הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

8.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62456

⸱

12 באפריל 2021

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California, San Diego School of Medicine, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 3Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

במאמר זה

סיכום

המאמר מתאר הבחנה מכוונת צעד של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים לאורגנואידים תלת ממדיים שלמים של ריאות המכילים תאי ריאה אפיתל פרוקסימליים ודיסטליים יחד עם מזנכיים.

תקציר

התפתחות ריאות אנושיות ומחלות כבר קשה ללמוד בשל היעדר רלוונטי ביולוגית במערכות מודל במבחנה . תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs) ניתן להבדיל צעד לתוך organoids ריאות רב תאיים 3D, עשוי הן אוכלוסיות אפיתל ותאים mesenchymal. אנו מסכמים רמזים התפתחותיים עובריים על ידי החדרה זמנית של מגוון גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי ליצור ביעילות אנדודרם סופי, אנדודרם חותם מראש, ולאחר מכן תאי אב ריאה. תאים אלה מוטמעים לאחר מכן בגורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף מטריצת ממברנה מדיום, המאפשר להם להתפתח באופן ספונטני לתוך organoids ריאות 3D בתגובה לגורמי גדילה חיצוניים. אלה אורגנוידים ריאות שלם (WLO) לעבור שלבים התפתחותיים ריאות מוקדם כולל מורפוגנזה המסתעפת והתבגרות לאחר חשיפה דקסמתזון, AMP מחזורי ואיזובוטילקסנתין. WLOs מחזיקים בתאי אפיתל דרכי הנשימה המבטאים את הסמנים KRT5 (בזאל), SCGB3A2 (מועדון) ו- MUC5AC (גביע) כמו גם תאי אפיתל מכתשיים המבטאים HOPX (סוג מכתשי I) ו- SP-C (סוג מכתשי II). תאים mesenchymal נוכחים גם, כולל אקטין שריר חלק (SMA), קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם A (PDGFRα). ניתן לשמור על WLOs נגזר iPSC בתנאי תרבות תלת-ממדית במשך חודשים רבים וניתן למיין עבור סמני שטח כדי לטהר אוכלוסיית תאים ספציפית. ניתן להשתמש ב-WLOs שמקורם ב-iPSC גם כדי לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, כולל איתות בין אפיתל הריאות למזנשים, כדי לדגמן מוטציות גנטיות על תפקוד והתפתחות תאי הריאה האנושיים, ולקבוע את הציטוקסיות של חומרים מדביקים.

מבוא

הריאה היא איבר מסובך, הטרוגני ודינמי המתפתח בשישה שלבים נפרדים - התבגרות עוברית, פסאודו-לנדולרית, תעלה, סקוקולרית, מכתשית ומיקרו-וסקולרית1,2. שני השלבים האחרונים מתרחשים לפני ולאחר הלידה בהתפתחות האנושית בעוד ארבעת השלבים הראשונים מתרחשים אך ורק במהלך התפתחות העובר אלא אם כן מתרחשת לידה מוקדמת3. השלב העוברי מתחיל בשכבת הנבט האנדיודרמלי ומסתיים עם ניצני קנה הנשימה וניצני הריאות. התפתחות הריאות מתרחשת בחלקה באמצעות איתות בין התאים האפיתל והמנשימלי4. אינטראקציות אלה גורמות להסתעפות ריאות, התפשטות, קביעת גורל תאי ובידול תאי של הריאה המתפתחת. הריאה מחולקת לאזורי ניצוח (קנה הנשימה לספונכיולים סופניים) ולאזורי נשימה (ברונכיולים נשימתיים אל הנפתים). כל אזור מכיל סוגי תאי אפיתל ייחודיים; כולל תאי בסיס, הפרשה, סילציה, מברשת, נוירואנדוקרינית, ויונוציטים בדרכי הנשימה מוליך5, ואחריו תאי I ו- II מכתשיים באפיתל הנשימה6. הרבה עדיין לא ידוע על ההתפתחות והתגובה לפגיעה של סוגי התאים השונים. מודלים אורגנויד ריאות נגזר iPSC לאפשר מחקר של מנגנונים המניעים את התפתחות הריאות האנושיות, את ההשפעות של מוטציות גנטיות על תפקוד הריאות, ואת התגובה של האפיתל ואת mesenchyme לסוכנים זיהומיים ללא צורך ברקמת ריאה אנושית ראשונית.

סמנים המתאימים לשלבים השונים של בידול עוברי כוללים CXCR4, cKit, FOXA2 ו- SOX17 עבור אנדודרם סופי (DE)7, FOXA2, TBX1 ו- SOX2 עבור אנדודרם נוקב מראש (AFE)8, ו- NKX2-1 עבור תאי אב ריאה מוקדמים9. בהתפתחות הריאות העובריות, הניטור מתחלק לוושט הגחון ולקמה הגחוני. ניצני הריאות הימניות והשמאליות מופיעים כשתי ריאות עצמאיות סביב ניצן קנה הנשימה10. במהלך הסתעפות מורפוגנזה, mesenchyme המקיף את האפיתל מייצר רקמה אלסטית, שריר חלק, סחוס, vasculature11. האינטראקציה בין האפיתל למנשים חיונית להתפתחות תקינה של הריאות. זה כולל את הפרשת FGF1012 על ידי mesenchyme ו SHH13 המיוצר על ידי האפיתל.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידול מכוון של hiPSCs לאורגנואידים תלת ממדיים (3D) ריאות שלמות (WLO). אמנם ישנן גישות דומות המשלבות בידוד של תאי אב ריאה באמצעות מיון בשלב LPC כדי להפוך אורגנוידים דמויי כתשית 14,15 (דיסטליים) או אורגנוידים (פרוקסימליים), או ליצור פרונואידים foregut גחוני-קדמוני כדי להפוך אורגנוידים ריאות אנושיים מבטאים תאי מצוחקים וסמנים mesenchymal ו organoids אב ניצן קצה17 כוחה של שיטה זו הוא הכללת סוגי תאי אפיתל ריאות ומזנכימליים לתבנית ולתזמר מורפוגנזה מסועפת ריאות, התבגרות והתרחבות במבחנה.,

פרוטוקול זה משתמש במולקולות קטנות וגורמי גדילה כדי לכוון את ההבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות אנדודרם מוחלט, אנדודרם חיצוני, ותאי צאצא ריאות. תאים אלה מושרים לאחר מכן לתוך אורגנוידים ריאות שלמות 3D באמצעות צעדים התפתחותיים חשובים, כולל הסתעפות והתבגרות. סיכום פרוטוקול הבידול מוצג באיור 1a עם תמונות ייצוגיות של בידול אנדודרמלי ואורגנויד המוצג באיור 1b. איור 1c,d להראות את פרטי ביטוי הגן של בידול אנדודרמלי, כמו גם את ביטוי הגן של אוכלוסיות פרוקסימליות ודיסטליות של תאי אפיתל ריאות לאחר השלמת ההבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של תוכנית הגנות המחקר האנושי של UCSD (181180).

1. אינדוקציה אנדודרמית מוחלטת מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (יום 1 - 3)

  1. לאט לאט להפשיר גורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף ממברנה (BM) מטריצה בינונית על קרח 30 דקות לפני השימוש. ב DMEM / F12 קר, תערובת, לדלל את מטריצת GFR BM בינוני 1:1, כך שהוא מהווה 50% של מדיום זה. מכניסים טיפים לפיפטה P1000 למקפיא לצינון לפני השימוש.
  2. יש לכסות כל באר של צלחת 12 בארות עם 500 μL של מטריצת ממברנה 50% GFR-מרתף מוכן DMEM / F12 קר כקרח. לאחר מספר הבארות הרצוי מצופים, להסיר כל תערובת בינונית עודף ו / או בועות מבארות ומניחים את הצלחת על קרח או מקרר ב 4 °C (75 °F) במשך 20 דקות להגדיר. לאחר מכן, להעביר את הצלחת לאינקובטור ב 37 °C (50 °F) לילה כדי ג'ל ויבש.
  3. ברגע hiPSCs להגיע 70-90% השפעה, להוסיף 10 מיקרומטר של מעכב קינאז הקשורים Rho (ROCK) מעכב Y-27632 שעה לפני הניתוק. שאפו את התקשורת ולשטוף פעם אחת עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). נתק hiPSCs על ידי הוספת בינוני ניתוק תאים (0.5 מ"ל / באר של צלחת 12 טוב) ודגרה במשך 20 דקות ב 37 °C בחממה CO2 5%.
  4. הסר צלחות מן החממה ולהוסיף 0.5 מ"ל / 12-באר של תאי גזע עובר בינוני (טבלה 1) לבארות; תצמצם בעדינות תאים באמצעות קצה P1000 כדי להשיג השעיה של תא בודד. העבר תאים מנותקים לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל; צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
  5. לשאוף את המדיום resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של mTeSR פלוס מדיה בתוספת עם 10 מעכב רוק מיקרומטר (Y-27632). בצע ספירת תאים. הוסף 2.0 x 105 hiPSCs ב 1 מ"ל של mTeSR בתוספת מעכב ROCK Y-27632 לבאר של 12-באר GFR-מרתף קרום בינוני מצופה צלחת. דגירה ב 37 °C (50 °F) לילה.
    הערה: יש למטב את מספר זריעת התא לכל שורת תא. 24 שעות לאחר ה ציפוי, בארות צריך להיות 50%-70% מפגש.
  6. ביום 1, שאפו את mTeSR פלוס ולהוסיף סופי אנדודרם (DE) אינדוקציה מדיה (טבלה 1) בתוספת 100 ננוגרם / מ"ל של activin אנושי A ו 5 מיקרומטר של מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021.
    הערה: DE מדיה עם מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021 יש להסיר בתוך 20-24 שעות של יום 1 דה אינדוקציה לבידול מוצלח.
  7. ביום 2 ויום 3, שינוי למדיית אינדוקציה DE בתוספת 100 ננוגרם / מ"ל של activin A בלבד.
    הערה: דיפרנציה של DE לא תעלה על סך של 72 שעות, או שהיעילות תרד. ביום 4, אם צופים תמותה של תאים גדולים, צמצם את זמן החשיפה הכולל למדיה של DE ב-6-12 שעות.
  8. כדי לנתח את יעילות DE, אשר יותר מ- 90% CXCR4 ו/או ביטוי cKit באמצעות ציטומטריית זרימה או ניתוח אימונופלואורסצנטיות של FOXA2 ו/או SOX17 (איור 2a).

2. אינדוקציה של אנדודרם חיצוני (AFE) (יום 4 – 6)

  1. ביום 4, לשנות מדיה כדי סרום בינוני בזאלי חינם (SFBM) (טבלה 1) בתוספת 10 μM SB431542 ו 2 μM דורסומורפין עבור אינדוקציה AFE. שנה את מדיה של AFE מדי יום למשך 3 ימים (יום 4, יום 5 ויום 6).
  2. כדי לנתח את יעילות AFE, אשר ביטוי חזק של SOX2, TBX1 ו-FOXA2 באמצעות כתמי אימונופלואורסצנטיות (איור 2b).

3. בידול תא אבות ריאות (LPC) (יום 7 - 16)

  1. ביום 7, להפשיר GFR-מרתף מטריצת ממברנה מדיום על קרח. שאפו את מדיה AFE לשטוף היטב עם PBS 1x. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא ודגרה במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F).
  2. הוסף 1 מ"ל של בינוני מרווה (2% FBS ב- DMEM/F12) לבארות המכילות פתרון ניתוק תאים. שמור על התאים כצברגים על-ידי צנרת למעלה ולמטה בעדינות. ודא שכל התאים מפורקים ומועברים לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
  3. הסר את supernatant ו resuspend גלולה התא במדיום מרווה בתוספת 10 ng/mL של חלבון מורפוגני עצם רקומביננטי אנושי-4 (BMP4), 0.1 מיקרומטר של חומצה ראטינואית כל טרנס (RA), 3 מיקרומטר של מעכב GSK3β מעכב / Wnt activator CHIR99021, ו 10 מיקרומטר של מעכב סלע Y-27632.
  4. בצע ספירת תאים. הוסיפו 2.5 x 105 תאים ל-100 מיקרו-ל' של מטריצת ממברנה קרה במרתף GFR, ערבבו היטב והכניסו טיפה לבאר של צלחת של 12 בארות. לדגור על הצלחת ב 37 °C (30°F) במשך 30-60 דקות כדי לאפשר בינוני כדי פולימר. הוסף 1 מ"ל של מדיה LPC בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632 לכל טוב להבטיח את הירידה הבינונית הוא שקוע לחלוטין דגירה ב 37 °C (50 °F) לילה.
  5. ביום 8, 24 שעות לאחר אינדוקציה LPC, לשנות LPC בינוני כדי להסיר מעכב רוק Y-27632. שנה את מדיום LPC כל יומיים במשך סך של 9-11 ימים.
    הערה: אם המדיום הופך לצהוב בתוך 24 שעות, החלף מדיום מדי יום.
  6. כדי לנתח את יעילות LPC, אשר ביטוי חזק של גורם התמלול התאי NKX2-1 או בצע ציטומטריית זרימה עבור סמני שטח CD47hi / CD26low15 או CPM18 (איור 2c). באופן גס, כדורי LPC צריכים להיות עגולים ושקופים (איור 2c).
    הערה: אין להמשיך עם בידול organoid ריאות אם היעילות של NKX2-1 הוא מתחת 30%.

4.3D אינדוקציה אורנואיד ריאות (יום 16 - 22)

  1. ביום ה-17, מפשירים מטריצת ממברנה במרתף GFR על קרח. שאפו את מדיום האינדוקציה LPC. לאחר מכן להוסיף 2 מיקרוגרם / מ"ל של dispase (1 מ"ל) לבאר resuspend תערובת בינונית / dispase עם פיפטה P1000. דגירה ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות. טריטוריאטים שוב את התערובת ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות.
  2. מעבירים את הדיספאז והתאים לצינור צנטריפוגה חרוט של 15 מ"ל. השתמש PBS צונן (2-3 מ"ל) כדי לשטוף את הבאר resuspend תערובת dispase / תא. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם. הסר באופן ידני את supernatant, נזהר לא לדחס את שכבת גלולה בינונית / תא. חזור על שטיפת PBS צוננת, וצנטריפוגה צינור צנטריפוגה חרוטית עוד 5 דקות ב 400 x גרם.
  3. הסר באופן ידני את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של פתרון דיסוציאציה מבוסס טריפסין לצינור צנטריפוגה חרוט. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 12 דקות.
  4. לאחר הדגירה, resuspend תאים עם קצה פיפטה P1000. לאחר מכן להוסיף נפח שווה של מדיה מרווה לצינור צנטריפוגה חרוט ולסובב למטה ב 400 x g במשך 5 דקות. שאפו את תאי supernatant ו resuspend במדיום מרווה + 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632.
    הערה: אינדוקציה אורגנויד ריאות מוצלחת מתרחשת כאשר תאים מוטבעים כצברגים, לא תאים בודדים, להתאים pipetting בהתאם.
  5. בצע ספירת תאים. חשב את אמצעי האחסון הדרוש כדי להשיג 5.0-8.0 x 104 תאים לבאר. Aliquot תא LPC מצטבר לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x g. הסר עודף supernatant, נזהר לא להתסיס את גלולה התא. השאירו רק 10 μL של מדיה שיורית.
  6. להשעות מחדש את גלולה התא ב 200 μL של מטריצת ממברנה GFR-מרתף קר ולהוסיף מוסיף קרום תרבית התא (קוטר 6.5 מ"מ, 0.4 מיקרומטר נקבובית, קרום פוליאסטר). לדגור על הצלחת ב 37 °C (30-60 דקות) כדי לאפשר מטריצת ממברנה GFR-מרתף בינוני כדי פולימר.
  7. הוסף 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה אורגנויד 3D (טבלה 1) בתוספת גורם גדילה פיברובלסט-7 (FGF7) (10 ננוגרם / מ"ל), FGF10 (10 ng/ mL), מעכב GSK3β / Wnt activator CHIR (3 מיקרומטר), גורם גדילה אפידרמלי (EGF) (10 ננוגרם / מ"ל), ו 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632 לתא basolateral של תוספת הממברנה. לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים.

5.3D הסתעפות אורנואיד ריאות (יום 23 - 28)

  1. ביום 23 שינוי בינוני הסתעפות 3D (טבלה 1) בתוספת FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021 (3 מיקרומטר), RA (0.1 μM), EGF (10 ננוגרם / מ"ל), ומקדם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) / גורם גדילה שלייתי (PlGF) (10 ננוגרם / מ"ל). לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים.
    הערה: ביום 6 של בידול הסתעפות תלת-ממדית, אמורים להיות מספר אורגניואידים מסועפים (איור 2).

6.3D התבגרות אורגנויד ריאות (יום 29 - 34)

  1. ביום 29, לשנות למדיום התבגרות 3D (טבלה 1), אשר זהה 3D הסתעפות בינוני אבל עם תוספת של dexamethasone (50 ננומטר), cAMP (100 מיקרומטר) ו 3-איזובוטיל-1-מתילקסנתין (IBMX), מעכב פוספודיסטראז המכונה גם איזובוטילקסנתין (100 מיקרומטר). לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים.
    הערה: בתוך 24 שעות לאחר ההתבגרות 3D, organoids המסתעף צריך להרחיב ולשנות לספירות שקופות.

7.3D אימונוציטוכימיה של אורגנואיד ריאות

  1. לניתוח אורגנויד ריאות שלם תלת-ממדי, תקן מטריצת ממברנה במרתף GFR בתוספת הממברנה עם 4% paraformaldehyde (PFA) עבור 1 שעות ב 4 °C (7 °F). הטמע בשעווה פרפין והרכב על שקופיות לפי פרוטוקולים סטנדרטיים שפורסמו.
  2. בצע אחזור אנטיגן לפני הכתם. סמני דרכי הנשימה כוללים KRT5, MUC5AC ו- SCGB3A2. סמנים משועים כוללים SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 ו-HOPX (איור 3).

8. הסרת אורגנוידים שלמים של ריאות ממטריצת ממברנה במרתף GFR למדיום למעבר, FACS או cryopreservation

  1. כדי לנתק את האורגנוידים ממדיום מטריצת הממברנה במרתף GFR, הסר מדיה מתא הבזל והוסף 2 מיקרוגרם /מ"ל של dispase (1 מ"ל) בתא האפיטל.
  2. טריטוריאטים בעדינות את התערובת הבינונית/דיספאזה עם פיפטה P1000 ומניחים באינקובטור למשך 15 דקות. טריטוריה בעדינות את התערובת שוב ודגרה במשך 15 דקות נוספות.
  3. הוסיפו 1 מ"ל של PBS צונן (4 °C) והעבירו אורגנוידים עם המדיום של המטריצה לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. ספין ב 400 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant בזהירות, לא להפריע גלולה התא.
  4. לשטוף שוב עם 1 מ"ל מצונן PBS ולסובב למטה ב 400 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant בזהירות, לא להפריע תערובת בינוני / תא.
  5. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לצינור הצנטריפוגה החרוט, תמזגו בעדינות את מטריצת הממברנה GFR-Basement בתערובת בינונית/תאים. מניחים באינקובטור למשך 12 דקות עבור העברת תאים כצבירים או עבור שימור קריופאורציה), או 20 דקות עבור השעיית תא בודד.
  6. הוסף נפח שווה של מדיה מרווה וסיבוב כלפי מטה ב- 400 x g למשך 5 דקות. Resuspend בינוני מרווה + 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632.
    הערה: בשלב זה, אין מדיום קרום מרתף שיורית צריך להיראות בצינור. אם נשאר מדיום שיורית, חזור על שלבים 8.5 ו- 8.6.
  7. בצע ספירת תאים. חשב את אמצעי האחסון הדרוש עבור יישומים במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

24 שעות לאחר ה ציפוי, יום 1, iPSCs צריך להיות 50%-90% מפגש. ביום 2, DE צריך להיות 90%-95% confluent. במהלך אינדוקציה של DE, מקובל לצפות במוות תאים משמעותי ביום 4, אך תאים מחוברים ישמרו על מורפולוגיה קומפקטית מרוצפת אבן (איור 2b). הפסק את הבידול אם רוב התאים החסידים מתנתקים ושוקל לקצר את החשיפה למדיית DE באמצעות activin A ב-6-12 שעות. במהלך אינדוקציה AFE, מוות תאים הוא מינימלי, ותאים להישאר דבקים, אבל ייראה קטן יותר והטרוגני יותר. העברת התאים ביום 7 חייבת להיעשות רק אם התשואה של SOX2 חיובי כפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההבחנה המוצלחת של אורגנוידים של ריאות שלמים תלת-ממדיים (WLO) מסתמכת על פרוטוקול רב-שלבי בן 6 שבועות עם תשומת לב לפרטים, כולל זמן חשיפה לגורמי גדילה ומולקולות קטנות, צפיפות תאית לאחר המעבר ואיכות hiPSCs. לפתרון בעיות, ראה טבלה 2. hiPSCs צריך להיות כ 70%-80% confluent, עם פחות מ 5% בידול ספונטני לפני ניתוק. פרוטוקול זה קורא למדיום "mTeSR plus"; עם זאת, מדיום "mTeSR" רגיל שימש גם עם תוצאות דומות והוא פחות יקר. עבור המטריצה החוץ-תאית, אנו משתמשים במדיום מטריצת הממברנה במרתף GFR. אנו מעבר hiPSCs באמצעות ReLes...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<תרבית תאים חזקה>
12 צלחות בארקורנינג3512
תוספות 12 בארות, 0.4um, שקוףVWR10769-208
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
חומצה אסקורביתסיגמאA4544
B27 ללא חומצה רטינואיתThermoFisher12587010
אלבומין סרום בקר (BSA) Fraction V, תמיסה 7.5%Gibco15260-037
DispaseStemCellTech7913
DMEM/F12Gibco10565042
FBSGibco10082139
GlutamaxLife טכנולוגיות35050061
חזיר' s F12Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium (IMDM) + GlutamaxInvitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
MonothioglycerolSigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/מארז)StemCell Tech5825
N2ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
עט/סטרפטוקוקוסLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + GlutamaxLife Technologies12633012
TrypLEGibco12605-028
Y-27632 (מעכב סלעים)R& D Systems1254/1
Growth Factors/Small Molecules
Activin AR& D Systems338-AC
חומצה רטינואית All-trans (RA)Sigma-AldrichR2625
BMP4R& D Systems314-BP/CF
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CHIR99021Abcamab120890
DexamethasoneSigma-AldrichD4902
DorsomorphinR& די סיסטמס3093
EGFמו"פ D Systems236-EG
FGF10מו"פ D Systems345-FG/CF
FGF7מו"פ D Systems251-KG/CF
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
SB431542מו"פ D Systems1614
VEGF/PIGFמו"פ D Systems297-VP/CF
strong>נוגדנים ראשוניים<חזק>קצב דילול
CXCR4-PER& D SystemsFAB170P1:200 (F)
HOPXSanta Cruz Biotechsc-3987030.180555556
HTII-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2800.145833333
KRT5Abcamab526350.180555556
NKX2-1Abcamab760130.25
NKX2-1-APCLS-BIOLS-C2644371:1000 (F)
proSPCAbcamab408710.215277778
SCGB3A2Abcamab1818530.25
SOX2InvitrogenMA1-0140.180555556
SOX9R& D SystemsAF30750.180555556
SPB (בוגר)7 Hills486041: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (mature)LS BioLS-B91611:100 (F); 1:500 (W) a
<

מקורות

  1. Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
  2. Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
  3. Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36(2016).
  4. Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
  5. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  6. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  7. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  8. Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
  9. Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
  10. Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
  11. Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
  12. Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
  13. Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
  14. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  15. Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
  16. McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51(2018).
  17. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
  18. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
  19. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  20. Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
  21. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  22. Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  23. Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
  24. McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
  25. Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
  26. Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).
  27. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  28. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
  29. McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
  30. Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).
  31. Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
  32. Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.