדגימה.
  3. קלף את הצד השני של שכבת המגן של מבודד הסיליקון הדביק.
  4. הנח את הדגימה להדמיה במרכז מבודד הסיליקון, ולאחר מכן הוסף CUBIC Reagent-2 או Imaging Media RI-2 לפי הצורך עד שמשטח הנוזל יהיה גבוה כמו קצה המבודד.
  5. כדי למזער את הלכידה של בועות אוויר בתוך מבודד הסיליקון, יישר ושכב בעדינות את זכוכית הכיסוי השנייה כלפי מטה מצד אחד באמצעות מלקחיים EM. נגב את כל הנוזלים העודפים. לחץ בעדינות על זכוכית הכיסוי סביב באר הדגימה באמצעות החלק האחורי של המלקחיים כדי לאטום את הדבק. אחסן את הדגימות המותקנות אופקית בחושך.
    הערה: ניתן לצלם דגימות שבועות עד חודשים לאחר הרכבתן; עם זאת, איכות ההדמיה בדרך כלל יורדת עם הזמן.
  6. הנח את השקופית המותקנת על המיקרוסקופ stage ואתר את הדגימה באמצעות אור לבן ומטרת הגדלה נמוכה יותר (2-10x).
  7. הגדר את פרופיל רכישת הקרינה על סמך הפלואורופורים הבודדים שנבחרו.
    הערה: מומלץ לרכוש בנפרד תעלות פלואורופור נפרדות. זה מביא לזמן רכישה ארוך יותר אך מפחית חפיפה ספקטרלית ורכישת אות פלואורסצנטי לא ספציפי. פרופיל פלואורופור נפוץ יכול לכלול DAPI (450 ננומטר), Alexa488, Alexa594 ו-Alexa647 (או שילובים קשורים) כדי למזער חפיפה ספקטרלית במהלך רכישת תמונה.
  8. בחר מטרת הגדלה מתאימה לאזורי התמונה המעניינים. השתמש ביעדי הגדלה נמוכים יותר (2-10x) להדמיה בנפח גדול יותר או רקמה שלמה ברזולוציית תא בודד והשתמש ביעדי הגדלה גבוהים יותר (20-63x) להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר של פרטים תת-תאיים ברקמה מנוקה. התאם את מקדם השבירה של המטרות, אמצעי ההדמיה והרקמות בצורה הדוקה ככל האפשר כדי למזער את הכנסת העיוותים האופטיים במהלך רכישת התמונה.
  9. בחר גודל צעד לרכישת Z-stack. למטרות הגדלה נמוכות יותר (2-10x), בחר גודל צעד של ~3-5 מיקרומטר כדי לזהות פלואורסצנטיות מתא בודד במספר פרוסות Z רציפות למידול תלת מימד תוך הפחתת זמן הרכישה הכולל וגודל הקובץ הכולל. עבור יעדי הגדלה גבוהים יותר (20-63x), בחר גודל צעד של ~1 מיקרומטר או פחות כדי למזער את אובדן המידע התת-תאי בין פרוסות Z בודדות.
  10. הגדל את שדה הראייה כדי להמחיש את כל אזור הרקמה שיש להדמות בממדי X ו-Y עם כמה שפחות שטח פנוי. הגדר את קואורדינטות הרכישה העליונות והתחתונות של שלב Z המקיפות את כל אזור העניין שיש לצלם.
  11. רכוש את תמונות Z-stack. שמור וייצא את הקובץ לעיבוד לאחר שימוש בכל תוכנה לניתוח תמונות. עבור חבילות תוכנה מסוימות, המר את הקבצים לסוגי קבצים ספציפיים (למשל, .tiff, .ome-tiff, .jpeg וכו'). בצע את ההמרה באמצעות כל תוכנה לרכישת תמונות מיקרוסקופ או תוכנה חינמית לניתוח תמונות (למשל, ImageJ/Fiji).

7. הרכבה והדמיה של הדגימות בתא LSFM או בקובטה

  1. מלא את תא ההדמיה ב-CUBIC Reagent-2 או RI-2 בהתאם לפרוטוקול הספציפי בו נעשה שימוש. הימנע מהיווצרות בועות בזמן העברת הנוזל. הסר את הבועות העודפות בעזרת פיפטה.
  2. טבלו את הדגימה בתא ההדמיה והגבילו את תנועת הדגימה.
    הערה: בהתאם למיקרוסקופ הספציפי בו נעשה שימוש, זה יכול לכלול הטמעת הדגימה באגרוז, השעיית הדגימה ממתאם וו או דורבן, הדפסת תלת מימד של מחזיק דגימה, או הצמדת הדגימה עם דבק לצלחת פלסטיק.
  3. מקם את המטרה בתמיסת ההדמיה, ממוקדת בדגימה. השאירו את הדגימה המותקנת בתא ההדמיה למשך מספר שעות או למשך הלילה כדי לאפשר שיווי משקל מלא של תמיסות ורקמות בקובטה.
  4. רכוש Z-stack של אזור עניין (ראה שלבים 6.7-6.11 לרכישת תמונה).
    הערה: גישה זו יכולה לאפשר הדמיה של נפחי רקמות גדולים מ-1 ס"מ3 ברזולוציה של תא בודד.

8. שחזור פני השטח וכימות תאים עם תוכנת ניתוח תמונות אימאריס

הערה: שלבים אלה ספציפיים לתוכנת ניתוח התמונה של Imaris, אך ניתן לבצע שלבי עיבוד תמונה דומים באמצעות חבילות תוכנה אחרות (למשל, ImageJ/Fiji, Aivia, Arivis, Amira וכו').

  1. השתמש בממיר הקבצים של Imaris כדי להמיר את קובץ התמונה Z-stack לפורמט המקורי של Imaris .ims. זה יקל על המרת קבצים מהירה יותר תוך מזעור שגיאות המרה ובעיות תוכנה פוטנציאליות לאחר הפתיחה.
    הערה: חלק מרכיבי ה-LSFM החדשים יותר מאפשרים למשתמש לשמור קבצים ישירות בתבנית .ims.
  2. גרור את קובץ ה- .ims לניתוח לאזור הזירה של תוכנת Imaris. התאימו את הניגוד או העוצמה של כל אחד מערוצי הצבע באמצעות החלונית Display Adjustment . לחץ על הסמל הוסף משטחים חדשים בפינה השמאלית העליונה.
  3. לחץ על הבא: ערוץ מקור (הסמל הכחול עם חץ המצביע ימינה). בחר את ערוץ המקור של המשטח לבנייה. אל תשנה את הפרמטרים האחרים.
  4. לחץ על הבא: סף (הסמל הכחול עם חץ המצביע ימינה).
  5. להתאמת הסף (עוצמה מוחלטת), גררו את קו הסף שמאלה או ימינה. הפעל פיצול נוגע באובייקטים והזן את קוטר התא הממוצע במיקרונים כתקן הפיצול למערכת כדי להניב נקודות רבות כמקור לכל משטח בודד.
    1. אל תכלול אותות פלורסנט קטנים מדי או בהירים מדי מכיוון שהם יכולים לייצג חפצי כתמים או מיקרוסקופ פוטנציאליים. כלול רק את הנקודות בעלות גדלים ועוצמות פלואורסצנטיות מקובלות על ידי שינוי קוטר התא הממוצע בהתאם.
      הערה: קוטר התא הממוצע ישתנה עבור רקמות או סוגי תאים ספציפיים, אך בדרך כלל ישכון בין 5-15 מיקרומטר.
  6. לחץ על הבא: סיווג משטחים (הסמל הכחול עם חץ המצביע ימינה מסומן). התאימו את המשטחים שייכללו בגרירת קו הסף שמאלה או ימינה. ודא שהמשטחים מתקרבים בדיוק לאות הקרינה הגולמי, תוך הפרדת אות הקרינה מתאים בודדים.
  7. לחץ על סיום: בצע את כל שלבי היצירה וסיים את האשף (הסמל הירוק עם שני חצים המצביעים ימינה מסומן). המשטח בנוי רשמית.
  8. לחץ על הסמל השישי שכותרתו סטטיסטיקה בחלונית השמאלית כדי לראות את מספר התאים, בנסיבות אלה, את מספר המשטחים עבור ערוץ הצבע הספציפי שנותח.
  9. ודא שלארבעת המשתנים מספר הרכיבים המנותקים לנקודת זמן, מספר המשטחים לנקודת זמן, המספר הכולל של הרכיב המנותק והמספר הכולל של המשטחים יש את אותו מספר, שהוא ספירת התאים של אותו ערוץ צבע.

תוצאות

ניקוי רקמות כרוך בטיפול ברקמות משומרות באמצעות קוקטיילים כימיים כדי לחלץ ביומולקולות אטומות מהרקמה תוך שמירה על ארכיטקטורת הרקמות. פתרונות ניקוי רקמות אלה תואמים את מקדם השבירה של הרקמה למדיום ההדמיה שמסביב כדי למזער עיוותים אופטיים, לשפר את יחס האות לרעש עמוק בתוך הרקמות ולמזער אוטופלואורסצנציה ברקע. שני פרוטוקולים מבוססי מים לניקוי רקמות אופטיות, CUBIC3 ו-CLARITY9, שימשו לניקוי דגימות עכבר, פרימטים לא אנושיים ורקמות אנושיות שנשמרו נגועים ב-HIV/SIV לפני צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיה עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית ויריעות קלות.

עבור פרוטוקול CUBIC , הרקמות הקבועות נשטפו עם PBS כדי להסיר מקבעים וטבלו ב-CUBIC Reagent-1, תמיסה בסיסית של אמינואלכוהולים הפולטת כרומופורים כגון הם, וכתוצאה מכך דה-קולוריזציה והסרת שומנים של רקמות (איור 1, למעלה). נפחי רקמות קטנים יותר (~ מ"מ3) ניתנים להסרת צבע לאחר 3 ימי טיפול ב-CUBIC Reagent-1, אך נפחי רקמות גדולים יותר (~ ס"מ3) או רקמות עם כמות גדולה של הם (כגון כבד, טחול או לב) דורשים זמני דגירה ונפחי תמיסה ארוכים יותר (> חודש ו~50 מ"ל), כמו גם החלפה תכופה של התמיסה כל 2-3 ימים. לאחר הסרת הצבע, הרקמות נשטפו והונחו ב-CUBIC Reagent-2, תמיסה המכילה סוכרוז עם מקדם שבירה של כ-1.48-1.49, התואמת את מקדם השבירה של הרקמה ומגבירה את העברת האור. הרקמות שנוקו עברו צביעה חיסונית והורכבו בתמיסה של CUBIC Reagent-2 לפני הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי או יריעת אור. ההשפעות של הליך פינוי CUBIC צולמו עבור מספר רקמות hu-mouse ו-NHP בגדלים וריכוזים שונים של כרומופורים (איור 2). ניקוי אופטי הפך את הרקמות לשקופות לעין בלתי, ואפשר לראות קווי רשת וטקסט על גיליונות נייר "דרך" הרקמה. רקמות עשירות בכרומופור כמו הטחול, הכבד, מח העצם והלב עשויות שלא לשנות את צבען לחלוטין, אך נשארות מתאימות לצביעה חיסונית ולהדמיה (איור 2 ואיור 5).

עבור פרוטוקול CLARITY, רקמות קבועות נשטפו עם PBS כדי להסיר מקבעים ולאחר מכן הודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתמיסת אקרילאמיד 40% עם יוזם תרמי ליצירת קשרים קוולנטיים בין חלבונים בדגימה לבין מונומרים של אקרילאמיד (איור 1, למטה). למחרת, לאחר שהרקמה הותאמה לטמפרטורת החדר ולאחר מכן התחממה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, החלה פילמור אקרילאמיד ועטפה במהירות את הדגימה בהידרוג'ל. הדגימה טופלה בתמיסה של 8% SDS במשך 2-5 ימים להסרת שומנים אטומים. מיד לפני הצביעה הפלואורסצנטית, הדגימה הייתה שקועה בתמיסת התאמת מקדם שבירה (RIMS) עבור CLARITY (Imaging Media RI-2) המכילה 90% מדיום שיפוע בצפיפות לא יונית. עבור רקמות המכילות כמויות גדולות של הם, ניתן להוסיף שלב הסרת צבעבסוף שלב הסרת הצבע 9,11,12. התקדמות פינוי CUBIC ו-CLARITY הושוו בחלקים שונים של אותה דגימת טחול אנושית (איור 3). ניקוי CLARITY מייצר ג'ל פוליאקרילאמיד גלוי העוטף את התמיסה ובדרך כלל מציג דה-קולוריזציה מופחתת בהשוואה לניקוי CUBIC אלא אם כן מתווסף שלב הסרת צבע נוסף 9,12.

לאחר מכן, בשני הפרוטוקולים, רקמות נקיות ושלמות הוצבעו במערכת החיסון כדי לזהות אוכלוסיות ספציפיות של תאים חיסוניים. הדגימות נשטפו, נחסמו עם מגיב המכיל α-FcR כדי להפחית את קשירת הנוגדנים הלא ספציפיים, ונצבעו במשך 3 ימים בעת שימוש בנוגדנים ראשוניים המצומדים ישירות לפלואורופור. לחלופין, הדגימות נצבעו במשך 3 ימים בנוגדנים ראשוניים לא מצומדים ואחריהם 3 ימים נוספים עם נוגדן משני מצומד לפלואורופור. הרקמות נשטפו שוב, ולאחר מכן הודגרו עם כתם DAPI למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס להדמיה גרעינית. הדגימות נשטפו והודגרו ב-CUBIC Reagent-2 למשך 24-36 שעות או ב-Imaging Media RI-2 (CLARITY) למשך הלילה בחושך. עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית, רקמות הורכבו על שקופית מיקרוסקופ ב-RIMS המתאים לפני ההדמיה (איור 4). עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור (LSFM), הדגימות הושקעו לחלוטין ב-RIMS בקוביית הדמיה למשך הלילה לפני ההדמיה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית של רקמות לימפה שלמות, נקיות ומוכתמות חיסון אפשרה הדמיה בו-זמנית של אותות פלואורסצנטיים מרובים, כולל גרעינים, סמני תאי חיסון וחלבוני HIV/SIV CA (קפסיד) (איור 5). תאים מייצרי וירוס נקבעו על ידי קולוקליזציה פלואורסצנטית של סמני תאים חיסוניים וחלבוני HIV. טחול אנושי נקי ומוכתם, נגוע ב-HIV, חשף מספר תאי CD3+ T הממוקמים במקביל ל-HIV p24, מה שמעיד על נוכחות של תאים מייצרי וירוסים באזור של רקמה שלמה (איור 5A-D). בלוטות לימפה NHP שנוקו ונגועות ב-SHIV חשפו את ההתפלגות של תאי T CD3+ ומקרופאגים CD68+ באזורי רקמה שלא זוהה בהם וירוס (איור 5E) בנוסף לאזורים עם תאים רבים המייצרים וירוסים (איור 5F). תוצאות אלה הראו כי תאים מייצרי וירוסים ממקורות רקמה מגוונים ניתנים להבחנה מתאים אחרים בשדה ראייה נתון ואפשרו זיהוי של אירועים ביולוגיים נדירים בסביבת רקמה מורכבת.

חתך אופטי של רקמות מנוקות עם מיקרוסקופ קונפוקלי יושם כדי ליצור ערימות Z ומודלים תלת מימדיים של פני השטח, שחשפו את ההטרוגניות התאית המוצגת במהלך זיהום HIV (איור 6). ערימות Z שולבו מחדש לתמונת הקרנת Z באמצעות חבילת התוכנה Imaris (איור 6A) וערוץ הגרעין DAPI הוסר לצורך הדמיה ברורה של תאי CD3+ T וחלבון קפסיד HIV (p24) פלואורסצנטי על פני נפחי רקמה שלמים (איור 6B). הקרנת הקרנת Z חולקה אוטומטית עם תוכנת Imaris כדי ליצור מודל פני שטח תלת מימדי משוחזר להדמיה מרחבית וכימות של אות הקרינה לאורך כל מחסנית Z (איור 6C). ניתוח המודל התלת-ממדי של פני השטח חשף 546 תאי CD3+ T ו-218 תאים המייצרים HIV p24. באופן מצטבר, רכישת Z-stack של אימונופלואורסצנציה מרקמות לימפה נקיות ונגועות ב-HIV אפשרה יצירת מודלים תלת מימדיים של הרכב התאים בתוך הרקמה וכימות אוטומטי של אוכלוסיות תאי חיסון בתוך נפחי הרקמה.

LSFM של רקמות לימפה שלמות, נקיות וצבועות חיסון איפשר הדמיה אימונופלואורסצנטית בנפח גדול יותר (IF) של התפלגות תאים חיסוניים ותאים מייצרי וירוסים ברקמות הלימפה (איור 7). צביעה חיסונית של רקמת המעי הגס מעכבר נגוע ב-HIV עבור תאי T hCD3+ ו-HIV p24 חשפה מוקדים של תאים מייצרי וירוסים המפוזרים על פני אזורים גדולים של רקמה ללא עדות לזיהום (איור 7A). תצוגה מוגדלת של מוקדי תאים מייצרי וירוסים חשפה תאים מייצרי וירוסים רבים בסמיכות לתאי מטרה פוטנציאליים (איור 7B). אוטופלואורסצנציה של רקמות (אובך אדום) שימשה כדי להמחיש את כל ארכיטקטורת הרקמה תוך הבחנה בין אוכלוסיות ספציפיות של תאי חיסון בתוך הרקמה שנצבעו בצורה בהירה יותר מאשר האוטופלואורסצנציה (אליפסות אדומות). מודל תלת-ממדי של כל נפח ה-Z-stack של LSFM הראה את ההתפלגות המרחבית של מוקדי תאים מייצרי וירוסים בתוך אזור של רקמה שלמה, ואיפשר מיפוי של מיקומי ייצור הנגיף ביחס לארכיטקטורת הרקמה הכוללת (איור 7C). באופן מפתיע, מוקדים של תאים מייצרי וירוס היו לעתים קרובות מפוזרים בין אזורים גדולים של רקמה ללא עדות לייצור נגיף. תוצאות אלו יכולות לאפשר כימות של פרמטרים של התפלגות הנגיף וצפיפות התאים הנגועים ברקמות שונות ובזמנים שונים של הדבקה או תגובה לטיפולים שונים.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה של ניקוי רקמות CUBIC ו-CLARITY טיפוסיות, צביעה חיסונית והדמיה. זמני פינוי CUBIC (עליון) ו-CLARITY (תחתון) יכולים להשתנות מאוד בהתאם לגודל וסוג הרקמה. לניקוי CLARITY, נדרש שלב דגירה נוסף עם מדיה מותאמת לאינדקס שבירה לפני צביעה חיסונית כדי לוודא שהרקמה נקייה. צביעה חיסונית אורכת בדרך כלל 3 ימים כאשר נוגדנים ראשוניים מצומדים לפלואורופורים ו-6 ימים אם נדרשים נוגדנים משניים פלואורסצנטיים. ניתן לצלם דגימות עם קונפוקלי או LSFM. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פינוי מעוקב של דגימות רקמת hu-mouse ו-NHP. בהתאם לצפיפות השונה של הם ושומנים של דגימות הרקמה, הזמן הדרוש לניקוי כל סוג רקמה משתנה. לדוגמה, המעי הגס והתריסריון דורשים בדרך כלל תקופות קצרות יחסית (~7 ימים), בעוד שלטחול ולכבד לוקח זמן רב יותר להפוך לשקופים (~30 יום). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: השוואה אורכית של שיטות פינוי רקמות על דגימות אנושיות. CUBIC (לוחות עליונים) ו-CLARITY (לוחות תחתונים) ניקו טחול מאדם נגוע ב-HIV שקיבל טיפול אנטי-רטרו-ויראלי. שתי השיטות ניקו רקמה כראוי עד היום ה-32 לצביעה חיסונית והדמיה. שלב הסרת הצבע בשיטת CUBIC מפחית באופן ניכר את האוטופלואורסצנטיות הנגרמת על ידי נוכחות הם הכלול בדגימות טחול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הרכבה לדוגמה עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית. דגימות הותקנו בין כיסויים שהופרדו במבודדי סיליקון דבקים 0.5-1 מ"מ. מבודדי סיליקון הוצמדו לכיסוי הראשון ורקמה הונחה במרכז הבאר (למעלה). הבאר מולאה בשפות עד שהמניסקוס התיישר עם ראש הבאר או מעט מעליו (משמאל). הכיסוי השני הונמך בזהירות למקומו מצד אחד למשנהו, תוך הימנעות מבועות (למטה). הכיסויים הודבקו במלואם למבודד הסיליקון על ידי הפעלת מכשיר קהה בעדינות סביב היקף הבאר (מימין). הדגימות צולמו במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: מיקרוסקופיה קונפוקלית של טחול אנושי נקי ושלם ובלוטות לימפה NHP. (א-ד) רקמה אנושית נגועה ב-HIV נצבעה עבור HIV-1 p24 (ירוק), תאי T hCD3+ (אדום) וגרעינים (ציאן). (E) פרוסת Z קונפוקלית של בלוטת לימפה CUBIC מנוקה מ-NHP נגוע ב-SHIV 8 שבועות לאחר ההדבקה צבועה חיסונית עבור תאי CD3+ T (מגנטה), מקרופאגים CD68+ (mac/אדום), SHIV p27 (ירוק) וגרעינים (כחול). שדה הראייה מכיל תאי T, מקרופאגים וסוגי תאים אחרים, אך אין עדות לתאים המייצרים SHIV (ירוק). F) פרוסת Z קונפוקלית של אזור סמוך באותה בלוטת לימפה המראה הבדלים בצפיפות התאים ובמספרם יחד עם נוכחות של תאי CD3+ T המייצרים וירוס (חיצים ירוקים) ומקרופאגים CD68+ (חיצים צהובים). (ג-י) תצוגה מוגדלת של אזורים נבחרים של צביעה בעמ' 27 מ-(F). פסי קנה המידה הם 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: נפח מחסנית Z ומשטח משוחזר בתלת מימד מטחול אנושי נגוע ב-HIV. (A) תמונת הקרנת Z מערימת Z בגודל 600 מיקרומטר x 600 מיקרומטר x 100 מיקרומטר של רקמת טחול אנושית נגועה ב-HIV צבועה עבור תאי T HIV-1 p24 (ירוק), תאי T hCD3+ (אדום) וגרעינים (ציאן). (B) אותה תמונת הקרנת Z ללא צביעת DAPI גרעינית. (C) מודל משטח תלת-ממדי משוחזר של פלואורסצנטיות CD3 (אדום) ו-p24 (ירוק) מכל נפח מחסנית Z. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: LSFM ושחזור תלת-ממדי של נפחי פני שטח מרקמות נגועות ב-HIV (A) פרוסת Z (1,000 מיקרומטר x 1,000 מיקרומטר) של המעי הגס מעכבר hu-mouse נגוע ב-HIV שצבוע חיסון עבור תאי CD3+ T (אדום) ו-HIV p24 (ירוק). האובך האדום העמום מייצג אוטופלואורסצנטיות של רקמות, בעוד שהפונקטה האדומה המובהקת מצביעה על תאי T. Villi נראים סביב הפריפריה ומצביעים לכיוון הלומן המרכזי עם מספר מוקדים של ייצור וירוס פעיל (חיצים לבנים) המפוזרים באזורים גדולים שאינם מכילים נגיף. התיבה מציינת אזור עניין משוער עבור פאנל B. (B) אזור מוגדל של רקמה המציג וירוס בודד המייצר תאי T hCD3+ (צהוב) בקרבת תאי T לא נגועים (אדום). התמונה סובבה ושונתה לפרוסת Z סמוכה כדי להראות מיקוד של תאים חיוביים p24 במישור Z יחיד. אוטופלואורסצנציה אדומה ברקע מראה ארכיטקטורת רקמה כללית בנוסף לצביעה ספציפית של תאי T hCD3+ (פונקטה אדומה; חיצים לבנים). (C) מודל פני שטח תלת-ממדי של הנפח המלא (1,000 מיקרומטר x 1,000 מיקרומטר x 200 מיקרומטר) שנוצר באמצעות תוכנת Imaris מסובב כדי להראות מוקדים של זיהום HIV (צהוב) במיקומים שונים של המעי. חיצים לבנים מציינים מוקדים בודדים בתוך אמצעי האחסון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

יש לאסוף רקמות לימפואידיות מעניינות במהירות לאחר המוות ולהניח אותן מיד במאגרי קיבוע מקוררים מראש כדי למנוע נמק רקמות (רקמה כהה או שחורה) שעלול להשפיע לרעה על צביעה והדמיה. לאחר קצירת הרקמות הרצויות, טבלו מיד רקמות ב-4%-8% פרפורמלדהיד (PFA) קר כקרח למשך הלילה לקיבוע, מה שגם מנטרל פתוגנים פוטנציאליים הקשורים לדגימות. 4% PFA הוא אופטימלי לקיבוע דגימות LM, בעוד ש-8% PFA יכול לשמר רקמות כראוי הן עבור LM והן עבור EM. ביצוע נהלים אלה ואחסון דגימות בקיבוע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך יכול לשמר ביעילות רקמות להדמיית LM למשך מספר שנים. אזהרה אחת היא שאחסון לטווח ארוך יותר בקיבוע יכול להוביל להכנסת חפצי צביעה, במיוחד מיסוך אנטיגן הנגרם על ידי קישור צולב של חלבונים סמוכים לחלבון המבוקש, מה שיכול לחסום את הנגישות של נוגדנים מכתימים לאפיטופ13,14. אם הרקמות מכילות חלבונים פלואורסצנטיים המתבטאים באופן אנדוגני, נקוט באמצעים כדי להימנע מחשיפת הרקמות לאור במידת האפשר לאורך כל הפרוטוקול. בדרך כלל, חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגניים ישמרו על הקרינה במשך 6-12 חודשים לאחר הקיבוע, אך דגימות רקמה בודדות יכולות להשתנות לפרקי זמן ארוכים או קצרים יותר. אם הקרינה האנדוגנית אובדת עקב פירוק חלבון, לעתים קרובות ניתן לזהות חלבונים פלואורסצנטיים באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון המבוקש. זלוף הוא אפשרות נוספת לקיבוע מהיר של רקמות לפני ניקוי12; עם זאת, בשל חששות בעבודה עם פתוגנים כמו HIV, נבחר מסלול נתיחת הרקמות ואחריו טבילה בקיבוע קר כקרח כדי להכין דגימות בצורה בטוחה ככל האפשר.

יתרון אחד של פרוטוקולי ניקוי על בסיס מים המתוארים הוא שהם בדרך כלל מתונים יותר מפרוטוקולים מבוססי אורגנים, שיכולים לפעמים לפגוע ברקמות שבריריות יותר, כמו למשל הכבד. פרוטוקולי סליקה על בסיס מים ידרשו בדרך כלל זמן ארוך יותר להשגת פינוי מלא של דגימה (שבועות לעומת ימים) בהשוואה לפרוטוקולי ניקוי על בסיס אורגני. ניתן לבצע את פרוטוקולי CLARITY ו-CUBIC מהר יותר באמצעות זלוף כדי לנקות בו זמנית את כל האיברים בתוך מכרסם11,12; עם זאת, זו לא הייתה אפשרות ריאלית עבור NHP ונתיחות שלאחר המוות בבני אדם. דגימות שעובדו עם CLARITY נוטות להראות התרחבות מסוימת של הנפח, בעוד ש-CUBIC חשף השפעה מופחתת על נפח הדגימה9. למרות שבדרך כלל מהירים יותר, פרוטוקולים רבים של ניקוי רקמות מבוססי אורגני גורמים לרקמות לעבור הצטמקות15, מה שיכול להקשות על זיהוי של תאים בודדים או פרטים תת-תאיים בתוך רקמות צפופות תאים כגון בלוטות לימפה וטחול. התרחבות הנגרמת על ידי ניקוי יכולה להגדיל ביעילות את רזולוציית ההדמיה, מה שמקל על התבוננות בהיבטים שיהיה קשה לראות בגודל המקורי של הרקמה. לחלופין, התכווצות רקמות יכולה להקטין ביעילות את הגודל הכולל של הדגימה, מה שיכול לאפשר הדמיית איבר שלם ללא דיסקציה. היתרון של פרוטוקול CLARITY ו-CUBIC הוא שהם משמרים את הקרינה מחלבונים פלואורסצנטיים המתבטאים באופן אנדוגני ברקמה תוך שהם נשארים עמידים לצביעה אימונופלואורסצנטית11,12. צביעה חיסונית יכולה להתבצע בשיטות ניקוי רקמות מימיות או אורגניות; עם זאת, ניסיון אישי הראה שיעור גבוה יותר של תאימות נוגדנים באמצעות פרוטוקולים מבוססי מים בהשוואה לפרוטוקולים מבוססי אורגנים. חוקרים צריכים לשקול באיזו שיטת ניקוי רקמות להשתמש על סמך הרקמות שצולמו והשאלות הביולוגיות שטופלו (למשל, הדמיה של איבר שלם לעומת הדמיה של אזור עניין ספציפי). אין טכניקה אוניברסלית לניקוי רקמות המאפשרת ניתוח מפתח חזק לכל שאלות ההדמיה בנפח גדול והשיטות הזמינות מציגות יתרונות וחסרונות ברורים בהתאם ליישום הביולוגי.

בעת ביצוע צביעת נוגדנים, יש לקחת בחשבון היבטים רבים. מכיוון שדגימות CLARITY מוטמעות בהידרוג'ל אקרילאמיד, הן נוטות לדרוש זמנים ארוכים יותר לדגירה12. הזמן הדרוש לדגירת נוגדנים תלוי גם בנפח ובעובי של כל דגימה. רוב הדגימות שתוארו כאן היו בעובי של ~2-3 מילימטרים, ו-3 ימים הספיקו לצביעה מלאה בכל הרקמה. אם המטרה היא לדמות מוח של עכבר שלם, זמן הדגירה של הנוגדנים יכול להימשך שבוע אחד או יותר12. בחירה בשיטת ניקוי רקמות מימית לעומת אורגנית להדמיה אימונופלואורסצנטית יכולה להיות תלויה בתאימות נוגדנים. באופן כללי, עבור CUBIC או CLARITY, שיעור הפגיעה בנוגדנים הפועלים בתאים וברקמות מתורבתים הוא ~70%. בין אם משתמשים בשיטת ניקוי רקמות מימית או אורגנית, יש צורך להעריך את התאימות והיעילות של כל הנוגדנים לשיטה הספציפית בה נעשה שימוש. כפי שמוצג בסעיף פרוטוקול זה, צביעה חיסונית עבור דגימות מעובדות CUBIC ו-CLARITY מתרחשת לאחר סיום הפינוי. נהפוך הוא, שלב זה מתרחש לפני הליך הסליקה של חלק מהפרוטוקולים המבוססים על אורגנים, ואחריו לאחר התיקון.

חשוב מאוד שהרקמות יהיו שקועות לחלוטין במדיום הדמיה התואם את מקדם השבירה שלהן. כישלון לעשות זאת יכניס סטיות כדוריות בזמן ההדמיה ויעוות את האור שנלכד במהלך רכישת התמונה. יש להקפיד להסיר את כל בועות האוויר ממדיית ההדמיה בעת הרכבת דגימות הן עבור קונפוקלי והן עבור LSFM, שכן בועות עלולות לשבש את נתיב האור אל הדגימה או הרחק ממנה. ניתן להסיר בועות באופן ידני עם פיפטה לפני הרכבת הדגימה הסופית. להדמיית דגימות עבות יותר במיקרוסקופ קונפוקלי, ניתן להניח מספר מרווחי סיליקון זה על גבי זה כדי להכיל רקמות בעובי של יותר מ-0.5 מ"מ. המלצה אחת היא לאזן את כל הרקמות ב-RIMS למשך מספר שעות עד לילה כשהן מותקנות על המיקרוסקופ ללא תנועת דגימה נוספת. שיווי משקל מלא של הרקמה ואמצעי ההדמיה ימנע ערבוב של תמיסות עם מקדמי שבירה לא תואמים שעלולים ליצור סטיות במהלך ההדמיה. חשוב לזכור שבעת הרכבת דגימות רקמה מנוקות, אין שיטת הרכבה סוהרת אחת להדמיית כל הדגימות בכל המיקרוסקופים. פרוטוקול זה דן באפשרויות הרכבה לדוגמא שעבדו בצורה אופטימלית בהקשר אחד, אך ישנן גישות רבות להרכבת דגימה בהתאם למיקרוסקופ האישי בו נעשה שימוש ולשאלה הביולוגית המטופלת. גישות אלו יכולות לכלול, אך אינן מוגבלות להטמעת הדגימה באגרוז, השעיית הדגימה מקו פלסטיק תואם וו או מקדם שבירה, שימוש במתאם דורבן, הדפסת תלת מימד של מחזיק דגימה, או הצמדת הדגימה עם דבק לצלחת פלסטיק.

מיקרוסקופים קונפוקליים יכולים לעבוד היטב להדמיית נפחי רקמות ~ 1 מ"מ3-1 ס"מ3. עבור מיקרוסקופים קונפוקליים, השתמש במטרה של פי 2-10 כדי לאתר תחילה אזורי עניין ולרכוש ערימות Z בנפח גדול יותר או רקמות שלמות ברזולוציה של תא בודד. עבור ליעדים של פי 20-63 לרכישת תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של אזורי עניין ספציפיים עם מידע תת-תאי. המטרה האידיאלית להדמיית רקמות מנוקות CUBIC ו-CLARITY היא מטרה ספציפית ל-CLARITY/Scale המותאמת במדויק לאינדקס השבירה של הרקמה ותמיסת ההדמיה. אם סוג זה של מטרה אינו זמין, עדיף לצלם דגימות עם מטרת טבילה של גליצרול או שמן (למשל, LD LCI Plan-Apochromat 25 x 0.8 NA Imm Corr DIC M27 יעד רב-טבילה: מרחק עבודה = 0.57 מ"מ) ולא מטרה אווירית. זה ימזער את הכנסת עיוותים אופטיים עקב מקדמי שבירה לא תואמים במהלך לכידת תמונה. יעדי 20-25x יכולים לאזן רכישת תמונה בנפח גדול יותר עם השגת פרטי צביעה מתאים בודדים בסביבת רקמות מורכבת. חשוב לציין, רוב המיקרוסקופים הקונפוקליים מכילים מודולים המאפשרים ריצוף תלת מימדי של נפחי הדמיה. סוג זה של רכישת תמונות יכול באופן אידיאלי ליצור ערימות Z בנפח גדול יותר המכילות מידע תת-תאי.

הדמיית LSFM יכולה לאפשר הדמיה תלת מימדית של אוכלוסיות תאים ספציפיות בהקשר של כמויות גדולות של רקמה (>1 סמ"ק) ואפילו איברים שלמים. במהלך 10 השנים האחרונות, ניקוי רקמות בשילוב עם LSFM התמקד בעיקר בהבנת קישוריות מוחית בתוך מכרסמים; עם זאת, יישומים עדכניים יותר כוללים הדמיה של נופים גרורתיים של גידול16, התפלגות תאים בתוך תאים אנטומיים 9,17 ופיזור פתוגן18. בהשוואה לתאים מתורבתים, רוב האירועים הביולוגיים ברקמות אינם אחידים ו-LSFM יכול להיות מיומן במיוחד בהדמיה וכימות של הטרוגניות הרקמה המרחבית של אירועים אלה (למשל, שכפול וירוסים, איתות חיסוני, התפלגות תאים וכו').

ניתן לעבד מערכי נתונים תלת מימדיים שנרכשו באמצעות קונפוקלי או LSFM עם פלטפורמות ניתוח תמונה רבות. חבילת התוכנה של Imaris יכולה לשמש לבניית משטחים, יצירת אנימציה תלת מימדית וכימות תאים; עם זאת, ישנן מערכות ניתוח תמונה רבות זמינות המאפשרות עיבוד וניתוח יעיל של תמונה. התוכנה החינמית ImageJ/Fiji19 היא פלטפורמת עיבוד תמונה חלופית מושכת הנגישה לרוב המעבדות, אך אין תוכנת ניתוח אחת שמתאימה לכולם שמצטיינת בכל צורות הניתוח וההדמיה של תמונות. חבילות תוכנה רבות לניתוח תמונות יכולות להיות יקרות מאוד אם אינן זמינות באמצעות מתקני שימוש משותפים. לבסוף, היבט קריטי של LSFM או מערכי נתונים תלת-ממדיים קונפוקליים גדולים הוא ניהול נתונים. פלטפורמות הדמיה אלו יכולות ליצור קבצים מסיביים (>1 Tb) הדורשים תחנות עבודה ממוחשבות מתקדמות יותר לצורך הדמיה וכימות נתונים. בסופו של דבר, זרימת עבודה זו של הדמיה יכולה לייעל את הרכישה והכימות של אוכלוסיות תאים נבדלות מרחבית בתוך רקמות שלמות והיא ישימה באופן נרחב לרוב מקורות הרקמות והמערכות הביולוגיות.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

תודה לאוניברסיטת אילינוי במכון אורבנה-שמפיין למתקני ליבה של ביולוגיה גנומית על השימוש במיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקליים ויריעות קלות. תודה לאנשים המדהימים מקבוצת "המתנה האחרונה" לדגימות רקמות אנושיות, שמומנו על ידי המענקים הבאים: I147821, DA051915, AI131385 ו-P30 AI036214. תודה לננסי הייגווד ואן הסל על דגימות רקמת NHP נגועות ב-SHIV.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת <חזקה>אקרילאמיד (ב-0.1 מ' PBS, 40 מ"ל בסך הכל)
40% אקרילאמיד: 4 מ"לBio-Rad1610144
VA-044 יוזם תרמי: 0.1 גרםFujifilm011-19365
<תמיסת חסימת בהירות חזקה (ב>-0.1 M PBS, 5 מ"ל בסך הכל)
סרום בקר עוברי (FBS): 200 ומיקרו; Lאטלס ביולוגיF-0500-D
חולדה אנטי אנושית או אנטי עכברית FcR: 50 ומיקרו; LMiltenyi130-092-575 (עכבר) / 130-059-901 (אנושי)
נתרן אזיד (מתמיסת מלאי): 5 ומיקרו; Lסיגמא71289-50G
Tween-20: 5 ומיקרו; תמיסת שטיפה LFisher ScientificBP337-500
CLARITY (ב-0.1M PBS, 50 מ"ל בסך הכל)
נתרן אזיד (מתמיסת מלאי): 50 ומיקרו; Lסיגמא71289-50G
Tween-20: 50 ומיקרו; LFisher ScientificBP337-500
<חזק>תמיסת חסימה מעוקבת (ב-0.1 מיליון PBS, 5 מ"ל בסך הכל)
סרום בקר עוברי (FBS): 200 ומיקרו; Lאטלס ביולוגיF-0500-D
חולדה אנטי אנושית או אנטי עכברית FcR: 50 ומיקרו; LMiltenyi130-092-575 (עכבר) / 130-059-901 (אנושי)
נתרן אזיד (מתמיסת מלאי): 5 ומיקרו; Lסיגמא71289-50G
טריטון X-100: 5 ומיקרו; LVWRM143-1L
<חזק>מגיב מעוקב-1 (ב-0.1 מיליון PBS, 50 מ"ל בסך הכל)
N, N, N', N'-טטראקיס (2-הידרוקסיפרופיל) אתילנדיאמין: 12.5 גרםאולדריץ'122262
טריטון X-100: 7.5 גרםVWRM143-1L
אוריאה: 12.5 גרםפישר כימיקלU15-500
<חזק>מגיב מעוקב-2 (ב-0.1 מיליון PBS, 50 מ"ל בסך הכל)
סוכרוז: 25 גרםסיגמאS1888-500G
נתרן אזיד (בצורת אבקה): 10 גרםסיגמא71289-50G
תמיסת מלאי נתרן אזיד (ב-DI H<תת>2O, 50 מ"ל בסך הכל)סיגמא71289-50G
טריאתנולמין: 5 גרםסיגמא90270-500 מ"ל
טריטון X-100: 50 ומיקרו; LVWRM143-1L
אוריאה: 12.5 גרםתמיסת כביסה כימית פישרU15-500
<חזקה>מעוקבת (ב-0.1M PBS, 50 מ"ל בסך הכל)
נתרן אזיד (מתמיסת מלאי): 50 ומיקרו; Lסיגמא71289-50G
טריטון X-100: 50 ומיקרו; LVWRM143-1L
<חזק>DAPI תמיסת צביעה (0.5 ומיקרו; g/mL)
DAPI פתרון מלאי: 1 ומיקרו; L
תמיסת שטיפה: 10 מ"ל
<חזק>תמיסת מלאי DAPI (5 מ"ג/מ"ל)
אבקת DAPI: 5 מ"גSigma-AldrichD9542-1MG
DMSO (100%): 1 מ"לThermoFisherD12345
<חזק>Imaging Media RI-2 (ב-dH2O)
90% היסטודנזסיגמאD2158-100G
0.01% נתרן אזידסיגמא71289-50G
0.02 מאגר נתרן פוספט, pH 7.5 Sigma-AldrichS9638-250G
0.1% Tween-20Fisher ScientificBP337-500
<חזק>נוגדנים ראשוניים (בתמיסה חוסמת ללא FcR נגד עכברים של חולדות, 2 מ"ל בסך הכל)
עז נגד HIV p24: 10 ומיקרו; L (1:200)אבחון יצירתיDPATB-H81692
עכבר אנטי אנושי CD68: 10 ומיקרו; L(1:200)DakoM0876
ארנב אנטי-אנושי CD3: 10 ומיקרו; L (1:200)DakoA0452
<חזק>8% תמיסת SDS (ב-0.1 M PBS, 50 מ"ל בסך הכל)
אבקת SDS: 4 גרםSigma-AldrichL3771-500G
<חזק>נוגדנים משניים (בתמיסת חסימה ללא FcR נגד עכבר חולדות, 2 מ"ל בסך הכל)
חמור נגד עזים מצומד עם AlexaFluor647: 2 & מיקרו; LInvitrogenA21447
חמור נגד עכבר מצומד עם AlexaFluor594: 2 ומיקרו; LInvitrogenA21203
חמור נגד ארנב מצומד עם AlexaFluor488: 2 ומיקרו; LInvitrogenA21206

מקורות

  1. Spalteholz, W., Barker, L. F., Mall, F. P. Hand-Atlas of Human Anatomy. , J.B. Lippincott Co. Philadelphia. Second edition in English (1907).
  2. Jacob, T., Gray, J. W., Troxell, M., Vu, T. Q. Multiplexed imaging reveals heterogeneity of PI3K/MAPK network signaling in breast lesions of known PIK3CA genotype. Breast Cancer Research and Treatment. 159 (3), 575-583 (2016).
  3. Kieffer, C., Ladinsky, M. S., Ninh, A., Galimidi, R. P., Bjorkman, P. J. Longitudinal imaging of HIV-1 spread in humanized mice with parallel 3d immunofluorescence and electron tomography. eLife. 6, 23282(2017).
  4. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  5. Compton, A. A., Schwartz, O. They might be giants: Does syncytium formation sink or spread HIV infection. PLoS Pathogens. 13 (2), 2-8 (2017).
  6. Symeonides, M., et al. HIV-1-induced small T cell syncytia can transfer virus particles to target cells through transient contacts. Viruses. 7 (12), 6590-6603 (2015).
  7. Sharova, N., Swingler, C., Sharkey, M., Stevenson, M. Macrophages archive HIV-1 virions for dissemination in trans. The EMBO Journal. 24 (13), 2481-2489 (2005).
  8. Colby, D. J., et al. Rapid HIV RNA rebound after antiretroviral treatment interruption in persons durably suppressed in Fiebig I acute HIV infection. Nature Medicine. 24 (7), 923-926 (2018).
  9. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. eLife. 8, 46916(2019).
  10. Buettner, M., Bode, U. Lymph node dissection--understanding the immunological function of lymph nodes. Clinical and Experimental Immunology. 169 (3), 205-212 (2012).
  11. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10, 1860-1896 (2015).
  12. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  13. Sompuram, S. R., Vani, K., Bogen, S. A. A molecular model of antigen retrieval using a peptide array. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 91-98 (2006).
  14. Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. The journal of histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  15. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  16. Guldner, I. H., et al. An Integrative platform for three-dimensional quantitative analysis of spatially heterogeneous metastasis landscapes. Scientific Reports. 6, 24201(2016).
  17. Muntifering, M., et al. Clearing for deep tissue imaging. Current Protocols in Cytometry. 86 (1), 38(2018).
  18. DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 00796(2018).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CUBICCLARITY
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים